IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.4 Pemilihan Fraksi Ekstrak Jarak Potensial sebagai zat antioksidan
Pemilihan jenis ekstrak yang potensial sebagai zat antioksidan dan zat antimikroba didasarkan pada aktivitas yang tinggi dengan memperhatikan rendemen dan kandungan senyawa toksik ester forbol. Aktivitas antioksidan dan aktivitas antimikroba yang dimiliki oleh ekstrak merupakan parameter keampuhan/khasiat bahan. Rendemen berhubungan dengan pertimbangan kelayakan proses dan kelayakan ekonomi, sedangkan kandungan ester forbol berhubungan dengan tingkat keamanan penggunaan.
4.4.1. Zat antioksidan
Aktivitas antioksidan tertinggi dimiliki oleh ekstrak kasar bungkil jarak pagar, diikuti fraksi etil asetat bungkil, fraksi metanol daun jarak pagar, dan
fraksi etil asetat kulit batang. Dengan mempertimbangkan aktivitas antioksidan dan rendemen (Tabel 11), ekstrak kasar dan fraksi metanol daun, serta ekstrak kasar dan fraksi metanol bungkil jarak pagar cukup potensial sebagai zat antioksidan. Diantara ekstrak potensial tersebut, fraksi metanol daun dipilih sebagai zat antioksidan dengan pertimbangan aktivitas antioksidan yang cukup tinggi dan tidak mengandung ester forbol, meskipun aktivitasnya masih lebih rendah dari antioksidan komersial BHT yang memiliki peredaman DPPH mencapai 95,36%. Ekstrak kasar bungkil jarak pagar walaupun memiliki aktivitas paling tinggi, tidak dipilih sebagai zat antioksidan karena mengandung senyawa toksik ester forbol. Ekstrak kasar bungkil jarak memiliki aktivitas tertinggi yaitu 94,39%, berbeda nyata ( =0.05) dengan ekstrak kasar daun, akan tetapi tidak berbeda nyata dengan fraksi metanol daun dan fraksi metanol bungkil. Analisis ragam untuk pemilihan ekstrak sebagai zat antioksidan dan analisis ragam untuk rendemen ekstrak disajikan pada Lampiran 11 dan Lampiran 12.
Tabel 11 Pemilihan ekstrak sebagai zat antioksidan
Parameter Ekstrak Kasar Daun Fr. metanol Ekstrak Kasar Bungkil Fr. metanol
Peredaman DPPH (%) 74,53±6.93 89,42±1,64 94,39±1,38 84,04±3,55
Kandungan ester forbol tidak
terdeteksi tidak terdeteksi terdeteksi tidak terdeteksi Rendemen (% b/b serbuk kering) 5,08±0,00 3,68±0,06 6,55±0,00 2,41±0,37
Ekstrak terpilih sebagai zat antioksidan dikarakterisasi lebih lanjut dengan analisa komposisi kimia dengan GC-MS dan dianalisa aktivitas antioksidannya dengan menentukan EC50.
Hasil analisa komposisi kimia menggunakan GC-MS pada fraksi metanol daun jarak mendapatkan beberapa senyawa yang teridentifikasi seperti pada Tabel 12. Kromatogram GC-MS fraksi metanol daun jarak disajikan pada Lampiran 13.
Tabel 12. Identifikasi senyawa kimia fraksi metanol ekstrak daun jarak pagar No Retention
Time Nama Senyawa
Keterangan 1 6.76 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl, 4H-pyran-4-One Senyawa piran 2 7.38 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyde Seyawa fural
3 8.97 3-Pyridinecarboxamide Nicotinamide
4 9.20 3-dimethylamino-2-methyl-2-cyclopenten-1-one 5 10.42 4-methyl-2,5-dimethylbenzaldehyde
6 13.19 n-Hexadecanoic acid
7 13.73 9H-Pyrido[3,4] indole senyawa alkaloid Senyawa 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyde adalah produk reaksi Maillard yang merupakan hasil reaksi gugus karbonil dari gula dengan gugus amino dari asam amino, peptida dan protein dalam fraksi metanol daun jarak. Dengan kelimpahan yang cukup tinggi dalam fraksi metanol, senyawa inilah yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan yang dimiliki. Bailey dan Won Um (1992) melaporkan beberapa produk reaksi Maillard seperti redukton amino ataupun polimer seperti melanoidin memiliki aktivitas antioksidan. Waghmare et al. (2010) mendapatkan bahwa senyawa fural ditemukan pada ekstrak metanol dan ekstrak etanol dari cangkang biji asam (Tamarindus indica Linn.) dan bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri dari ekstrak yang dihasilkan.
5 hydroxymethyl, 2-Furancarboxaldehyde 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl, 4H- Pyran-4-One
Pyridinecarboxamide
Gambar 12 Struktur senyawa yang teridentifikasi pada fraksi metanol daun jarak (www. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)
Senyawa 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl,-4H-pyran-4-one (DDMP) adalah senyawa piran yang juga merupakan produk reaksi Maillard. Senyawa dengan rumus molekul C6H8O4 ini mampu mendonorkan 2 ikatan hidrogennya (Pubchem Compound), sehingga senyawa ini juga memiliki aktivitas antioksidan. Aktivitas lain yang dimiliki oleh senyawa ini adalah aktivitas anti proliferasi dan proapoptosis sebagaimana dilaporkan oleh Jung Ok Ban et al. (2007). Dalam penelitiannya, Ok Ban mendapatkan bahwa perlakuan DDMP yang diisolasi dari bawang putih dengan konsentrasi 0,5-1,5 mg/ml dengan perlakuan 0-48 jam dapat menghambat pertumbuhan sel kanker kolon. DDMP ditemukan juga pada ekstrak metanol daun Vitex negundo (Kumar et al, 2010). Dilaporkan bahwa senyawa ini merupakan fraksi flavanoid yang memiliki aktivitas antibakteri dan antiinflamasi.
Senyawa lain yang teridentifikasi adalah pyridinecarboxamide atau dikenal juga dengan nicotinamide. Nicotinamide merupakan senyawa vitamin yang merupakan konstituen penting dalam sintesis pyridine coenzyme pada mamalia. Nicotinamide murni berwujud padat, kelarutan dalam air sebesar 691-1000g/l dan akan terpartisi sempurna dalam pelarut air (OECD SIDS).
Nilai Efficient Concentration (EC50) adalah parameter yang menunjukkan kesetaraan konsentrasi yang memberikan 50% pengaruh. EC50 didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang menyebabkan kehilangan aktivitas DPPH/warna sebesar 50%. Semakin tinggi aktivitas antioksidan, maka nilai EC50 akan semakin rendah. Hasil pengukuran EC50 fraksi metanol ekstrak daun jarak pagar adalah sebesar 0.13 mg/ml, adapun BHT sebagai antioksidan komersial memiliki nilai EC50 sebesar 0.012 mg/ml. Perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak terpilih dengan BHT ditunjukkan pada Gambar 13.
Gambar 13 Perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak terpilih dengan BHT
Nilai EC50 ekstrak terpilih adalah 0.13 mg/ml yang berarti bahwa untuk meredam DPPH sebesar 50% diperlukan konsentrasi ekstrak sebesar 0.13 mg/ml. Konsentrasi ini masih lebih tinggi dibanding BHT yang hanya memerlukan konsentrasi 0.012 mg/ml untuk proses peredaman. Pada konsentrasi 0.04 mg/ml BHT sudah dapat meredam DPPH sebesar 85,15%.
4.4.2. Zat antimikroba
Pemilihan ekstrak sebagai zat antimikroba didasarkan juga pada aktivitas antimikroba, rendemen, serta kandungan senyawa toksik ester forbol. Aktivitas antimikroba tertinggi dimiliki oleh fraksi etil asetat bungkil, diikuti oleh fraksi etil asetat daun, fraksi etil asetat kulit batang dan ekstrak kasar daun. Fraksi etil asetat daun jarak terpilih sebagai zat antimikroba dengan pertimbangan aktivitas antimikroba paling tinggi, kandungan ester forbol rendah, serta pertimbangan proses produksi yang berkaitan dengan pemanfaatan fraksi metanol daun sebagai zat antioksidan (Tabel 13).
Tabel 13 Pemilihan ekstrak sebagai zat antimikroba
Parameter Fraksi etil asetat
Daun Bungkil Kulit batang Diameter penghambatan
terhadap S. aureus (mm)
12,5 14,45 12,42
Rendemen
(% b/b serbuk kering) 0,41± 0.01 0,54± 0.00 0,12± 0.06
Ester forbol (mg/g ekstrak) 13,41 tidak dianalisa 1,55
Fraksi etil asetat bungkil jarak pagar memiliki rendemen yang paling tinggi. Meskipun demikian fraksi ini tidak dipilih sebagai zat antimikroba karena ditakutkan adanya kandungan ester forbol yang lebih tinggi. Kandungan ester forbol pada fraksi etil asetat bungkil jarak tidak diketahui, akan tetapi dapat diperkirakan kandungan senyawa ini jauh lebih tinggi dibanding dua fraksi etil asetat lainnya karena tingginya kandungan ester forbol pada ekstrak kasar dan fraksi heksan. Senyawa ester forbol khususnya forbol 12-miristat 13 asetat dilaporkan oleh Sigma bersifat larut dalam aseton, DMSO, etil asetat, etanol dan metilen klorida.
Tabel 14 Identifikasi senyawa kimia fraksi etil asetat ekstrak daun jarak pagar No Retention
Time Nama Senyawa Keterangan
1 6.46 Benzeneethanol alkohol aromatik
2 7.24 2,3-dihydro benzofuran fenol
3 7.41 3 ethyl, 4 methyl 1 H-pyrole-2,5 dione alkaloid
4 8.14 Indole alkaloid
5 8.26 4 vinyl 2 methoxy phenol fenol
6 8.51 4 hydroxy benzaldehyde fenol
7 8.92 Niacinamide Senyawa vitamin
8 9.15 4 hydroxy benzeneethanol fenol
9 9.25 1-(4-hydroxyphenyl) ethanone senyawa keton, fenol 10 9.36 4-hydroxy benzoic acid methyl ester ester
11 10.04 1-Naphthalenol fenol
12 11.50 12-methyl- tridecanoic acid methyl ester ester
13 11.62 9 hydroxy-4-megastigmen-3-one senyawa glikosida 14 11.97 4-methoxy-3-methylbenzofuran-6-ol
15 12.18 (-) –Loliolide Senyawa terpene
12.23 4-hydroxy-3,5,6-trimethyl-4-(3-oxo-1-butenyl)-2-cyclohexen-1-one 16 12.36 Neophytadiene
17 12.42 1H-Indole-3-carboxaldehyde alkaloid 18 12.54 (E)-6,6-dimethylcyclooct-4-en-1-one
19 12.95 hexadecanoic acid methyl ester Metil ester 20 14.22 9 Octadecenoic acid (Z) methyl ester Metil ester 21 14.37 16-methyl- heptadecanoic acid methyl ester Metil ester
Hasil uji GC-MS terhadap fraksi etil asetat daun jarak pagar mendapatkan beberapa senyawa yang dapat teridentifikasi dengan baik (Tabel 14). Senyawa- senyawa yang teridentifikasi meliputi senyawa fenol, aldehid serta terpene yang cukup mendominasi fraksi etil asetat ekstrak daun jarak. Kromatogram GC-MS fraksi etil asetat juga disajikan pada Lampiran 13.
Senyawa terpen yang teridentifikasi adalah Loliolide yang merupakan senyawa monoterpen. Senyawa ini juga telah diisolasi dari tanaman Euphorbia supine oleh Tanaka dan Matsunaga (1988), daun Equisetum arvense oleh Hiraga et al. (2010) dengan aktivitas penghambatan terhadap germinasi biji lettuce, ekstrak kloroform daun Eucommia ulmoides (Okada et al. 2001) yang menunjukkan aktivitas immunosuppressive dan diisolasi dari ekstrak etanol daun M.whitei (Apocynaceae) dimana Neergaard et al. (2010) melaporkan bahwa senyawa ini bertanggung jawab terhadap aktivitas mirip antidepressant dan menunjukkan afinitas terhadap serotonin transporter.
Senyawa-senyawa alkaloid yang teridentifikasi adalah 3 ethyl, 4 methyl 1 H-pyrole-2,5 dione, indole dan 1H-Indole-3-carboxaldehyde. Adapun senyawa fenol yang teridentifikasi meliputi 2,3-dihydro benzofuran, 4 vinyl 2 methoxy phenol, 4 hydroxy benzaldehyde, 4 hydroxy benzeneethanol dan 1- Naphthalenol. Senyawa lain yang ditemukan adalah 9-hydroxy-4- megastigmen-3-one yang merupakan senyawa glikosida. Senyawa-senyawa turunan megastigmen telah tercatat ditemukan pada beberapa family tanaman yang berbeda-beda antara lain Apocynaceae, Aquifoliaceae, Betulaceae, Cupressaceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae, Leguminosae, Magnoliaceae, Pinaceae, Podocarpaceae, Rhamnaceae, Rosaceae, Simaroubaceae, Solanaceae, and Vitaceae. Senyawa ini menunjukkan aktivitas antimikroba sehingga tanaman yang mengandung senyawa ini banyak digunakan sebagai obat herbal untuk beberapa jenis penyakit.
Niasinamid merupakan senyawa aromatik heterosiklik yang umum digunakan dalam produk kosmetik yaitu berfungsi sebagai conditioning agents pada rambut dan kulit. Niasinamid merupakan senyawa vitamin larut air, dan merupakan bagian dari golongan vitamin B. Senyawa ini menunjukkan aktivitas anti inflamasi yang berguna bagi pasien dengan kondisi kulit
inflamasi seperti penyakit acne vulgaris. Beberapa struktur senyawa yang teridentifikasi pada fraksi etil asetat daun jarak disajikan pada Gambar 14.
Gambar 14 Struktur senyawa yang teridentifikasi pada fraksi etil asetat daun jarak (www. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)