Phosphate buffered saline
NaCl 8,0 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,2 g
Dilarutkan dalam 1000 ml akuadest. Autoclave pada tekanan 15 lbs selama 15 menit, pH akhir pada kisaran 7,2 – 7,4.
Buffer reservoir
Glisin 0,192 M 28,8 g
Tris buffer 0,025 M 6 g
0,1% w/v sos
Semua bahan dicampur, diukur sampai pH 8,3 dan ditambahkan 2 g SDS, volume akhir 2 liter, dan disaring.
Buffer gel pemisah
SDS 1 g
Tris buffer 1,4 M 45,5 g
HCl samapai pH 8,8
Akuades sampai volumenya menjadi 250 ml.
Buffer gel pengumpul
Tris buffer 1,4 M 15,1 g
SDS 1 g
Buffer sampel
Mercaptoethanol 2 ml
Glycerol 4 ml
Tris buffer 0,3 g
Bromfenol blue 2 ml
Semua bahan dicampur, dilarutkan ke dalam akuades kurang dari 20 ml, pH 6,8 dan ditambahkan dengan 0,92 g SDS mencapai volume 20 ml, disaring.
Larutan pewarna
Coomassie brilliant blue R 250 0,32 g
Methanol 125 ml
Asam asetat glasial 25 ml
Akuades 100 ml
Coomassie blue dilarutkan dengan methanol, dan ditambahkan asam asetat glasial dalam akuades.
Larutan pencuci
Methanol 100 ml
Asam asetat 100 ml
Akuades 800 ml
Lampiran 3. Larutan yang digunakan pada uji Bradford
Coomassie brilliant blue G-250 100 mg
Ethanol 95% 50 ml
Asam fosfat 85% 100 ml
Bahan-bahan tersebut diencerkan dengan akuades sampai 1000 ml dan disaring dengan kertas saring.
PENGARUHNYA TERHADAP PERTAHANAN DAN GAMBARAN
HISTOPATOLOGI USUS HALUS AYAM PETELUR
UMMU BALQIS
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Purifikasi dan Karakterisasi Protease dari Ekskretori/Sekretori Stadium L3Ascaridia galli dan Pengaruhnya
Terhadap Pertahanan dan Gambaran Histopatologi Usus Halus Ayam Petelur
adalah karya saya sendiri dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan manapun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Agustus 2007
Ummu Balqis
UMMU BALQIS. Purifikasi dan Karakterisasi Protease dari Ekskretori/Sekretori Stadium L3 Ascaridia galli dan Pengaruhnya Terhadap Pertahanan dan Gambaran
Histopatologi Usus Halus Ayam Petelur. Dibawah bimbingan RISA TIURIA PRIOSOERYANTO, BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO, dan MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO.
Infeksi cacing nematoda parasitik Ascaridia galli berlangsung di dalam usus halus unggas. Penelitian ini dilakukan untuk memurnikan dan menganalisa karakter protease dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli sebagai pemicu pertahanan
mukosa berdasarkan proliferasi dan hiperplasia sel goblet, sel mast mukosa, sel eosinofil pada usus halus ayam petelur. Dosis 6000 L2 diberikan langsung ke dalam
oesofagus 100 ekor ayam, dan tujuh hari kemudian larva yang sudah menetas (L3)
diambil kembali dari dalam usus halus. L3 dikultur secara in vitro dalam medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Ekskretori/sekretori
dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur.
Protease dimurnikan dengan ammunium sulfat, dialisis yang diikuti dengan kromatografi filtrasi gel matriks sephadex G-100. Matriks DEAE sephadex A-50 digunakan untuk pemurnian protease melalui kromatografi anion exchange. Aktivitas protease diuji pada kasein 2%. Aktivitas protease dikaji terhadap sensitivitas inhibitor, temperatur, dan pH. Konsentrasi protein dihitung mengikuti metode Bradford. Berat molekul protease diestimasi melalui sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE).
Ayam diimunisasi dengan dosis 80 μg (dengan aktivitas enzim 0,0098 U/ml pada crude dan 0,877 U/ml pada pure) protease serin hasil ekskresi cacing yang dicampur dengan Fruend Adjuvant Complete. Imunisasi diulang tiga kali dengan dosis 60 μg (dengan aktivitas enzim sebesar 0,0074 U/ml pada crude dan 0,657 U/ml pada pure setiap kali imunisasi) protease serin yang dicampur dengan Freund Adjuvant Incomplete dalam interval waktu satu minggu secara intra muskular. Satu minggu kemudian, ayam ditantang dengan dosis 1000 L2A. galli, dan dinekropsi dua
minggu pascatantang. Respons sel eosinofil, sel goblet dan sel mast mukosa diamati dan dihitung jumlahnya pada usus halus ayam petelur. Larva A. galli yang ditemukan di dalam usus halus dihitung jumlahnya.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim pada fraksi 31 kromatogram filtrasi gel lebih tinggi dibandingkan dengan anion exchange. Stadium L3A. galli melepaskan protease serin yang dihambat oleh PMSF. Temperatur dan pH
optimum enzim berturut-turut 70oC dan 7. Aktivitas dan aktivitas spesifik enzim adalah 0,625 U/ml dan 4x10-3 U/mg. Estimasi berat molekul enzim pada 28 kDa. Imunisasi dapat meningkatkan jumlah sel goblet, sel mast, dan sel eosinofil secara signifikan (P < 0,05). Imunisasi dapat menurunkan secara signifikan jumlah larva yang bertahan di dalam usus halus ayam petelur setelah dua minggu infeksi dosis 1000 L2A. galli. Protease serin dapat memicu pertahanan mukosa terhadap penyakit
parasitik yang disebabkan oleh A. galli.
UMMU BALQIS. Purification and Characterization Protease from Excretory/ Secretory of Ascaridia galli L3 Stage and it’s effect against Defense and Histopathology of Intestine in Laying Hens. Under the guidance of RISA TIURIA PRIOSOERYANTO, BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO, and MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO.
The parasitic nematode Ascaridia galli occurs in the small intestine of the poultry. A study was carried out to purify and characterize protease from exretory/secretory of A. galli L3 stage to trigger mucosal responses based on proliferation and hyperplasia goblet, mucosal mast cells, and eosinophil in laying hens. A. galli L3 were recovered from intestines of 100 heads chickens 7 days after oesophagus inoculation with 6000 L2. L3 recovered in this manner were cultured (5 – 10 ml-1) in flasks containing rosswell park memorial institute (RPMI) 1640 media, pH 6.8, without phenol red. Cultures were incubated at 370C in 5% CO2 and culture fluid was collected after 3 days in culture. Excretory/secretory was prepared from metabolic product of L3 released in culture medium. Protease purified using ammonium sulphate, dialysis and matrix sephadex G-100 gel filtration chromatography. Matrix DEAE sephadex A-50 were used to purified protease by mean of anion exchangechromatography. The protease activity was assayed against casein. Inhibitor sensitivity, temperature, and pH optimum on protease activity were studied. Protein concentration were counted as described in Bradford method. The molecular weight of protease was determined with sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE).
The chickens immunized with 80 µg (with enzyme activity 0,0098 U/ml in crude and 0,877 U/ml in pure)mixed with Fruend Adjuvant Complete and repeated three times with dose of each 60 µg (with enzyme activitity 0,0074 U/ml in crude and 0,657 U/ml in pure of each immunization) protease of A. galli L3mixed with Freund Adjuvant Incomplete with an interval of one week intra muscularly. One week later, the chickens were challenged with 1000 L2 of A. galli, and necrop two weeks post challenged. Goblet, mucosal mast cells, and eosinophil reaction were observed in intestinal of laying hens immunized with the purity of protease. A. galli larvae recovered from intestines were counted.
The result showed that enzyme activity after chromatography gel filtration more highly compared anion exchange. L3 released serine protease which is inhibited by PMSF. Temperature and pH optimum of the enzyme are 70oC and 7, respectively. The enzyme activity and protease specific activity are 0,625 U/ml and 4x10-3 U/mg, the molecular weight is estimate on 28 kDa. Immunization was able to increased significantly (P < 0,05) goblet, mast, and eosinophil cells proliferation on duodenum, jejunum, and ileum. A. galli larvae recovered in intestinal of immunized laying hens were decreased significantly at two weeks post infection of 1000 L2 A. galli. This reseach concluded that the protease was able to trigger mucosal responses against parasitic diseases caused by A. galli.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2007 Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
PENGARUHNYA TERHADAP PERTAHANAN DAN GAMBARAN
HISTOPATOLOGI USUS HALUS AYAM PETELUR
UMMU BALQIS
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Program Studi Sains Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Histopatologi Usus Halus Ayam Petelur
Nama Mahasiswa : UMMU BALQIS
Nomor Pokok : B063040051
Program Studi : SAINS VETERINER
Disetujui : Komisi Pembimbing
Dr. drh. Risa Tiuria Priosoeryanto, MS. Ketua
Dr. drh. Bambang P. Priosoeryanto, MS Prof.Dr. Ir. Maggy Thenawijaya Suhartono Anggota Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Sains Veteriner Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. drh. Bambang P. Priosoeryanto,MS Prof. Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro,MS
Tanggal Ujian: 17 September 2007 Tanggal Lulus:
melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan Disertasi yang berjudul: Purifikasi dan Karakterisasi Protease dari
Ekskretori/Sekretori Stadium L3 Ascaridia galli dan Pengaruhnya Terhadap
Pertahanan dan Gambaran Histopatologi Usus Halus Ayam Petelur.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. drh. Risa Tiuria Priosoeryanto, MS sebagai ketua komisi pembimbing, Dr. drh. Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS dan Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawijaya Suhartono, masing-masing sebagai anggota komisi pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan, dan
dorongan sejak awal penulis mengikuti pendidikan. Penulis menyampaikan terima
kasih kepada Dr. drh. Wiwin Winarsih, MSi. dan drh. Suhardono, MSc., Ph.D., APU. yang bertindak selaku Penguji Luar Komisi yang telah memberikan masukan dan koreksi untuk penyempurnaan karya ini.
Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya disampaikan kepada Dekan Fakultas Kedokteran Hewan, dan Rektor Universitas Syiah Kuala yang telah memberi kesempatan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan program Doktor pada program studi Sains Veteriner Institut Pertanian Bogor. Terima kasih juga disampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Republik Indonesia, dan Pemerintah Daerah Nanggroe Aceh Darussalam yang telah memberikan bantuan beasiswa masing-masing melalui Beasiswa Pendidikan Program Pascasarjana (BPPS) dan Bantuan Beasiswa Nanggroe Aceh Darussalam (BB NAD). Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kementrian Negara Riset dan Teknologi yang telah mendanai penelitian ini melalui Riset Unggulan Terpadu XII. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi- tingginya penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah turut serta membantu dalam penyelenggaraan pendidikan, persiapan, perencanaan, pelaksanaan, dan pengolahan data penelitian serta penulisan Disertasi ini.
Kepada ayahanda Alm. H. Razali Ahmad, ibunda Alm. Hj. Siti Hawa, ayahanda dan ibunda mertua Kamaruzzaman dan Fatimah, saudaraku dr. Muhammad Iqbal, Sp.A., Dr. drh. Muhammmad Hambal dan Muhammad Syaibal, S.Sos, serta kepada kakak dan adik ipar, penulis mengucapkan terima kasih atas segala doa, dukungan dan dorongan semangat yang telah diberikan. Kebanggaan penulis kepada suami tercinta, Dr. drh. Darmawi, MSi. yang senantiasa setia menanamkan kesabaran dan selalu dapat memberi opsi terbaiknya dalam menghadapi setiap masalah. Perhatian dan rasa tanggung jawab yang kakanda curahkan sangat berarti. Terima kasih kepada putra dan putri tersayang, Rahi Abdurrahman dan Rania Samira, yang telah memberikan kesejukan hati dan pengertian sehingga sangat memudahkan penulis menempuh studi.
Penulis menyadari bahwa karya ini masih banyak yang harus disempurnakan. Oleh karena itu, kritik dan saran yang dapat menyempurnakan tulisan ini kiranya dapat disampaikan kepada penulis, semoga Disertasi ini dapat memberikan sumbangan ilmu pengetahuan terutama dalam dunia kedokteran hewan.
Bogor, Agustus 2007 Wassalam,
Ummu Balqis
Penulis dilahirkan di Banda Aceh pada tanggal 13 januari 1970, sebagai anak ketiga dari empat saudara dari pasangan ayahnda Alm. H. Razali Ahmad dan ibunda Alm. Hj. Siti Hawa. Pendidikan sarjana dan profesi dokter hewan ditempuh pada Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala (FKH-UNSYIAH), lulus tahun 1996. Sejak tahun 1998, penulis diangkat sebagai staf pengajar pada FKH- UNSYIAH. Pada tahun 2001, penulis mendapat kesempatan mengikuti pendidikan program Magister pada program studi Sains Veteriner Institut Pertanian Bogor, lulus pada tahun 2003. Pada tahun 2004, penulis melanjutkan pendidikan program Doktor pada program studi dan perguruan tinggi yang sama. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Republik Indonesia melalui Beasiswa Pendidikan Program Pascasarjana (BPPS) dan Bantuan Beasiswa Pemerintah Daerah Nanggroe Aceh Darussalam (BB NAD).
Halaman
HALAMAN PENGESAHAN ……… i
PRAKATA ………. ii
RIWAYAT HIDUP ………... iii
DAFTAR ISI ... iv
DAFTAR TABEL ……….. vii
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... ix PENDAHULUAN ……… . 1 Latar Belakang ………. 1 Tujuan Penelitian ………. 4 Hipotesis ……… 4 Manfaat Penelitian ……… 4 TINJAUAN PUSTAKA ... 5
Cacing Ascaridia galli ... 5
Enzim Protease Pada Eksretori/Sekretori Cacing ... 6
Peranan Sel Goblet Pada Kekebalan Terhadap Cacing ... 9
Peranan Sel Mast Pada Kekebalan Terhadap Cacing ... 10
Peranan Sel Eosinofil Pada Kekebalan Terhadap Cacing ... 10
Struktur Usus Halus Unggas ... 11
DISAIN PENELITIAN ... 13
PURIFIKASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI
STADIUM L3 Ascaridia galli ... 14
Abstrak ... 14
Abstract ... 14
Pendahuluan ... 15
Metode Penelitian ... 16
Kesimpulan ... 27 KARAKTERISASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI
STADIUM L3 Ascaridia galli ... 28
Abstrak ... 28 Abstract ... 28 Pendahuluan ... 29 Metode Penelitian ... 30 Hasil Penelitian ... 34 Pembahasan ... 37 Kesimpulan ... 40
RESPONS PERTAHANAN MUKOSA USUS HALUS AYAM PETELUR YANG DIIMUNISASI DENGAN PROTEASE DAN
DITANTANG DENGAN DOSIS L2Ascaridia galli... 41
Abstrak ... 41 Abstract ... 41 Pendahuluan ... 42 Metode Penelitian ... 43 Hasil Penelitian ... 45 Pembahasan ... 56 Kesimpulan ... 61
GAMBARAN HISTOPATOLOGI USUS HALUS AYAM PETELUR YANG DIIMUNISASI DENGAN PROTEASE DAN DITANTANG
DENGAN DOSIS 1000 L2Ascaridia galli... 62
Abstrak ... 62
Abstract ... 62
Pendahuluan ... 63
Metode Penelitian ... 64
Kesimpulan ... 74 PEMBAHASAN UMUM ………...……… 75 KESIMPULAN UMUM ………. 85 SARAN ……….. 85 DAFTAR PUSTAKA ……….. 86 LAMPIRAN ……… 92 vi
Nomor Halaman
1. Purifikasi protease dari ekskretori/sekretori L3 A. galli dengan gel filtrasi 22
2. Purifikasi protease dari ekskretori/sekretori L3 A. galli dengan
anion exchange ... 24
3. Prosedur pengukuran aktivitas protease mengikuti metode Bergmeyer .... 31
4. Pengaruh inhibitor atau aktivator terhadap aktivitas protease ... 36
5. Rata-rata jumlah sel goblet pada 1000 sel absorbtif usus halus ... 46
6. Rata-rata jumlah sel mast pada 10 VCU mukosa usus halus ... 47
7. Rata-rata jumlah sel eosinofil pada 10 lapang pandang ... 55
8. Rata-rata jumlah L3 yang ditemukan dalam usus halus dua minggu
pascainfeksi ... 56
9. Rata-rata kerapatan villi per mm pada usus halus ayam petelur ... 70
10.Rata-rata luas permukaan villi (mm2) usus halus ... 71
11.Karakteristik protease dari parasit ... 70
Nomor Halaman
1. Aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli pada
buffer dan pH yang berbeda ... 20
2. Optimasi aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli
dengan pengendapan ammunium sulfat ... 21
3. Kromatogram gel filtrasi matriks sephadex G-100 ... 23
4. Kromatogram anion exchange matriks DEAE sephadex A-50 ... 23
5. Pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori
stadium L3 A. galli ... 34
6. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ... 35
7. Visualisasi pita-pita protein ... 36
8. Rata-rata jumlah sel goblet pada 1000 sel absorbtif usus halus ... 46
9. Rata-rata jumlah sel mast pada 10 VCU mukosa usus halus ... 48
10.Proliferasi sel goblet duodenum ... 49
11.Proliferasi sel mast duodenum ... 52
12.Gambaran histopatologi duodenum masing-masing kelompok ayam
percobaan ... 67
13.Rata-rata kerapatan villi per mm pada usus halus ayam petelur ... 70
14.Rata-rata luas permukaan villi (mm2) usus halus ... 71
Nomor Halaman
1. Larutan yang digunakan pada medium RPMI 1640 ... 92
2. Pembuatan Reagen SDS PAGE …..………. 93