BAB V HASIL PENELITIAN
5.3 Pemeriksaan Kimia Klinik Hewan Coba
Pemeriksaan parameter klinik merupakan salah satu cara untuk mengetahui efek dari campuran fdl dan doxorubisin. Parameter meliputi SGOT dan SGPT. Pemeriksaan dilakukan di Laboratorium Kimia Klinik, Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya. Data hasil pemeriksaan tersebut ditampilkan pada tabel berikut:
Tabel V.18 Hasil Pemeriksaan SGOT pada Serum Darah Mencit Coba Kode Normal CMC Kadar SGOT (U/L) FDL DOXO DOX + FDL
1 190 328 131 139 247 2 234 197 203 382 476 3 252 385 375 254 327 4 204 160 770 548 270 5 191 148 467 138 423 6 250 357 467 194 207 Rata- rata 220,17 ± 28,69 262,5 ± 105,96 462.33 ± 287.42 275,83 ± 161,39 293,83 ± 160,45
Gambar 5.7 Histogram Rata-rata Kadar SGOT Mencit pada Setiap
Kelompok Perlakuan
Tabel V.19 Hasil Pemeriksaan SGPT pada Serum Darah Mencit Coba Kode Normal CMC Kadar SGPT (U/L) FDL DOXO DOX +
FDL 1 61 26 26 37 94 2 87 29 89 53 50 3 45 35 38 63 75 4 59 56 132 50 35 5 43 43 305 41 126 6 59 75 91 30 78 Rata- rata 59 ±15,75 44 ± 18,63 ±101.47 114.5 45,67 ± 11,96 76,3 ± 35,99 0 100 200 300 400 500 600 700 800
Rata-rata kadar SGOT (U/I)
normal cmc Fdl Doxo Komb. Dox
Gambar 5.8 Histogram Rata-rata Kadar SGPT Mencit pada Setiap
Kelompok Perlakuan Keterangan
Normal = Kelompok kontrol normal. tanpa induksi kanker fibrosarkoma pada tengkuk dengan benzo(a)pirena
CMC = Kelompok kontrol negatif. diberi larutan CMC-Na 0.5% (14 hari) FDL = Kelompok terapi dengan bahan uji Fraksi DL-S 594.80 mg/kg
BB p.o (14 hari)
Doxo = Kelompok terapi dengan bahan uji Doxorubisin 1.2 mg/kg BB i.p (hari pertama perlakuan)
Doxo + FDL = Kelompok terapi dengan bahan uji Kombinasi Fraksi DL- S 594.80 mg/kg BB p.o (14 hari) + doxorubisin 0,6 mg/kg BB i.p (hari pertama perlakuan).
Kemudian data parameter kimia klinik tersebut dianalisis dengan menggunakan One-Way Anova pada tingkat kepercayaan 95% (α=0,05) dan
0 50 100 150 200 250
Rata-rata Kadar SGPT (U/I)
normal cmc Fdl Doxo Komb. Dox
hasilnya ditunjukkan pada lampiran. Nilai signifikansi masing-masing parameter ditunjukkan pada tabel V.18
Tabel V.20 Nilai Signifikansi Data SGOT dan SGPT Berdasarkan Analisis
dengan One-Way ANOVA
Parameter Kimia Klinis Nilai Signifikansi Keterangan (α=0,05)
SGOT 0,249 > α
SGPT 0,118 > α
Pada data uji SGOT dan SGPT didapatkan nilai signifikansi > α, sehingga Ho diterima dan dapat disimpulkan tidak ada perbedaan yang bermakna antar kelompok perlakuan berdasarkan parameter SGOT dan SGPT.
84
BAB VI
PEMBAHASAN
Sambiloto dan doksorubisin memiliki aktivitas yang sama sebagai antikanker dengan mekanisme kerja yang sama yaitu sebagai inhibitor topoisomerase II (Sukardiman dan Poerwono, 2001; Airley, 2009). Berdasarkan aktivitas dan mekanisme yang sama, maka dapat dimanfaatkan untuk terapi kombinasi yang bertujuan untuk mendapatkan sinergisme dan dapat menurunkan efek samping yang ditimbulkan oleh penggunaan doksorubisin secara tunggal.
Pengaruh pemberian terapi kombinasi pada organ hati, jantung dan ginjal mencit dapat diketahui dengan menggunakan analisa statistik nonparametrik satu arah Kruskal Wallis. Sedangkan ada atau tidaknya perbedaan hambatan pada organ hati, ginjal dan jantung antar kelompok perlakuan diketahui melalui uji pembandingan berganda atau uji Z. Efek dari pemberian terapi didasarkan pada perubahan keadaan histopatologi masing-masing irisan histopatologi yaitu keadaan inti sel, keadaan sitoplasma dan jumlah sel yang mengalami degenerasi dan nekrosis pada masing-masing kelompok perlakuan.
Pada penelitian kali ini digunakan mencit coba yang sebelumnya telah di adaptasikan dengan lingkungannya selama 14 hari setelah itu di bagi menjadi 5 kelompok yang masing-masing mendapatkan perlakuan uji yang berbeda, Untuk dapat melakukan penelitian ini terlebih dahulu harus dilakukan pembuatan sel kanker pada hewan coba mencit. Perlakuan yang diberikan adalah menginduksi pada tengkuk mencit dengan larutan benzo(a)pirena 0,3% (b/v) dalam oleum olivarum (Ekowati et al., 2012) secara subkutan. Induksi benzo(a)pirena dilakukan selama 10 hari setiap 2
hari sekali sebanyak 0,2 ml. Setelah kurang lebih 2 bulan beberapa ekor mencit telah menderita kanker yang cukup besar, selanjutnya dibagi 4 kelompok untuk diberikan perlakuan, yaitu kelompok kontrol negatif CMC- Na, kelompok FDL, Kelompok DOX tunggal dan kelompok DOX- DOX+FDL. Untuk kelompok normal, tidak diinduksikan kanker.
Kelompok kontrol negatif diberikan terapi larutan CMC-Na 0,5% yang dimasukkan menggunakan sonde lambung setiap hari selama 14 hari. Berat badan rata-rata mencit sebesar 30 g dan volume pemberian perlakuan sebesar 0,20 ml. Untuk kelompok FDL larutan uji dibuat dengan cara mensuspensikan fraksi diterpen lakton sambiloto dalam CMC Na 0,5% karena andrografolida tidak larut dalam air. Pada saat pensuspensian dilakukan penggerusan untuk memperkecil ukuran fraksi diterpen lakton. Larutan uji dimasukkan menggunakan sonde lambung karena dengan cara ini larutan uji dapat masuk ke dalam lambung secara efektif. Dosis yang diberikan sesuai dengan berat badan mencit coba. Oleh karena itu, berat bada mencit coba di timbang setiap hari untuk menghitung dosis terapinya.
Dosis sambiloto untuk tiap mencit 594,80 mg/kgBB mencit. Hal ini di dasarkan dari hasil penetapan kadar andrografolida dalam fraksi diterpen lakton sambiloto dengan KLT-Densitometri, diperoleh persentase rata-rata kandungan andrografolida dalam fraksi yaitu 13,45 % ± 0,15 (b/b) (Endarini, 2013). Bedasarkan pada penelitian terdahulu. Dosis doksorubisin yang digunakan untuk pasien adalah 0,6 mg/kg BB mencit (Wang, et al., 2010). Pada kelompok DOX, doxorubisin diinjeksikan secara intraperitonial pada hari pertama terapi, selanjutnya ditunggu selama 14 hari.
Pada kelompok DOX-DOX+FDL, Dosis andrografolida yang digunakan pada mencit adalah 594,80 mg/kgBB mencit. Dosis doksorubisin yang digunakan adalah 0,6 mg/kg BB mencit. Pertama-tama di injeksikan
doxorubisin secara intraperitonial terlebih dahulu selanjutnya diberi suspensi FDL tetapi sebelumnya diberikan jeda waktu selama 30 menit agar doxorubisin sudah mulai di absorpsi di dalam tubuh. Pemberian doxorubisin hanya di hari pertama terapi. Untuk suspensi FDL diberikan setiap hari selama 14 hari.
Pemberian terapi pada masing-masing kelompok perlakuan dilakukan selama 14 hari. Pembedahan dilakukan pada hari ke 15. Semua mencit di korbankan dengan cara pembiusan eter. Pengambilan darah melalui intrakardial agar didapatkan darah yang cukup banyak dan di ambil organ hati, ginjal dan jantungnya yag selanjutnya akan dibuat preparat histopatologi. Darah yang diambil dianalisis aktivitas enzim SGOT dan SGPT. Selama pengambilan hingga analisis, darah dijaga supaya tidak lisis. Untuk mencegah lisis, dilakukan secara hati-hati selama pengambilan darah, melepas jarum syringe sebelum dimasukkan kedalam tabung venoject, dialirkan secara perlahan melalui dinding tabung, dan diusahakan seminimal mungkin goncangan terhadap sampel. Jika terjadi lisis, maka sel darah pecah dan enzim intrasel keluar sehingga aktivitas SGOT/SGPT yang terbaca meningkat karena reaksi yang terjadi adalah reaksi enzimatik antara enzim intraseluler dan ekstraseluler. Sampel yang lisis di tandai dengan warna serum yang agak merah atau serum tidak bisa dipisahkan memalui sentrifuge. Padahal normalnya serum akan terpisah dari endapan protein dan sel darah setelah disentrifuge.
Enzim SGOT terdapat dalam sel-sel organ tubuh, yang terbanyak pada otot jantung, kemudian sel-sel hati, otot ginjal dan pankreas (McPhee & Ganong, 2005). Enzim SGOT mengalami kenaikan pada pasien myocardial infarction, setelah exercise, dan pengaruh beberapa obat-obatan ataupun senyawa kimia (Pagana & Pagana, 2002). Enzim SGPT banyak
terdapat dalam sel-sel jaringan tubuh dan sumber utama adalah sel-sel hati, sedang dalam jantung dan otot-otot skelet agak kurang jika dibandingkan dengan SGOT (Hadi, 2002). Enzim SGPT mengalami kenaikan pada kerusakan atau gangguan hepar dan penaruh beberapa obat-obatan dan senyawa kimia (Pagana & Pagana, 2002).
Pada penelitian ini diperoleh nilai aktivitas enzin SGOT sampel tidak semua berada dalam kadar normal yaitu 70-400 U/L (Guyton & Hall, 2007). Pada penelitian ini ada beberapa sampel di atas rentang normal, yaitu dua sampel dari kelompok FDL, satu sampel dari kelompok DOX dan dua sampel dari kelompok DOX+FDL. Hal ini dikarenakan ada sampel darah yang lisis, karena pada saat pengambilan tidak mendapatkan sampel secara sempurna dan selama perlakuan mencit memiliki aktivitas yang tinggi. Akan tetapi setelah dilakukan analisis dengan menggunakan uji analisis varian satu arah (ANAVA) pada tingkat kepercayaan 95%. Hasil yang didapat untuk SGOT setelah dianalisis didapatkan harga sig = 0,249. Sig tersebut lebih besar dari 0,05. Maka hal ini menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna diantara kelompok perlakuan.
Untuk enzin SGPT sampel tidak semua berada dalam kadar normal yaitu 25-200 U/L (Guyton & Hall, 2007). Pada kelompok perlakuan FDL ada yang mencapai nilai 305. Hal ini dikarenakan ada sampel darah yang lisis, karena pada saat pengambilan tidak mendapatkan sampel secara sempurna dan selama perlakuan mencit memiliki aktivitas yang tinggi. Akan tetapi setelah dilakukan analisis dengan menggunakan uji analisis varian satu arah (ANAVA) pada tingkat kepercayaan 95%. Hasil yang didapat untuk SGPT setelah dianalisis didapatkan harga sig = 0,118, Sig tersebut lebih besar dari 0,05. Maka hal ini menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna diantara kontrol dengan semua kelompok perlakuan.
Dari hasil analisis kedua enzim tidak menunjukkan adanya perbedaan bermakna maka untuk sementara dari hasil analisis aktivitas enzim SGOT dan SGPT dapat disimpulkan bahwa senyawa tidak dapat mengurangi toksisitas doxorubisin terhadap aktivitas enzim. Hal ini bisa dilihat dari data rata-rata kadar enzim SGOT dan SGPT dari kelompok doxo tunggal dengan kombinasi FDL+DOX yang tidak mengalami penurunan. Selain itu kenaikan kadar enzim SGOT dan SGPT dapat dipengaruhi akibat sampel darah yang lisis dan enzim SGOT dan SGPT terdapat dalam sel-sel organ tubuh, yang terbanyak pada otot jantung, kemudian sel-sel hati, otot ginjal dan pankreas (McPhee & Ganong, 2005). Parameter aktivitas enzim SGOT dan SGPT disini tidak spesifik (Pagana & Pagana, 2002). Sehingga untuk mengambil kesimpulan dibutuhkan parameter lain yaitu pengamatan preparat histopatologi. Data histopatologi dianggap lebih spesifik dibandingkan dengan enzim SGOT dan SGPT karena menunjukkan keadaan langsung gambaran mikroskopis organ. Pengamatan histopatologi ini untuk melihat kerusakan sel hati secara mikroskopis. Irisan organ hepar yang didapat diproses untuk pembuatan sediaan mikroskopis kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE).
Organ hati, ginjal dan jantung yang diambil masing-masing ditimbang beratnya, lalu kemudian direndam (fiksasi) dalam larutan buffer formalin 10%. Kemudian organ yang sudah difiksasi dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Sutomo untuk selanjutnya di buat preparat histopatologi dengan teknik parafin. Pemeriksaan preparat histopatologi dilakukan melalui pengamatan mikroskopik preparat hati mencit menggunakan perbesaran 400x. Pengamatan dilakukan melalui 5 lapang pandang yang berbeda. Persentase kerusakan sel yang teramati dirata-rata kemudian diberikan skor terhadap rata-rata kerusakan sel
tersebut. Data yang didapat selanjutnya dianalisis dengan uji statistik Kruskal Wallis. Apabila terjadi perbedaaan yang nyata antara kelompok perlakuan maka dilanjutkan dengan uji perbandingan berganda (Uji Z) 5% sehingga diketahui kelompok mana yang mengalami berbeda bermakna.
Pada gambaran mikroskopis tampak perubahan degenerasi. Degenerasi sel yang paling sering adalah penimbunan air dalam sel yang bersangkutan. Degenerasi sel ini merupakan kerusakan yang terjadi pada sitoplasma tetapi tidak sampai merusak inti sel sehingga kerusakan tersebut dapat pulih kembali menjadi normal bila penyebab kerusakan dihilangkan (Price & Wilson, 2005). Pada pengamatan irisan histopatologi hati, hasil analisis Kruskal Wallis untuk degenerasi diperoleh harga Asymp.Sig = 0,168. Sig.tersebut lebih besar dari 0,05. Maka hal ini menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna diantara semua kelompok perlakuan.
Pada gambaran mikroskopis tampak juga terjadi perubahan nekrosis yakni kematian hepatosit, tahap-tahap nekrosis meliputi piknosis, karioeksis, dan kariolisis. Piknosis ditandai dengan terjadinya penggumpalan kromatin dan tidak dikenali lagi anak inti (nukleus), inti tampak lebih padat dan berwarna gelap hitam. Karioeksis ditandai dengan terjadinya kerusakan pada inti yaitu inti pecah berkeping-keping sehingga bentuknya menjadi tidak teratur. Kariolisis ditandai dengan inti yang mulai hilang hingga sulit dikenali secara mikroskopis, bentuk sel lebih memanjang dan warnanya menjadi tidak jelas setelah dilakukan pewarnaaan (Price & Wilson, 2005). Untuk kriteria nekrosis di dapatkan hasil 0,006, sig > α Sehingga dapat disimpulkan ada perbedaan bermakna pada kerusakan nekrosis hati mencit antar kelompok Untuk mengetahui kelompok mana saja yang berbeda makna, dilanjutkan uji perbandingan berganda (uji Z 5%). Dari hasil perhitungan diperoleh hasil bahwa antara kelompok normal-
kontrol negatif CMC-Na (0,1562) dan Kelompok kontrol negatif CMC-Na- FDL (0,3192); tidak mempunyai perbedaan signifikan (p > α). Sedangkan pada Kelompok CMC-DOX (0,0485); Kelompok DOX-FDL (0,0170); dan kelompok DOX-DOX+FDL (0,00016); mempunyai perbedaan yang bermakna (p > 0,05). Hal ini menunjukkan bahwa kombinasi antara doksorubisin dan Fraksi diterpen lakton dapat menurunkan toksisitas doksorubisin pada organ hati.
Ginjal merupakan salah satu organ sasaran utama lainnya dari efek toksik. Urin sebagai jalur utama ekskresi, dapat mengakibatkan ginjal memiliki volume darah yang tinggi mengkonsentrasikan toksikan pada filtrat, membawa toksikan melalui sel tubulus dan mengaktifkan toksikan tertentu (Guyton & Hall, 2007).
Pada pengamatan irisan histopatologi ginjal, hasil analisis Kruskal Wallis untuk kriteria degenerasi, didapatkan Asymp. Sig. > α, yaitu sebesar 0.166. sehingga dapat disimpulkan tidak ada perbedaan bermakna pada kerusakan degenerasi ginjal mencit antar kelompok perlakuan. Sementara untuk kriteria nekrosis, didapatkan Asymp. Sig < α, yaitu sebesar 0.003. Sehingga dapat disimpulkan ada perbedaan bermakna pada kerusakan nekrosis ginjal mencit antar kelompok Untuk mengetahui kelompok mana saja yang berbeda makna, dilanjutkan uji perbandingan berganda (uji Z 5%). Dari hasil perhitungan Zhitung diperoleh hasil bahwa antara Kelompok kontrol negatif CMC-Na-FDL (0,5000) tidak ada perbedaan bermakna. Sedangkan pada kelompok normal-kontrol negatif CMC-Na (0,0091); mempunyai perbedaan signifikan (p < α). Kelompok CMC-DOX (0,0495); Kelompok DOX-FDL (0,0495) dan kelompok DOX-DOX+FDL (0,0048) mempunyai perbedaan yang bermakna nilai p lebih kecil dari derajat kepercayaan (α = 0,05). adanya perbedaan antara kelompok perlakuan
normal dengan CMC-Na hal ini disebabkan karena pengaruh induksi benzo(a)pirene pada hewan coba yang dapat menyebabkan kerusakan nekrosis pada ginjal. Untuk bahan uji DOX yang digunakan hanya memberikan kerusakan degeneratif pada sel organ ginjal. Sementara bila dikombinasikan dengan FDL dapat menurunkan toksisitas doksorubisin pada organ ginjal.
Jantung adalah suatu organ yang vital dalam tubuh. Meskipun jantung bukan organ sasaran biasa, organ ini dapat dirusak oleh berbagai jenis zat kimia. Zat itu bekerja secara langsung pada otot jantung atau secara tak langsung melalui susunan saraf atau pembuluh darah (Lu, 1995).
Pada pengamatan irisan histopatologi jantung, hasil analisis Kruskal Wallis untuk degenerasi diperoleh harga Asymp.Sig = 0,025. Sig tersebut lebih kecil dari 0,05. Hal ini menunjukkan ada perbedaan bermakna pada kerusakan degenerasi jantung mencit antar kelompok perlakuan. Untuk mengetahui kelompok mana saja yang berbeda makna, dilanjutkan uji perbandingan berganda (uji Z 5%). Dari hasil perhitungan diperoleh hasil bahwa antara Kelompok CMC-DOX (0,0207); Kelompok DOX-FDL (0,0032); dan Kelompok DOX-DOX+FDL (0,0032) mempunyai perbedaan signifikan (p < α). Sedangkan untuk kelompok normal-kontrol negatif CMC-Na (0,1038); Kelompok kontrol negatif CMC-Na-FDL (0,2483) tidak mempunyai perbedaan yang bermakna. Hal ini dapat dilihat dari harga p lebih besar dari derajat kepercayaan (α = 0,05). Untuk kriteria nekrosis, didapatkan Asymp, Sig < α, yaitu sebesar 0,004, Sehingga ada perbedaan bermakna pada kerusakan nekrosis jantung mencit antar kelompok. Untuk mengetahui kelompok mana saja yang berbeda makna, dilanjutkan uji perbandingan berganda (uji Z 5%). Dari hasil perhitungan diperoleh hasil bahwa kelompok kontrol normal-kelompok kontrol negatif CMC-Na
(0,0021); Kelompok kontrol negatif CMC-Na-FDL (0,0247); Kelompok DOX-FDL (0,0110) dan kelompok DOX-DOX+FDL (0,0110) mempunyai perbedaan signifikan. Sedangkan untuk kelompok kontrol negatif CMC-Na- DOX (0,3632) tidak mempunyai perbedaan yang bermakna. Hal ini dapat dilihat dari harga p lebih besar dari derajat kepercayaan (α = 0,05). Dari hasil uji Z 5% didapatkan ada perbedaan bermakna antara kelompok perlakuan kontrol negatif CMC-Na-DOX dan kelompok DOX dengan DOX+FDL dapat disimpulkan bahwa pemberian kombinasi antara FDL dengan Doksorubisin dapat memberikan efek protektif terhadap organ jantung.
Pada preparat hampir semuanya terdapat kerusakan baik degenerasi maupun nekrosis, namun kerusakan yang ada tergolong dalam kerusakan ringan dan sedang. Tidak ada yang tergolong dalam kerusakan berat selain diakibatkan karena zat-zat toksik, banyak hal yang dapat meyebabkan sel mengalami cedera atau mati. Diantaranya, defisiensi oksigen pada sel, bahan makanan, gangguan secara fisik, virus (Price & Wilson, 2005).
Berdasarkan pada pengamatan kedua parameter tersebut yakni pengujian enzim SGOT, SGPT dan pengamatan histopatologi dari hati, ginjal dan jantung mencit dapat dsimpulkan bahwa kombinasi fraksi diterpen lakton sambiloto dengan doksorubisin tidak dapat menurunkan toksisitas dari doksorubisin terhadap fungsi hati. Hal ini berdasarkan aktivitas enzim SGOT dan SGPT, tetapi dapat menurunkan toksisitas doksorubisin terhadap organ ginjal dan jantung mencit berdasarkan gambaran histopatologi organ ginjal dan jantung mencit. Namun diperlukan parameter lain untuk menguatkan diagnosa tersebut. Seperti pemeriksaan fungsi ginjal seperti BUN, Kreatinin dan denyut jantung. Selain itu dapat juga dilakukan pengujian pada hewan coba yang lebih banyak jumlahnya
dan tinggi spesiesnya seperti tikus putih atau kelinci, pada jangka waktu yang lebih lama dan variasi dosis yang lebih banyak sehingga diharapkan dapat memperoleh gambaran yang memadai tentang pengaruh dari kombinasi fraksi diterpen lakton sambiloto dengan dokxorubisin terhadap kerusakan sel-sel pada organ tubuh.
94