3.3 Metode Penelitian
3.3.3 Pembuatan preparat histologi
Menurut Angka et al. (1990), pembuatan preparat histopatologi terdiri dari tiga tahapan besar yaitu fiksasi jaringan dan parafinisasi, pemotongan jaringan, serta pewarnaan jaringan (Lampiran 2).
(1) Fiksasi jaringan dan parafinisasi (a) Fiksasi
Fiksasi adalah tahapan yang dilakukan untuk mencegah autolisis dan dekomposisi postmortem dari suatu jaringan atau organ. Fiksasi juga bertujuan untuk mengawetkan morfologi dan komposisi jaringan sehingga jaringan tetap seperti pada keadaan semula sewaktu hidup juga mengeraskan jaringan agar dapat diiris serta mencegah jaringan larut selama proses pembuatan preparat. Larutan fiksatif yang digunakan adalah larutan BNF 10%. Jaringan direndam dalam larutan fiksatif ini selama 48 jam. Perendaman dilakukan di dalam botol film dengan volume larutan fiksatif sebanyak 15-20 kali volume jaringan.
(b) Dehidrasi
Dehidrasi merupakan proses untuk mengeluarkan cairan dari dalam sel dengan cara merendam jaringan yang telah difiksasi ke dalam alkohol dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Pertama jaringan direndam dalam alkohol 70% selama 24 jam. Perendaman dilakukan dalam botol film yang telah digunakan untuk perendaman dengan larutan fiksatif. Larutan fiksatif dibuang terlebih dahulu, kemudian alkohol dengan konsentrasi 70% dimasukkan ke dalam botol film hingga jaringan terendam. Selanjutnya organ diambil dari botol film dan dibungkus menggunakan kain kasa. Kemudian kain kasa diikat menggunakan benang yang dibentuk seperti teh celup agar memudahkan dalam proses pergantian alkohol. Setelah 24 jam, organ yang dibungkus kain kasa diambil dan
ditiriskan diatas kertas tisu. Kemudian organ tersebut dimasukkan ke dalam botol berisi alkohol 80%, 90%, 95%, 95% masing-masing selama dua jam dan alkohol 100% selama 12 jam dengan cara yang sama. Perendaman dilakukan pada suhu ruang.
(c) Clearing
Clearing merupakan proses penjernihan yang bertujuan untuk menggantikan alkohol dan sekaligus menambahkan clearing agent (xylol) yang berfungsi sebagai pelarut parafin. Jaringan direndam dalam alkohol-xylol (1:1) selama 30 menit. Perendaman dilakukan sama halnya seperti pada perendaman dengan alkohol pada suhu ruang.
(d) Impregnasi
Selanjutnya dilakukan tahap impregnasi, yaitu penggantian xylol dengan parafin cair yang berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 oC. Proses ini dilakukan dengan perendaman jaringan ke dalam xylol-parafin (1:1) yang diletakkan dalam gelas piala selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya.
(e) Embedding
Embedding merupakan proses untuk memasukkan parafin cair ke dalam sel. Proses ini berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 oC. Titik cair parafin, yaitu 54 oC-58 oC. Proses ini bertujuan agar parafin menyusup ke dalam seluruh celah antar sel dan bahkan ke dalam sel sehingga jaringan lebih tahan saat pemotongan. Jaringan direndam secara berturut-turut ke dalam gelas piala yang berisi parafin I, parafin II, parafin III masing-masing selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya.
(f) Blocking
Jaringan yang telah dilakukan proses embedding menggunakan parafin cair lalu diblok (dicetak agar mudah dipotong) dengan parafin cair, kemudian dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku, seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit membeku. Setelah itu, jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi
parafin cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan beku dalam suhu ruang selama 24 jam.
(g) Trimming
Setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin dikeluarkan dari cetakan lalu ditrimming menggunakan silet bermata satu agar dapat disesuaikan dengan tempat blok pada alat pemotong.
(2) Pemotongan jaringan
Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan mikrotom. Ketebalan sayatan, yaitu 4 mikrometer. Teknik pemotongan parafin yang menggandung preparat adalah sebagai berikut:
(a) Blok parafin yang mengandung preparat diletakkan pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat. Mata pisau mikrotom harus tajam agar proses pemotongan dapat dilakukan dengan sempurna.
(b) Ketebalan potongan diatur dengan cara menggeser bagian pengatur ketebalan hingga ketebalan yang diinginkan. Ketebalan sayatan, yaitu 4 mikrometer. (c) Blok preparat digarakkan ke arah pisau sedekat mungkin lalu blok preparat
dipotong secara teratur dan ritmis. Pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan dibuang hingga diperoleh potongan yang mengandung preparat jaringan. (d) Hasil irisan diambil dengan jarum lalu diletakkan di permukaan air hangat
dalam 45-50 oC waterbath hingga mengembang.
(e) Setelah pita parafin terkembang dengan baik, pita parafin ditempelkan pada gelas obyek yang telah diberi zat perekat seperti albumin dengan cara memasukkan kaca obyek itu ke dalam waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Setelah merekat, gelas obyek digerakkan keluar dari
waterbath dengan hati-hati dan dibiarkan hingga mengering. (3) Pewarnaan jaringan
(a) Dewaxing
Sebelum dilakukan dewaxing, gelas obyek yang berisi jaringan diletakkan dalam keranjang preparat yang ukurannya sesuai dengan gelas obyek. Keranjang tersebut dapat diisi dengan 10 gelas obyek. Dewaxing merupakan proses untuk
mengeluarkan parafin. Wadah perendaman berupa wadah berbentuk persegi panjang dengan ukurannya sesuai dengan keranjang untuk gelas obyek. Jaringan pada gelas obyek yang telah diletakkan dalam keranjang direndam ke dalam xylol 1 dan xylol II masing-masing 2 menit. Lilin akan terlepas dari jaringan dan jaringan akan tampak jernih.
(b) Hidrasi
Hidrasi merupakan proses pemasukan air ke dalam preparat jaringan pada gelas obyek setelah proses dewaxing. Jaringan pada gelas obyek yang sebelumnya telah melalui proses dewaxing kemudian direndam dalam alkohol 100% dalam wadah perendaman, seperti pada proses dewaxing sebanyak dua kali, lalu secara berturut-turut dimasukkan ke dalam alkohol 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50% masing-masing selama dua menit dengan cara yang sama pula. Setelah itu, preparat jaringan direndam ke dalam akuades selama dua menit.
(c) Pewarnaan hemaktosilin-eosin
Setelah hidrasi, preparat jaringan diberi pewarna hemaktosilin-eosin. Pertama, preparat jaringan direndam dengan pewarnaan hemaktosilin selama 7 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 7 menit untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang tidak diserap. Selanjutnya preparat jaringan direndam dengan pewarna eosin selama 3 menit dan dicuci dengan akuades.
(d) Dehidrasi
Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 70%, 85%, 90%, dan 100% masing-masing dilakukan selama dua menit. Selanjutnya preparat jaringan direndam dalam xylol I dan xylol II masing-masing selama dua menit. Alat dan proses perendaman yang dilakukan sama seperti proses perendaman sebelumnya. (e) Mounting
Preparat jaringan yang telah diwarnai dapat dibuat preparat yang lebih awet dengan cara mounting menggunakan mounting agent atau Canada Balsam. Preparat jaringan ditutup dengan gelas penutup dan dikeringkan selama 24 jam, kemudian diamati dibawah mikroskop.
