BAB III METODE PENELITIAN
3.3 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar sari larut etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut asam (Depkes RI, 1980).
3.3.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati warna, bentuk, ukuran dan tekstur dari bahan tanaman segar dan simplisia.
3.3.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun sambiloto segar dan daun salam segar, serbuk simplisia herba sambiloto dan daun salam. Pemeriksaan mikroskopik sampel segar dilakukan sebagai berikut: dibuat irisan melintang dan membujur yang tipis. Hasil masing-masing irisan diletakkan di atas kaca objek lalu ditetesi larutan kloralhidrat, ditutup dengan kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop pada berbagai perbesaran. Pemeriksaan mikroskopik untuk serbuk simplisia dilakukan sebagai berikut: ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.3.3 Penetapan kadar air
28
Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik.
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu ditambahkan 2 ml air suling, kemudian dipasang alat penampung dan pendingin dan dilakukan destilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
b. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam labu berisi toluen yang telah dijenuhkan, kemudian labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan toluen diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik, setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar, setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1998).
3.3.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml) dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrate sampai kering dalam cawan penguap
29
yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1980).
3.3.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95% dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1980).
3.3.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porcelin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600oC selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1980).
3.3.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan (Depkes RI, 1980).
30
3.4 Pembuatan Ekstrak
3.4.1 Pembuatan ekstrak herba sambiloto
Pembuatan ekstrak herba sambiloto dilakukan dengan cara perkolasi. Serbuk simplisia herba sambiloto 900 g dimasukkan kedalam bejana tertutup, ditambahkan etanol 50% sehingga semua simplisia terendam, aduk- aduk dan diamkan selama 3 jam. Dipindahkan sedikit demi sedikit kedalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, tuangkan cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator, biarkan selama 24 jam, buka kran perkolator. Dibiarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, tambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia. Perkolasi dihentikan jika 500 mg perkolat terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa, selanjutnya ekstrak cair dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator sehingga didapat ekstrak kental (Depkes RIa, 2000).
3.4.2 Pembuatan ekstrak daun salam
Pembuatan ekstrak daun salam dilakukan dengan cara perkolasi. Serbuk simplisia daun salam 900 g dimasukkan kedalam bejana tertutup, ditambahkan etanol 70% sehingga semua simplisia terendam, aduk- aduk dan diamkan selama 3 jam. Dipindahkan sedikit demi sedikit kedalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, tuangkan cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator, biarkan selama 24 jam, buka kran perkolator. Dibiarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, tambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia.
31
Perkolasi dihentikan jika 500 mg perkolat terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa, selanjutnya ekstrak cair dipekatkan dengan menggunakan
rotary evaporator sehingga didapat ekstrak kental (Depkes RIa, 2000).
3.5 Pembuatan Sediaan 3.5.1 Formula kapsul
Setiap kapsul mengandung 100 mg ekstrak herba sambiloto dan 100 mg ekstrak daun salam kental, serta bahan pengisi kapsul.
R/ Ekstrak herba sambiloto 100 mg Ekstrak daun salam 100 mg Amilum manihot 10 % Amilum maidis 5 % Laktosa ad 450 mg
3.5.2 Pembuatan sediaan kapsul
a. Pembuatan masa ekstrak herba sambiloto
Dimasukkan sebanyak 200 g ekstrak herba sambiloto ke dalam lumpang dan digerus, lalu ditambahkan sebagian dari 90 g amilum manihot, lalu digerus, ditambahkan sebagian dari 45 g amilum maidis, lalu digerus, ditambahkan laktosa secukupnya. Digerus sampai terbentuk masa yang bisa dikempa.
b. Pembuatan masa ekstrak daun salam
Dimasukkan sebanyak 200 g ekstrak daun salam ke dalam lumpang dan digerus, lalu ditambahkan sisa amilum manihot, lalu digerus, ditambahkan sisa amilum maidis, lalu digerus, ditambahkan laktosa sedikit dan digerus.
c. Pencampuran masa ekstrak herba sambiloto dan daun salam
32
ekstrak daun salam, lalu digerus, ditambahkan laktosa sampai 900 g. Digerus lalu diayak, dikeringkan granul dalam oven dengan suhu 30°C selama 15 menit. Dimasukkan kedalam lumpang, ditambahkan sisa laktosa, dihomogenkan, selanjutnya dimasukkan ke dalam kapsul kosong.
3.5.3 Pengujian pra-formulasi
Pengujian pra-formulasi terhadap granul yang kering meliputi uji waktu
alir dan penetapan sudut diam.
3.5.3.1 Uji waktu alir
Sebanyak 100 gr granul ditimbang dimasukkan kedalam corong alir, ratakan permukaannya, lalu dialirkan hingga seluruh granul mengalir. Dicatat waktu dari granul mengalir sampai seluruh granul mengalir keluar.
Syarat: waktu alir tidak lebih dari 10 detik
3.5.3.2 Pengujian sudut diam
Sebanyak 100 gr granul ditimbang dimasukkan kedalam corong alir yang ditutup bagian bawahnya, ratakan permukaannya. Dibuka penutup corong sehingga granul mengalir bebas. Diukur tinggi dan sudut tumpukan granul yang terbentuk. Dihitung sudut diam granul.
Syarat: Sudut diam granul 30°- 40°
3.5.4 Evaluasi sediaan kapsul uji
Dilakukan evaluasi sediaan kapsul kombinasi ekstrak herba sambiloto dan daun salam sesuai dengan yang tertera pada farmakope Indonesia edisi III meliputi penyimpangan bobot.
3.5.4.1 Penyimpangan bobot
33
keluarkan isi kapsul. Ditimbang berat dan dihitung deviasi dari masing masing isi kapsul terhadap bobot rata-rata.
Syarat: tidak lebih dari satu kapsul mempunyai deviasi diatas 7,5% dan tidak lebih dari dua kapsul yang mempunyai deviasi diatas 15% (Depkes RIa, 1979).
3.6 Uji Klinis Pendahuluan 3.6.1 Tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Kota Medan meliputi Kecamatan Medan Sunggal, Medan Selayang, Medan Maimun dan Percut Sei Tuan.
3.6.2 Waktu penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Desember 2014 sampai Januari 2015.
3.6.3 Desain penelitian
Penelitian ini menggunakan metode uji klinis terbuka (open trial) dengan desain before and after. Pada uji ini, peneliti maupun peserta mengetahui obat yang diberikan (Sastroasmoro dan Ismael, 2013).
3.6.4 Kriteria inklusi dan eksklusi subjek penelitian
Kriteria inklusi subjek penelitian ini adalah: a. pasien laki laki dan perempuan
b. umur 20-60 tahun c. pasien dislipidemia
d. pola makan yang kurang baik seperti banyak makan makanan berlemak, kurang makan buah-buahan dan sayur-sayuran
e. gaya hidup yang kurang baik seperti kurang berolahraga dan sering merokok (khususnya laki-laki)
34 f. dapat melakukan aktivitas sehari hari
g. tidak mengkonsumsi obat penurun kolesterol dalam dua minggu terakhir
h. bersedia ikut dalam penelitian, mengikuti prosedur penelitian dan menanda tangani informed consent.
Kriteria ekslusi subjek penelitian ini adalah : a. wanita hamil, menyusui, nifas
b. ada penyakit komplikasi yang diketahui dari anamnesis c. adanya kebiasaan mengkonsumsi alkohol
d. tidak teratur mengkonsumsi kapsul ekstrak herba sambiloto dan daun salam e. tidak mengikuti kontrol selama penelitian (meninggal, pindah alamat dan
mengundurkan diri).
3.6.5 Teknik pengambilan subyek penelitian
Teknik pengambilan subyek dalam penelitian ini adalah Consecutive
sampling, yaitu semua subyek yang memenuhi kriteria (berdasarkan kriteria
inklusi) dimasukkan dalam penelitian sampai jumlah subyek yang diperlukan terpenuhi (Sastroasmono dan Ismael, 2013). Semua responden diberi penjelasan singkat sebelum diberikan kapsul kombinasi ekstrak herba sambiloto dan daun salam, selanjutnya bagi responden yang setuju mengikuti penelitian menandatangani surat persetujuan mengikuti penelitian.
3.6.6 Jumlah subyek penelitian
Populasi penelitian adalah semua pasien dewasa pria dan wanita dengan dislipidemia. Sampel untuk populasi penelitian didapatkan dari rumus Slovin. Keterangan :
35 � = N 1 + N (0,05)² n = Sampel N = Populasi e = Interval keyakinan (0,05)
Jumlah sampel populasi penelitian minimal 18 orang berdasarkan Rumus Slovin:
Uji klinik pendahuluan ini pertama kalinya formula baru diberikan pada manusia untuk melihat efek farmakologi merupakan uji klinis terbuka dan sederhana, artinya tanpa pembanding dan tidak tersamar, pada sejumlah kecil subyek dengan pengamatan intensif. Total jumlah subyek pada fase ini bervariasi antara 20-50 orang (Setiawati, dkk., 2007), maka pada penelitian ini jumlah subyek yang dibutuhkan minimal 20 orang pasien dislipidemia.
3.6.7 Pemberian sediaan kapsul
Setiap pasien diberikan secara bertahap 84 kapsul kombinasi ekstrak herba sambiloto dan daun salam dosis 3 kali sehari 1 kapsul sesudah makan selama 28 hari.
3.6.8 Tahapan dan cara kerja uji klinis pendahuluan
a. dilakukan pencarian pasien dengan wawancara meliputi pola makan, gaya hidup, pemeriksaan kolesterol yang pernah dilakukan dan riwayat penyakit untuk memperoleh diagnosis dan mengisi kuesioner penelitian
b. dilakukan pemeriksaan vital sign pasien meliputi penimbangan berat badan, tinggi badan dan pemeriksaan tekanan darah. Pengukuran kadar kolesterol menggunakan alat pengukur kadar kolesterol Easy Touch
� = 20
1 + 40 (0,05)²
= 20
36
c. pasien yang memenuhi kriteria sebagai sampel penelitian, akan diberikan informasi menyangkut penggunaan obat tradisional sebelumnya dan pemberian informasi untuk mendapatkan persetujuan (informed consent) tentang kegiatan penelitian, manfaat maupun resiko penelitian
d. setiap pasien mengisi lembar persetujuan penelitian
e. setiap pasien diambil darah sebanyak 3 ml yang dilakukan oleh tenaga analis kesehatan dan pengambilan dilakukan setelah pasien puasa 6-12 jam. Darah diambil sebanyak 3 ml melalui vena mediana cubiti pada lipat siku, terlebih dahulu dibersihkan diatas lokasi tusuk dengan alkohol 70% dan biarkan sampai kering. Dipasang ikatan pembendungan (Torniquet) pada lengan atas dan pasien diminta untuk mengepal dan membuka telapak tangan berulang kali agar vena jelas, vena mediana cubiti ditusuk dengan posisi sudut 45 derajat, kemudian darah disedot mengalir kedalam spuit, torniquet dilepas, lalu jarum ditarik dengan tetap menekan lubang penusukan dengan kapas alkohol dan bekas tusukan ditutup dengan plester. Darah yang diperoleh di sentrifuge membentuk serum kemudian serum digunakan untuk pemeriksaan profil lipid (kadar kolesterol total, trigliserida, LDL dan HDL) dengan metode kolorimetri sebelum penggunaan (H0) sediaan kombinasi ekstrak herba sambiloto dan daun salam. Diberikan secara bertahap dari 84 kapsul sediaan kombinasi ekstrak herba sambiloto dan daun salam untuk penggunaan 3 kali sehari selama 28 hari, selanjutnya pada hari ke-14 dan 28 diambil darah sebanyak 3 ml di sentrifuge lagi membentuk serum kemudian diperiksa kembali profil lipid (kadar kolesterol total, trigliserida, LDL dan HDL) menggunakan metode kolorimetri. Pemeriksaan dilakukan di Laboratorium Kesehatan Daerah, Dinas