BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pembuatan Sediaan Kandidat Vaksin Rotavirus
Dilakukan proses sterilisasi pada alat gelas, vial, dan magnetic stirrer dengan menggunakan autoklaf suhu 121oC selama 15 menit. Mencairkan bulk vaksin beku hasil pemanenan menggunakan water bath, kemudian dimasukkan kedalam gelas beker sebanyak 150 mL. Selanjutnya, virus stabilizer (sukrosa)
magnetic stirrer dengan kecepatan yang konstan dan sesuai sambil dimonitor prosesnya. Sediaan kandidat vaksin yang diperoleh kemudian disterilkan dengan metode filtrasi menggunakan syringe filter ukuran 0,22 µm (PATH, 2006; Sultana, 2007).
Sambil terus dilakukan homogenisasi, larutan sediaan kandidat vaksin rotavirus yang sudah disterilkan kemudian dimasukkan ke dalam vial sebanyak 77 buah dengan kandungan vaksin tiap vial adalah 1 mL, dimana 75 vial nantinya akan digunakan untuk pengujian tahap selanjutnya, 2 vial digunakan untuk evaluasi sterilitas, dan 3 vial digunakan untuk evaluasi potensi (kandungan). Seluruh pekerjaan tersebut dilakukan di dalam laminar air flow cabinet dengan bantuan TSA (Tryptone Soy Agar) sebagai indikator sterilitas environment (PATH, 2006).
3.4.2 Variasi Perlakuan Teknik Freezing dan Suhu Penyimpanan pada Sediaan Kandidat Vaksin
Tabel 3.1 Desain perlakuan pada kandidat vaksin rotavirus
No Kode
Perlakuan
Teknik Freezing Suhu Penyimpanan -70oC LN -152oC 2-8oC -20oC -70oC 1 F1 Immunofluorescence Assay (Uji Potensi)
2 F1T1 √ - - √ - -
3 F1T2 √ - - - √ -
4 F1T3 √ - - - - √
5 F2 Immunofluorescence Assay (Uji Potensi)
6 F2T1 - √ - √ - -
7 F2T2 - √ - - √ -
8 F2T3 - √ - - - √
9 F3 Immunofluorescence Assay (Uji Potensi)
10 F3T1 - - √ √ - -
11 F3T2 - - √ - √ -
Sebanyak 75 vial sediaan kandidat vaksin rotavirus yang berhasil dibuat kemudian dibekukan dengan tiga teknik yang berbeda, yakni dibekukan hingga suhu -70oC (rapid freezing) menggunakan freezer, suhu -152oC (slow freezing) menggunakan ultra-low freezer, dan dengan nitrogen cair (very rapid freezing) menggunakan tanki nitrogen cair, masing-masing 24 vial. Dari 24 vial pada tiap teknik tersebut kemudian dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan perlakuan suhu penyimpanan yang berbeda, yakni 8 vial disimpan pada kulkas bersuhu 2 – 8oC, 8 vial pada freezer suhu -20oC, dan 8 vial terakhir pada freezer suhu -70oC (Huynh- Ba dan Zahn, 2009; PT Biofarma).
3.4.3 Evaluasi Sediaan 1. Uji Fisik
Sediaan kandidat vaksin yang sudah dibekukan kemudian dicairkan dengan water bath, lalu diuji secara visual meliputi pengamatan volume, warna, kandungan partikel asing, dan homogenitasnya (BBPMSOH, 2005).
2. Uji Sterilitas
Sampel vaksin sebelum dilakukan freezing diinokulasikan ke dalam 2 tabung reaksi yang masing-masing tabung tersebut berisi media FTM (Fluid Thioglycolate Medium) steril dan SCDM (Soybean Casein Digest Medium) steril, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC. Kedua tabung tersebut disimpan selama 14 hari, kemudian diamati untuk melihat ada tidaknya pertumbuhan mikroorganisme (kekeruhan, endapan, atau tanda-tanda pertumbuhan mikroorganisme) (BBPMSOH, 2005; McGuire dan Kupiec, 2007).
3. Uji Potensi (Kandungan)
Sampel vaksin yang sudah dibuat sebanyak 3 vial dilakukan uji immunofluorescence assay untuk mencari konsentrasi rotavirus dalam vaksin tersebut, sebagai data pembanding awal sebelum dilakukan freezing dan suhu penyimpanan (triplo). Prosedur immunofluorescence assay dijelaskan pada poin 3.4.4.
3.4.4 Uji Stabilitas Potensi Kandidat Vaksin Rotavirus Selama Penyimpanan Menggunakan Immunofluorescence Assay
1. Penyiapan dan Pemeliharaan Subkultur Sel MA 104
Tahap awal pemeliharaan sel MA 104 dimulai dari proses resusitasi sel dengan penyiapan dan pembuatan media pertumbuhan sel dengan mencampurkan DMEM dengan FBS, NaHCO3, dan antibiotik kemudian
diaduk hingga homogen. Setelah media pertumbuhan selesai dibuat, media tersebut kemudian didistribusikan ke dalam T-flasks. Sel MA 104 beku yang akan digunakan lalu dicairkan dengan menggunakan ice bath dan setelah cair dimasukkan ke dalam T-flasks yang berisi medium. Dilakukan observasi sel menggunakan mikroskop untuk memastikan keadaan sel dan dilakukan inkubasi dengan inkubator CO2 pada suhu 37oC sampai mengalami konfluen.
Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptis menggunakan LAF (Freshney, 2005).
Setelah sel sudah mengalami konfluen, dilakukan tahap subkultur sel (pasase) dimana medium pertumbuhan sel dikeluarkan dari T-flasks kemudian sel dicuci dengan menggunakan PBS. Setelah dicuci, kemudian dilakukan penambahan tripsin dan diinkubasi selama 5-8 menit. Setelah selesai diinkubasi, tarik kembali seluruh tripsin menggunakan pipet mikro sehingga diperoleh suspensi sel dalam T-flasks tersebut (Freshney, 2005).
Dilakukan penghitungan sel dengan menggunakan hemocytometer. Suspensi diaduk hingga terdispersi ke seluruh sel, dan diambil 0,2 mL sebagai sampel ke dalam vial. Kemudian dilakukan preparasi slide dimulai dengan membersihkan permukaan slide dan coverslip dengan alkohol 70% kemudian coverslip dipasang pada slide. Sampel sel yang diperoleh sebelumnya diaduk, kemudian diambil sebanyak 20 µL menggunakan mikro pipet steril dan dimasukkan ke dalam tepi slide hemocytometer. Ditambahkan pula 60 µL trypan blue sebagai pewarna sel ke dalam tepi tersebut. Setelah didiamkan beberapa saat, slide tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop perbesaran lensa objektif 10x. Dari pengamatan mikroskop dapat terlihat 9 kotak berukuran 1 mm2 yang di dalamnya masih terdapat kotak dengan berbagai ukuran yang berpengaruh pada rumus perhitungan sel nantinya. Jika
sel yang terlihat sedikit (<100/mm2), maka dilakukan penghitungan sel pada satu atau lebih kotak berukuran 1 mm2 di sekeliling kotak tengah, tapi jika sel yang terlihat terlalu banyak (>1000/mm2), maka dilakukan penghitungan sel pada lima kotak kecil dengan arah diagonal dari kotak besar (1 mm2) (Freshney, 2005).
Hasil subkultur yang baik dapat diketahui bila nilai persen
viabilitasnya tinggi (≥ 90%). Persen viabilitas dapat diperoleh menggunakan rumus:
………(γ.1) Perhitungan densitas sel dapat dilakukan dengan rumus:
………...(γ.2) Lambang c (sel/mL) adalah konsentrasi sel (densitas sel), n adalah nilai rata- rata jumlah sel hidup yang dihitung dalam x kotak, dan v adalah volume yang dihitung. Nilai v pada kotak besar (1 mm2) adalah 0,1 mm3 atau 1 x 10-4 mL, pada kotak sedang (25 kotak pada tiap 1 kotak besar) adalah 1/5 dari total atau 1/5 x 10-4 mL, dan pada kotak kecil (16 kotak pada tiap 1 kotak sedang) adalah 9 x 10-4 mL. Rumus tersebut ditambahkan dengan faktor pengenceran, apabila ditambahkan pewarna (Freshney, 2005).
Cara pengambilan sel MA 104 untuk pengujian akan dijelaskan di nomor berikutnya. Untuk proses pemeliharaan sel MA 104, dilakukan kembali proses pasase. Namun sebelum masuk ke dalam proses tersebut, dilakukan preparasi terlebih dahulu dengan menghitung jumlah suspensi dan media yang akan dimasukkan ke dalam wadah kultur, dalam hal ini menggunakan T-flasks ukuran luas 25 cm2, sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan. Spesifikasi alat T-flasks ini dapat memuat medium kurang lebih 10 mL. Konsentrasi sel dalam seeding yang diinginkan adalah 5 x 105 sel. Perhitungan jumlah suspensi dilakukan dengan menggunakan rumus pengenceran:
……….(γ.γ)
Jumlah media didapatkan dari 10 mL (media yang dapat ditampung T- flasks) dikurang jumlah suspensi yang digunakan. Setelah itu, dilakukan
baru dilakukan proses pasase kembali. Hal ini dilakukan rutin selama penelitian untuk memperoleh sel MA 104 sebagai bahan untuk prosedur penelitian selanjutnya (Freshney, 2005).
2. Plating Sel MA 104 Menggunakan Plate 96 Well
Suspensi sel MA 104 dibuat untuk 96 well dengan konsentrasi 2,5 x 104 sel dalam media pertumbuhan sel sebanyak 100 µL tiap satu well. Well tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37oC dalam inkubator CO2. Setelah
24 jam inkubasi, sel tersebut telah mengalami konfluen dan dilakukan tahap berikutnya. Perhitungan jumlah mL sel dan media pertumbuhan sel diperoleh dari rumus:
………(γ.4) Volume sel yang diperoleh dari hasil perhitungan kemudian diencerkan dengan media sesuai dengan keinginan dan spesifikasi muatan plate (Freshney, 2005; Patton, et al., 2000; dengan modifikasi).
3. Pengenceran Virus
Dengan menggunakan plate 96 well yang berbeda, media pertumbuhan virus (media pertumbuhan sel tanpa FBS) yang sudah mengandung tripsin ditambahkan ke dalam tiap well sebanyak 50 µL. Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara memasukkan sampel kandidat vaksin rotavirus sebanyak 50 µL kedalam well nomor 1. Kemudian terus dilakukan pengenceran dengan cara mengambil 50 µL dari well nomor 1 dan dipindahkan ke well nomor 2, seterusnya sampai well nomor 11 menggunakan pipet mikro multi-channel. Well nomor 12 dibiarkan kosong (hanya berisi media pertumbuhan) sebagai kontrol negatif. Sebagai kontrol positif digunakan biakan rotavirus.
4. Inokulasi Vaksin (Virus yang Terkandung) ke Sel Monolayer
Plate 96 well MA 104 dicuci dengan PBS kemudian ditambahkan media pertumbuhan virus sebanyak 50 µL lalu diinkubasi selama 30 menit.
Setelah selesai diinkubasi, dipindahkan sebanyak 50 µL dari plate well titrasi (pengenceran) ke plate well sel MA 104 sesuai dengan nomor well-nya dan ditambahkan 50 µL media pertumbuhan virus. Plate 96 well sel MA 104 ini kemudian diinkubasi menggunakan inkubator CO2 selama 18 jam suhu 37oC
(Saif dan Ward, 2000; dengan modifikasi).
5. Pengamatan Mikroskop Fluorescent
Setelah plate 96 well sel MA 104 selesai diinkubasi, medium yang terdapat pada tiap well dibuang menggunakan penyedot vakum, kemudian dilakukan fiksasi dengan menggunakan aseton 80% sebanyak 150 µL selama 10 menit. Setelah plate difiksasi, aseton dibuang dan plate dikering-anginkan. Plate well tersebut ditambahkan 50 µL antiserum poliklonal rabbit anti SA 11 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah itu, well 96 dicuci dengan PBS lalu ditambahkan 50 µL antiserum IgG goat anti rabbit kedalamnya dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Plate 96 well kemudian dicuci kembali dengan PBS, lalu setiap well diamati dan dihitung sel yang memancarkan fluoresence satu per satu dibawah mikroskop fluorescent. Setelah dilakukan penghitungan sel, dapat dilakukan kalkulasi konsentrasi dari suspensi virus awal tersebut dalam satuan FCFU/mL. Perhitungan dapat dilakukan dengan menggunakan rumus:
⁄ …………(γ.5)
Pengujian stabilitas potensi ini dilakukan duplo pada kandidat vaksin rotavirus setelah penyimpanan hari ke-42, 60, 90, dan 120 pada setiap perlakuan teknik freezing (Freshney, 2005; Saif dan Ward, 2000; dengan modifikasi).
3.4.5 Metode Analisis Data
Pengujian stabilitas potensi dilakukan dengan dua kali pengulangan (duplo) dan diolah secara statistika menggunakan metode rancangan acak lengkap faktorial dan dianalisis melalui ANOVA. Pengolahan data yang diperoleh dari hasil eksperimental murni ini dilakukan berdasarkan prinsip-prinsip Quality by
freezing dan suhu penyimpanan yang tepat dari beberapa desain percobaan yang dilakukan.