Fase-fase Evaluasi Antibiotika Baru
10.1 Penanganan Awal Sampel-Sampel Biologis
1) Denaturasi protein
Obat dalam sampel biologis berada bersama-sama dengan senyawa lain terutama protein, karena obat akan berikatan dengan protein plasma untuk didistribusikan, sehingga harus dilakukan pemisahan. Proses pemisahan bisa dilakukan dengan cara denaturasi protein, bisa dengan penambahan asam, misalnya TCA 10% (trichloro acetic acid) atau dengan pemanasan pada suhu tertentu. Perlu diperhatikan adalah pengaruh bahan yang digunakan atau pemanasan terhadap obatnya, karena bisa mengakibatkan perubahan struktur kimia atau kerusakan. Jadi harus dipilih bahan yang cocok atau metode denaturasi yang sesuai.
Denaturasi protein bisa dilakukan dengan mengatur pH medium, misalnya menggunakan asetonitril. Setelah plasma dicampur dengan asetonitril dengan volume yang sebanding, larutan dijenuhkan dengan sodium bisulfate atau sodium klorida, maka protein akan mengendap dan obat terpisah berada dalam fase atas. Bisa juga dilakukan dengan enzim proteolitik yang sesuai. Misalnya enzim subtilisin bisa mendenaturasi protein plasma dengan baik.
2) Ekstraksi pelarut untuk senyawa hidrofobik
Senyawa hidrofobik merupakan senyawa tidak suka air, sehingga harus dipertimbangkan bagaimana sifat senyawa pengekstraksi, apakah berupa pelarut organic atau anorganik. Apalagi jika pelarut yang digunakan untuk ekstraksi lebih dari satu, maka harus dipilih kombinasi yang tepat sehingga dihasilkan komposisi pelarut yang dapat mengektraksi secara efektif dan efisien. Artinya jumlah pelarut sesedikit mungkin, tetapi dapat menghasilkan senyawa terekstraksi sebanyak mungkin.
3) Liofilisasi
Kestabilan senyawa kimia sangat dipengaruhi oleh sifat fisika-kimianya, apalagi jika berada dalam sampel biologis, oleh sebab itu diperlukan penanganan tepat agar tidak terjadi kerusakan. Salah satu upayanya adalah dengan melakukan liofilisasi (pembekuan), yaitu dengan menyimpan sampel pada suhu dibawah 0 0C lazimnya -20 0C , -70 0C atau dalam nitrogen cair. Suhu yang dipilih biasanya tergantung jenis sampel dan lama penyimpanan yang diinginkan.
4) Hidrolisis konjugat
Hidrolisis konjugat diperlukan bila senyawa yang akan kita analisis dalam bentuk terkonjugasi dengan senyawa lain. Macam senyawa penghidrolisis bisa berupa enzim atau senyawa kimia biasa, hal ini sangat tergantung pada jenis ikatan konjugasi dan proses pembentukannya.
5) Derivatisasi kimia sebagai pendahuluan ekstraksi
Proses derivatisasi diperlukan jika senyawa sulit untuk diisolasi, tetapi akan lebih mudah bila berada dalam bentuk derivatnya. Untuk membentuk derivatnya tentu diperlukan suatu senyawa spesifik yang harus ditambahkan sehingga bereaksi dan dapat mengubah struktur kimia senyawa
awal menjadi derivatnya. Pemilihan senyawa apa yang harus ditambahkan dan kondisi bagaimana yang harus dipenuhi, tentunya diperlukan pengetahuan khusus dan juga pengalaman untuk mengerjakanya. Harus pula diketahui proses reaksi dan mekanismenya, sehingga tidak keliru membentuk senyawa lain.
6) Prosedur ekstraksi dan prinsip pengukuran untuk obat dan metabolitnya
Ekstraksi padat-cair dan cair-cair
Metode kromatografi, spektroskopi dan radiokimia dalam bioanalisis kualitatif dan kuantitatif (review)
Metode difusi
Metode turbidimetri Bioantografi
B. Metode non-tradisional
Metode pembahan permeabilitas membran pada yeast Metode pengikatan kompetitif
Enzim memiliki sifat khas, yang biasanya sangat dipengaruhi oleh perubahan pH, temperatur dan hanya bekerja pada kondisi yang sesuai sehingga memerlukan penanganan khusus. Enzim juga hanya bereaksi untuk senyawa tertentu atau bekerja spesifik. Kapasitas kerja enzim biasanya berbanding lurus bila konsentrasi kecil, tetapi suatu saat akan mencapai maksimum, kapan hal ini terjadi, tentunya dipengaruhi juga substrat yang digunakan.
b. Enzim ammobil
Enzim merupakan senyawa yang labil dan mudah rusak, padahal manfaatnya sangat besar dalam kehidupan. Untuk mengatasi hal tersebut dilakukan usaha agar enzim bersifat lebih stabil, yaitu dengan membuat mikroba menjadi termofilik (dengan asumsi karena enzim dihasilkan oleh mikroba, sehingga diharapkan mikroba yang tahan panas juga akan menghasilkan enzim yang tahan panas) atau dibuat bentuk ammobil dengan cara memerangkap enzim tersebut dalam suatu bahan khusus.
Bentuk enzim ammobil ini memiliki beberapa keuntungan antara lain: enzim lebih stabil, bisa digunakan berkali-kali dan mudah dipisahkan dari produk. Ada beberapa cara yang bisa dilakukan untuk membentuk enzim amobil:
1. Adsorpsi, enzim ditempelkan pada pembawa yang bersifat inert, misalnya CaSO4, Bentonit atau Tanah Lempung
2. Enzim ditempelkan pada carier melalui ikatan ionic, enzim diatur bermuatan negative atau positif dengan mengatur pH pelarutnya, contoh: Dietil Amino Etil yang bermuatan positif
pembawa, ikatan ini cukup kuat dan stabil, contoh: glutaraldehide 4. Dibuat ikatan kovalen antar system, ikatan ini juga kuat,
menggunakan pereaksi gluraldehide
5. Penjebakan atau trapning. Enzim dijebak dalam suatu matrik, biasanya berupa poliakrilamid yang dibuat bersilang-silang dengan senyawa lain sehingga berbentuk jaring. Cara ini banyak dipilih juga untuk amobil sel, terlebih bila sel pathogen karena ikatan sangat kuat.
6. Membuat bentuk kapsul, enzim diliputi dengan bahan tertentu missal karagen atau pati sehingga berbentuk kapsul, banyak digunakn juga untuk trapping sel tanaman
Cara a dan b biasanya mudah bocor, tetapi kemungkinan terjadi penurunan aktivitas kecil. Sedangkan cara c dan d ikatan kuat, namun karena enzim bekerja pada ruang yang spesifik maka ada kemungkinan terjadi perubahan bentuk sehingga bisa terjadi penurunan aktivitas. Cara e lebih banyak dipilih karena ikatan cukup kuat dan aktivitas relative konstan, namun juga memiliki kelemahan yaitu sewaktu pembuatan matrik timbul panas yang kemungkinan bisa mendenaturasi enzim.
c. Penggunaan enzim dalam bioanalisis
Enzim memiliki fungsi sebagai biokatalis, bisa dimanfaatkan dalam proses isolasi dan purifikasi senyawa-senyawa yang diinginkan dalam berbagai sampel biologis. Enzim bisa digunakan juga dalam terapi misalnya pepsin, papain dan renin untuk membantu pencernaan, asparaginase sebagai antikanker, lisosim sebagai antibakteri dan β-glukoronidase untuk pengobatan kardmovaskuler.
Problem utama analisis obat dalam cairan hayati adalah untuk misahkan obat dan material endogen sebanyak mungkin. Kemudahan sampel untuk dianalisis akan meningkat seiring tingkat fluidisitasnya, cairan serebrospinal biasanya merupakan cairan yang paling mudah untuk ditangani, sementara darah total adalah yang paling sulit (tabel X.1). Untuk meningkatkan fluiditasnya, senyawa berbentuk padatan atau semipadat untuk analisis bisa dilakukan secara mekanik (tabel 10.2). Prosedur ini mungkin berpengaruh pada sampel dalam beberapa metode yang digunakan yang bisa berakibat berubahnya konsentrasi obat dalam sampel (efek temperature, pembentukan khelat logam tertentu, dan hidrolisis konjugat) dan beberapa bagian penanganan menjadi lebih sulit (penyabunan, emulsifikasi dan rupture sel). Pelarut yang digunakan sebagai media bersifat kritis dan masing-masing memiliki keuntungan dan kerugian. Kemudahan ekstraksi obat dalam larutan anorganik ke pelarut organik akan bergantung pada pelarut yang digunakan, dan umumnya dilakukan dengan kombinasi polaritas pelarut pengekstraksi.
1. Darah
Darah, merupakan cairan biologis yang paling kompleks, dikoleksi dari subyek atau hewan uji. Darah terdiri atas cairan buffer encer yang mengandung protein terlarut (solubilized proteins), lemak dan padatan terlarut (dissolved fats and solids), dan sel tersuspensi, untungnya, kandungan utamanya yaitu sel darah merah (erythrocytes) dapat dipisahkan dari cairan encer (plasma) dengan sentrifugasi sederhana. Meskipun demikian, darah tidak mudah untuk
ditangani, sel dapat pecah atau rusak dan menyebabkan komponen-komponen yang tak diharapkan dan menjadikan keadaan makin sulit. Contohnya, ion feri dilepaskan oleh eritrosit mungkin akan membentuk khelat dengan senyawa analit dan mengakibatkan ekstraksi yang kurang baik dari fase air.
Tabel X.1. Daftar Sampel Biologis Bergantung pada Fluiditasnya dalam Kaitannya dengan Tingkat Kemudahan Analisisnya (Chamberlain,1 995)
Tingkat Fluiditas Jenis Sampel Biologis - Cairan serebrospinal - Air mata - Keringat - Ludah -Urin Cairan - Empedu - Plasma - Serum - Darah Campuran - Feses - Otak
- Jantung, Ginjal dan Hepar - Pam, Otot
Padatan
- Tulang
Sel bisa pecah karena pemanasan atau pembekuan, atau oleh factor mekanik seperti pengadukan, tetapi umumnya akibat perubahan kekuatan ion disekeliling cairan karena penambahan air, menghasilkan osmosa karena sel bengkak dan pecah (swell and rupture) sehingga perlu penambahan larutan garam isotonis untuk mengubah volume sampel darah utuh.
Ekstraksi umumnya bukan dari darah total, tetapi disiapkan sebagai serum atau plasma. Serum diperoleh dengan cara sentrifugasi langsung atau pengendapan sel darah merah tanpa penambahan antikoagulan, kemudian diambil supernatannya sehingga masih mengandung faktor penjendalan darah. Sedangkan plasma diperoleh dengan menambahkan antikoagulan dalam darah, disentrifugasi dan diambil supernatannya. Plasma maupun serum mengandung protein dalam jumlah besar yang harus dipisahkan dari analit bila akan diperiksa.
2. Urin
Urin, berbeda dengan plasma atau serum, biasanya bebas dari protein atau lemak sehingga bisa diekstraksi langsung dengan pelarut organic. Meskipun begitu, urin memiliki banyak variasi komposisi dan sangat tergantung pada jenis makanan yang dikonsumsi. Normalnya senyawa yang ditemukan dalam urin adalah larut air, sedangkan sebagian besar obat larut lipid sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut yang cocok.
Kesulitan dalam pengumpulan sampel urin adalah volume urin yang benar yang diproduksi selama interval waktu sampling, bukan pada penetapan kadarnya. Jumlah analit diperoleh dengan mengalikan volume konsentrasinya. Sampel urin juga sering memberikan hasil negative palsu misalnya pada pemeriksaan kreatinin.
Urin juga memiliki variasi pH yang lebar, dipengaruhi oleh konsumsi makanan atau obat-obatan. Penggunaan antasida misalnya, kemungkinan bisa menyebabkan urin menjadi basa. Asam kuat tidak besar pengaruhnya, pH urin normal berkisar 5,5 - 7.
3. Feses
Penanganan sampel feses cukup rumit, mengingat bentuknya semipadat dan juga berupa campuran sisa-sisa proses pencernaan maupun senyawa-senyawa sisa proses metabolisme tubuh. Harus dipikirkan pengambilan cuplikan yang tepat dan juga jenis pelarut yang cocok karena banyaknya senyawa yang terkandung, apalagi jika kadar analit dalam sampel kecil.