memberikan dukungan yang cukup besar terhadap kemajuan berbagai aspek memberikan dukungan yang cukup besar terhadap kemajuan berbagai aspek ilmu yang lain, diantaranya untuk pengembangan obat baru, studi ilmu yang lain, diantaranya untuk pengembangan obat baru, studi bioavailabilitas dan bioekivalensi, studi dasar penelitian biomedik dan bioavailabilitas dan bioekivalensi, studi dasar penelitian biomedik dan farmasetik, serta penyalahgunaan obat dan farmasi forensik. Perkembangan farmasetik, serta penyalahgunaan obat dan farmasi forensik. Perkembangan dan aplikasi dalam bioanalisis sendiri tidak lepas dari dukungan ilmu-ilmu dan aplikasi dalam bioanalisis sendiri tidak lepas dari dukungan ilmu-ilmu terkait diantaranya ilmu farmakologi, mikrobiologi, farmakokinetika, terkait diantaranya ilmu farmakologi, mikrobiologi, farmakokinetika, toksikologi, kimia analisa dan rancangan obat
toksikologi, kimia analisa dan rancangan obat (Quantitative Structure Activity(Quantitative Structure Activity Relationship/Q
Relationship/QSAR). Pengetahuan tentang sifat fisika-kimia suatu senyawa,SAR). Pengetahuan tentang sifat fisika-kimia suatu senyawa, berbagai metode ekstraksi, dan metode analisa misalnya kromatografi, berbagai metode ekstraksi, dan metode analisa misalnya kromatografi, spektroskopi, atau radiokimia sangat mendukung dalam penanganan awal spektroskopi, atau radiokimia sangat mendukung dalam penanganan awal sampel biologis serta penetapan kadar obatnya.
sampel biologis serta penetapan kadar obatnya.
Hasil kerja seorang bioanalis dewasa ini menjadi sedemikian penting, Hasil kerja seorang bioanalis dewasa ini menjadi sedemikian penting, karena akan menjadi landasan dalam menentukan langkah lanjut bagi banyak karena akan menjadi landasan dalam menentukan langkah lanjut bagi banyak profesi yang lain, misalnya dokter, farmakokinetis, biokemis dan toksikologis. profesi yang lain, misalnya dokter, farmakokinetis, biokemis dan toksikologis. Dalam proses pengembangan obat, peran bioanalisis bisa dirasakan mulai Dalam proses pengembangan obat, peran bioanalisis bisa dirasakan mulai sejak uji farmakologi dan toksikologi, uji
sejak uji farmakologi dan toksikologi, uji metabolisme dan farmakokinetik, ujimetabolisme dan farmakokinetik, uji klinik fase I, uji klinik fase II dan III, uji farmakodinamik dan pengembangan klinik fase I, uji klinik fase II dan III, uji farmakodinamik dan pengembangan formulasi obat. Berperan juga dalam pengawasan obat dan toksikologi formulasi obat. Berperan juga dalam pengawasan obat dan toksikologi forensik.
forensik.
Secara garis besar ilmu ini dibagi dalam dua bagian penting yaitu Secara garis besar ilmu ini dibagi dalam dua bagian penting yaitu bioassay
bioassay atau analisis hayati (merupakan analisis baik secara kualitatif maupunatau analisis hayati (merupakan analisis baik secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat, sediaan obat maupun wadah obat dengan kuantitatif suatu bahan obat, sediaan obat maupun wadah obat dengan melibatkan sistem hayati) dan bioanalisis itu sendiri (merupakan analisis baik melibatkan sistem hayati) dan bioanalisis itu sendiri (merupakan analisis baik secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat maupun sediaan obat secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat maupun sediaan obat dalam sampel biologis). Sistem hayati yang digunakan bervariasi bisa berupa dalam sampel biologis). Sistem hayati yang digunakan bervariasi bisa berupa
memberikan dukungan yang cukup besar terhadap kemajuan berbagai aspek memberikan dukungan yang cukup besar terhadap kemajuan berbagai aspek ilmu yang lain, diantaranya untuk pengembangan obat baru, studi ilmu yang lain, diantaranya untuk pengembangan obat baru, studi bioavailabilitas dan bioekivalensi, studi dasar penelitian biomedik dan bioavailabilitas dan bioekivalensi, studi dasar penelitian biomedik dan farmasetik, serta penyalahgunaan obat dan farmasi forensik. Perkembangan farmasetik, serta penyalahgunaan obat dan farmasi forensik. Perkembangan dan aplikasi dalam bioanalisis sendiri tidak lepas dari dukungan ilmu-ilmu dan aplikasi dalam bioanalisis sendiri tidak lepas dari dukungan ilmu-ilmu terkait diantaranya ilmu farmakologi, mikrobiologi, farmakokinetika, terkait diantaranya ilmu farmakologi, mikrobiologi, farmakokinetika, toksikologi, kimia analisa dan rancangan obat
toksikologi, kimia analisa dan rancangan obat (Quantitative Structure Activity(Quantitative Structure Activity Relationship/Q
Relationship/QSAR). Pengetahuan tentang sifat fisika-kimia suatu senyawa,SAR). Pengetahuan tentang sifat fisika-kimia suatu senyawa, berbagai metode ekstraksi, dan metode analisa misalnya kromatografi, berbagai metode ekstraksi, dan metode analisa misalnya kromatografi, spektroskopi, atau radiokimia sangat mendukung dalam penanganan awal spektroskopi, atau radiokimia sangat mendukung dalam penanganan awal sampel biologis serta penetapan kadar obatnya.
sampel biologis serta penetapan kadar obatnya.
Hasil kerja seorang bioanalis dewasa ini menjadi sedemikian penting, Hasil kerja seorang bioanalis dewasa ini menjadi sedemikian penting, karena akan menjadi landasan dalam menentukan langkah lanjut bagi banyak karena akan menjadi landasan dalam menentukan langkah lanjut bagi banyak profesi yang lain, misalnya dokter, farmakokinetis, biokemis dan toksikologis. profesi yang lain, misalnya dokter, farmakokinetis, biokemis dan toksikologis. Dalam proses pengembangan obat, peran bioanalisis bisa dirasakan mulai Dalam proses pengembangan obat, peran bioanalisis bisa dirasakan mulai sejak uji farmakologi dan toksikologi, uji
sejak uji farmakologi dan toksikologi, uji metabolisme dan farmakokinetik, ujimetabolisme dan farmakokinetik, uji klinik fase I, uji klinik fase II dan III, uji farmakodinamik dan pengembangan klinik fase I, uji klinik fase II dan III, uji farmakodinamik dan pengembangan formulasi obat. Berperan juga dalam pengawasan obat dan toksikologi formulasi obat. Berperan juga dalam pengawasan obat dan toksikologi forensik.
forensik.
Secara garis besar ilmu ini dibagi dalam dua bagian penting yaitu Secara garis besar ilmu ini dibagi dalam dua bagian penting yaitu bioassay
bioassay atau analisis hayati (merupakan analisis baik secara kualitatif maupunatau analisis hayati (merupakan analisis baik secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat, sediaan obat maupun wadah obat dengan kuantitatif suatu bahan obat, sediaan obat maupun wadah obat dengan melibatkan sistem hayati) dan bioanalisis itu sendiri (merupakan analisis baik melibatkan sistem hayati) dan bioanalisis itu sendiri (merupakan analisis baik secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat maupun sediaan obat secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat maupun sediaan obat dalam sampel biologis). Sistem hayati yang digunakan bervariasi bisa berupa dalam sampel biologis). Sistem hayati yang digunakan bervariasi bisa berupa
hewan utuh atau organ terisolasi (untuk uji hayati dengan hewan utuh), hewan utuh atau organ terisolasi (untuk uji hayati dengan hewan utuh), organisme atau bagian-bagian tertentu dari makhluk hidup misalnya enzim, organisme atau bagian-bagian tertentu dari makhluk hidup misalnya enzim, protein atau DNA. Penelitian bisa
protein atau DNA. Penelitian bisa dilakukan atau dikembangkan secaradilakukan atau dikembangkan secara in-vivoin-vivo maupun
maupunin-vitro.in-vitro.
Bioassay
Bioassay atau uji hayati diklasifikasikan dalam uji hayati kualitatif danatau uji hayati diklasifikasikan dalam uji hayati kualitatif dan kuantitatif. Uji hayati kualitatif diantaranya meliputi uji pirogen, uji sterilitas, kuantitatif. Uji hayati kualitatif diantaranya meliputi uji pirogen, uji sterilitas, uji mikrobia, uji toksisitas dan penetapan angka antigen, sedangkan uji hayati uji mikrobia, uji toksisitas dan penetapan angka antigen, sedangkan uji hayati kuantitatif mempelajari hubungan dosis respon, baik dari efek quantal kuantitatif mempelajari hubungan dosis respon, baik dari efek quantal maupun efek gradual.
maupun efek gradual.
Interaksi antara obat dan organisme hidup akan dipelajari dalam dua Interaksi antara obat dan organisme hidup akan dipelajari dalam dua bagian ilmu yaitu:
bagian ilmu yaitu:
farmakodinamika (mempelajari pengaruh obat terhadap tubuhfarmakodinamika (mempelajari pengaruh obat terhadap tubuh organisme)
organisme)
farmakokinetikfarmakokinetika a (mempelajari pengaruh tubuh organisme (mempelajari pengaruh tubuh organisme terhadapterhadap obat)
obat)
Aksi obat
Aksi obat bisa tenjadi pada: bisa tenjadi pada: 1. organisme utuh, 1. organisme utuh, 2. organ, 3. 2. organ, 3. jaringan, 4. sjaringan, 4. sel, 5.el, 5. struktur subseluler dan 6. molekul biologi. Berdasarkan adanya aksireaksi struktur subseluler dan 6. molekul biologi. Berdasarkan adanya aksireaksi tersebut bisa dipelajari banyak hal, antara
tersebut bisa dipelajari banyak hal, antara lain:lain:
Efek obat meliputi efek utama (khasiat) dan efek samping (efekEfek obat meliputi efek utama (khasiat) dan efek samping (efek toksik atau efek lain selain efek utama)
toksik atau efek lain selain efek utama) Tempat aksi Tempat aksi
Mekanisme aksiMekanisme aksi
Kinetika obat meliputi absorpsi, distribusi, Kinetika obat meliputi absorpsi, distribusi, metabolisme danmetabolisme dan ekskresi
ekskresi
Penetapan kadar obatPenetapan kadar obat Pengembangan obat baruPengembangan obat baru
Perbedaan
Perbedaanbioassaybioassaydan bioanalisis adalah:dan bioanalisis adalah:
1.
1. BioassayBioassay : analisa kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa (obat), sediaan: analisa kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa (obat), sediaan obat atau wadah obat dengan melibatkan sistem hayati
obat atau wadah obat dengan melibatkan sistem hayati
2.
2. Bioanalisis: analisa kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa (obat) dalamBioanalisis: analisa kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa (obat) dalam sampel biologis (penetapan kadar obat dalam cairan hayati)
2.1
2.1 Definisi
Definisi
Bioassay
Bioassay (analisis hayati) yaitu: analisa kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa(analisis hayati) yaitu: analisa kuantitatif atau kualitatif suatu senyawa (obat), sediaan obat atau wadah obat
(obat), sediaan obat atau wadah obat dengan melibatkandengan melibatkan sistem hayati.sistem hayati.
Sistem hayati adalah:
Sistem hayati adalah: media hidupmedia hidupyang digunakan untuk analisis hayati.yang digunakan untuk analisis hayati.
Media tersebut bisa berupa: Media tersebut bisa berupa:
1.
1. Hewan utuh (whole animal) atau organ terisolasi (isolated organ)Hewan utuh (whole animal) atau organ terisolasi (isolated organ) pada analisis hayati dengan binatang.
pada analisis hayati dengan binatang. 2.
2. MikroorganismeMikroorganisme 3.
3. Enzim atau antibodi pada Enzim atau antibodi pada reaksi antigen-antibodireaksi antigen-antibodi 4.
4. KulturselKultursel
2.2
2.2 Ruang Lingkup dan Arti Penting
Ruang Lingkup dan Arti Penting
Bioassay
Bioassay
A.
A. Ruang Lingkup
Ruang Lingkup
Bioassay
Bioassay
1.1. Farmakologi dan MikrobiologiFarmakologi dan Mikrobiologi -
- Menentukan Menentukan potensi potensi dan dan efi efi obatobat -
- Keperluan diagnosa 2. Farmakokinetika
- Menetapkan nilai MEC, MTC suatu obat atau MIC (antibiotika)
- Menetapkan nilai parameter farmakokinetika (Vd, Kel, T ½ , Ka, dsbnya)
- Analisis obat di dalam material biologis, bila analisis Fisika Kimia tidak memadai
3. Toksikologi
- Mencari toksisitas obat (obat baru)
- Menetapkan Dosis Toksik (TD-50 atau LD-50, IC-SO)
4. Rancangan Obat (QSAR = Quantitative Structure – Activity Relationship) Meneliti Hubungan Struktur Obat dengan Aktivitas Biologis (untuk menentukan potensi suatu obat)
B. Arti Penting Bioassay
Latar BelakangAnalisis obat dapat dilakukan dengan dua cara yaitu: 1. Fisikokimiawi (F-K)
2. Analisis hayati
Namun analisis secara fisikokimiawi tidak selalu menggambarkan potensi obat, sehingga analisis atau uji hayati lebih menguntungkan. Juga karena adanya beberapa alasan spesifik lain diantaranya:
1. Identitas zat aktif belum jelas (misalnya hormon paratiroid).
2. Struktur kimia diketahui, metode fisikokimia yang memadai belum ada (insulin). Gugus aktif fisikokimiawi belum tentu merupakan gugus aktif biologi/farmakologi.
STRUKTUR KIMIA ?
B ?
A
3. Obat/sediaan merupakan campuran kompleks dengan berbagai struktur dan aktivitas (preparat digitalis).
FK STRUKTUR
KIMIA ?
B
4 1 2
3
analisa fisika kimia tidak memungkinkan (contoh: vitamin D dari minyak ikan masih belum dapat dipisahkan secara murni sehingga belum benar-benar bebas dan kontaminan).
I
K
K
5. Analisa F-K tak mampu membedakan isomer aktif dan tidak aktif sehingga yang ditetapkan merupakan kadar isomer total, jadi hasil analisis F-K tidak menggambarkan aktifitas biologis yang sebenarnya.[contoh: kalsium pantotenat ada dua bentuk isomer dektro (D) dan levo (L) tetapi yang aktif Ca-D-Pantotenat sedangkan bentuk Ca-L-Pantotenat tidak aktif].
6. Untuk beberapa obat analisis hayati lebih spesifik, sensitive dan praktis dibandingkan dengan analisa fisikokimiawi (contoh untuk vitamin B12dan INH)
7. Pada perkembangan QSAR
Metode F-K tidak selalu menggambarkan aktifitas biologis sehingga metode F-K diganti dengan analisis hayati (bioassay).
Disamping memiliki kelebihan, analisis hayati memiliki kekurangan yaitu: 1. Presisi dan akurasinya lebih rendah dibanding analisis secara fisika
kimia, hal ini bisa dilihat dariharga ralat rawu dan ralat sistematiknya 2. Teknik pelaksanaan lebih rumit dan perlu keahlian tertentu
3. Biaya biasanya lebih mahal 4. Waktu pelaksanaan lebih lama
1. Pengendalian variabel pada sisitem hayati untuk menurunkan ralat rawu atau kesalahan acak
2. Penggunaan baku hayati (standard pembanding)
3. Penggunaan rancangan uji yang sesuai misalnya menurut: a. USP
b. Remington’s
3.1 Bioassay Kualitatif
Bioassay kualitatif merupakan cara pemeriksaan kualitatif obat/sediaan obat atau wadah obat (alat-alat infuse, injeksi) dengan memanfaatkan fenomena biologis yang timbul.
Termasuk dalam bioassaykualitatif diantaranya: 1. Uji pirogen
2. Uji sterilitas 3. Uji mikrobia 4. Uji toksisitas
5. Penetapan angka antigen
3.1.1 Uji Pirogenitas
Uji pirogenitas yaitu uji yang dilakukan untuk mengetahui apakah suatu Sediaan Uji Steril bebas pirogen atau tidak
Cara pengujian dengan mengukur peningkatan suhu badan kelinci yang disebabkan penyuntikan intravena sediaan uji steril
Hewan percobaan: kelinci (syarat: seminggu sebelum pengujian tidak menunjukkan penurunan bobot badan)
a. Tiga hari sebelumnya dipakai untuk pengujian pirogenitas, hasil negative.
b. Tiga minggu sebelumnya digunakan untuk pengujian pirogenitas sediaan uji tidak memenuhi syarat.
c. Telah digunakan kapan saja untuk pengujian pirogenitas tetapi respon rata-rata kelompok kelinci melebihi 1,20
Alat:
1. Termometer atau termometer listrik
-ketelitian skala 0,10
- dapat dimasukkan ke dalam rektum kelinci sedalam ±5 cm
2. Alat suntik (terbuat dan kaca atau bahan lain yang cocok, tahan pemanasan pada suhu 250
Sediaan uji :
Dibuat dari zat uji dengan melarutkan atau mengencerkannya menggunakan larutan natrium klorida P steril bebas pirogen atau jika zat uji berupa larutan yang sesuai dapat langsung digunakan.
Pengujian, pengujian meliputi dua tahap yaitu:
1. Pendahuluan hewan uji disuntik dengan larutan NaCl P steril bebas pirogen (10 ml/kgBB, i.v.) 1-3 hari sebelum pengujian. 2. Pengujian Utama: sediaan uji (dihangatkan, ± 38,50 )
3. Disuntikkan perlahan ke dalam vena auricularis tiap kelinci dan dilakukan evaluasi
Penafsiran hasil (penafsiarn hasil dilakukan menurut Farmakope Indonesia Edisis III atau IV). Penafsiran hasil dibedakan untuk:
1. Hewan pencobaan (kelinci) 2. Sediaan uji
Persyaratan penafsiran hasil pembacaan suhu (respon) dibaca sesuai petunjuk dan dibandingkan dengan daftar pada tabel 1.1.
Tabel 1.1. Jumlah
Kelinci
Sediaan uji memenuhi syarat jk jumlah respon tidak
melebihi
Sediaan uji tidak memenuhi syarat jk jmlh respon melebihi 3 6 9 12 1,200 2,800 4,500 6,600 2,700 4,300 6,000 6,600
3.1.2 Uji Sterilitas
Maksud Uji: untuk menetapkan ada tidaknya bakteri, jamur dan ragi/yeast yang hidup dalam sediaan zat yang diperiksa.
Jumlah sampel: kecuali dinyatakan lain digunakan jumlah sampel seperti tertera dalam tabel 1.2.
Tabel 1.2.
Jumlah wadah dalam bets Jumlah bagian sampel < 100
100 – 500 > 500
10% atau 4, diambil yang lebih besar 10
2% atau 20, diambil yang kecil
Sediaan Uji: dibuat menggunakan zat uji sejumlah tertera pada tabel 1.3 atau sisa pada membran penyaring 450 nm yang diperoleh sebagai berikut:
1. Zat uji berupa larutan atau cairan (> 10 ml) atau antibiotika disaring lebih dahulu dengan penyaring membran.
menggunakan pelarut steril yang cocok.
3. Larutan atau suspensi minyak dikocok dahulu dengan pelarut yang cocok, disaring melalui penyaring membran.
Tabel 1.3
Jumlah zat yang diperlukan untuk Jumlah zat uji dalam
wadah Uji kuman Uji jamur dan ragi
Cairan
kurang dari 1 ml Semua isi Semua isi
tidak kurang dari 1 ml
tidak kurang dari 4 ml Separo isi Separo isi
tidak kurang dari 4 ml
tidak kurang dari 20 ml 2 ml 2 ml
lebih dari 20 ml 10% dari isi 10% dari isi Padat
kurang dari 50 mg Semua isi Semua isi
tidak kurang dari 50 mg
tidak lebih dari 200 mg Separo isi Separo isi
lebih dari 200 mg 100 mg 100 mg
Medium Perbenihan (Ada dalam daftar Farmakope Edisi III) Kuman Indikator 1. B. aerob - Bacillus substillis DKBS - Sarcina lutea DKSL 2. B. anaerob: - Bacteoroides vulgatus DKBV - Clostridium sporogenes DKCS
Uji Pendahuluan: (FI ed. III)
o Uji fertilitas medium perbenihan o Uji efektifitas medium penbenihan
Penafsiran Hasil: Zat uji dinyatakan memenuhi syarat sterilitas, jika pada masing-masing tabung tidak terdapat pertumbuhan jasad renik
3.1.3 Uji Mikrobial Uji Batas Jasad Renik
(Bacteriological Test)
Uji dilakukan untuk : menetapkan banyaknya mikroba (jasad renik) aerob hidup yang terdapat dalam zat atau untuk menyatakan zat bebas cemaran jasad renik tertentu.
Pengujian meliputi:
a. Perhitungan banyaknya mikroba aerob dihitung jumlah koloni pertumbuhan bakteri tiap gram atau ml sediaan yang diuji.
b. Pengujian bebas jasad renik meliputi:
Uji bebas Staphyllococcus dan Pseudomonas 1. Uji koagulasi (untuk Staphyllococcus aureus) 2. Uji oksidase (untuk Pseudomonas aeruginosa) Uji bebas Salmonella dan Escherichia coli
Sediaan uji dinyatakan bebas, jika tiap cawan uji tidak menunjukkan tanda-tanda seperti tertera pada persyaratan Farmakope Indonesia ed. III).
i. Uji Toksisitas
Uji toksisitas (ketoksikan) secara umum dibedakan menjadi 2 yaitu: 1. Uji ketoksikan tak khas: uji ketoksikan akut, sub
akut/subkronis, kronis dan uji potensiasi.
2. Uji ketoksikan khas, meliputi: uji keteratogenikan, kemutagenikan, kekarsinogenikan dan uji reproduksi
ii. Uji Ketoksikan Akut
Ketoksikan akut: derajat efek toksik sesuatu senyawa yang terjadi dalam waktu singkat (24 jam).
Takrif: uji ketoksikan sesuatu senyawa yang diberikan atau dipejankan dengan dosis tunggal pada hewan uji tertentu, dan pengamatannya dilakukan selama 24 jam.
Tujuan:
o Untuk menetapkan potensi ketoksikan akut, yakni kisaran dosis
letal atau dosis toksik obat terkait pada 1 jenis hewan uji atau lebih.
o Untuk menilai berbagai gejala toksik yang timbul, adanya efek
toksik yang khas, dan mekanisme yang memerantarai kematian
Data:
o Tolok ukur kuantitatif : kisaran dosis Ietal/toksik,
o Tolok ukur kualitatif: gejala toksik, wujud, mekanisme efek
toksik
Dosis letal tengah (LD-50) atau dosis toksik tengah (TD-50): suatu besaran yang diturunkan secara statistik, guna menyatakan dosis tunggal sesuatu senyawa yang diperkirakan dapat mematikan atau menimbulkan efek toksik
yang berarti pada 50% hewan uji.
Beberapa metode yang digunakan untuk menghitung harga LD-50:
o Metode grafik Lithfield dan Wilcoxon
o Metode kertas garfik probit logaritma (Miller -Tainter) o Metode rata-rata bergerak Thompson-Weil
o Menurut Farmakope Indonesia
Dasar : kekerabatan antara dosis dan % hewan yang menunjukkan respon
Perhitungan harga LD-50 menurut F.l:
Log LD-50 = a - b(Σpi - 0,5)
a : logaritma dosis terendah yang menyebabkan jumlah kematian 100% tiap kelompok
b : beda logaritma dosis yang berurutan.
pi = jumlah hewan yang mati menerima dosis i dibagi dengan jumlah hewan seluruhnya yang menerima dosis i
Syarat :
1. Menggunakan seri dosis dengan pengenceran berkelipatan tetap. 2. Jumlah hewan uji/biakan jaringan tiap kelompok harus sama.
3. Dosis diatur sedemikian rupa sehingga memberikan efek 0 - 100%, perhiitungan dibatasi pada kelompok percobaan yang memberi efek 0-100%
iii. Penetapan Hayati Antigen dan Zat Anti
Antigen: Senyawa asing yang masuk/dimasukkan ke dalam tubuh dan menyebabkan timbulnya respon.
mencit yang memenuhi persyaratan berikut:
Marmut: Sehat, bobot tidak kurang dari 250 g; untuk perc. kulit, digunakan marmut putih atau berwama muda; untuk percobaan Bebas keracunan, bobot tidak lebih dari 350 g.
Mencit: Sehat, bobot tidak kurang dari 17 g dan tidak lebih dari 20 g, umur dan galur seragam.
Syarat umum: hewan belum pernah diberi zat yang dapat mengganggu percobaan
Sediaan baku. Kecuali dinyatakan lain, digunakan baku yang tertera pada baku hayati dan satuan aktivitas
Penetapan hayati (P.H.) antigen (Farmakope Indonesia ed. II) meliputi:
1. P. H. serum antitoksin difteri 2. P.H. serum antirabies
3. P. H. serum antitoksin tetanus
4. P. H. serum antibisa ular monovalen 5. P.H. vaksin cholera
6. P.H. vaksin pertusis 7. P.H. vaksin polio
8. P.H. toksin percobaan Schick
3.2 Bioassay Kuantitatif
Bioassay kuantitatif merupakan cara penetapan potensi obat dengan mengamati efek biologis. Efek biologis ini digolongkan dalam dua bagian besar yaitu respon farmakologis (respon yang terjadi atau mempengaruhi satu system tertentu pada tubuh organisme) dan respon biologis (respon terjadi
atau mempengaruhi pada seluruh tubuh organisme). Contoh respon farmakologis misalnya: efek hipoglikemik insulin, efek isoproterenol pada denyut jantung, efek norepinefrin pada tekanan darah dan efek oksitosin pada kontraksi otot uterus. Contoh untuk respon biologis adalah stimulasi pertumbuhan mikro organisme karena pemberian vitamin.
Pada bab ini akan dijelaskan tentang: 1. Hubungan dosis - respon secara kuantitatif 2. Efek quantal
3. Efek gradual
3.2.1 Hubungan Dosis - Respon
Yaitu: hubungan antara jumlah obat dan besarnya efek (respon) yang ditimbulkan.
Syarat agar dapat dilakukan evaluasi hubungan dosis respon, efek obat harus memiliki 2 sifat yaitu:
o Harus dapat diukur (bila berupa data kualitatif harus diubah ke data
kuantitatif)
o Harus mempunyai nilai Nol pada saat Dosis = 0, sehingga
perubahan dosis dapat diamati perubahan efeknya
Penggambaran kurva:
o Dosis: digambar pada bagian absis (independent variable) o Efek: digambar pada sisi ordmnat (dependent variable)
Setelah pemberian obat:
Efek tergantung waktu dan dosis sehingga efek merupakan fungsi dan keduanya.
E =f(t,D)
Respon farmakologi dapat dibedakan menjadi 2: 1. Graded respon (respon bertingkat)
2. Quantal respon
Respon Bertingkat
- Kenaikan dosis akan menyebabkan kenaikan respon individu secara
teratur (pada satu sistem hayati)
- Dl El D2 E2 DI Ei Dn Emax Emax = 50% respon 2
ED-SO = dosis yang memberikan efek separo dari Emax
Efficacy obat: ukuran kemampuan intrinsik obat untuk menghasilkan efek (kemanjuran obat), penting dalam terapi.
Potency obat:
- Menunjukkan besaran dosis
- kurang penting dalam terapi (Iebih penting efek)
- dipengaruhi oleh proses absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi
Suatu obat kadang memiliki efikasi lebih besar dibanding obat lain tetapi potensinya lebih kecil, namun bisa juga memiliki efikasi dan potensi yang lebih besar dibanding obat lain.
Misal: obat B (obat-obat basa lemah: morfin, digoxin, diazepam) obat A (obat-obat asam lemah: asam salisilat, parasetamol)
Metode pembuatan kurva dosis-respon
Absis Ordinat Bentuk kurva 1 Linier % Emax Hiperbola 2 Linier Absolute Hiperbola
3 Log Absolut Sigmoid
3.2.2 Respon Quantal
Pada respon quantal ada dua kemungkinan: yaitu ada atau tidak ada efek, disebut juga All or None effect dan sistem hayati yang digunakan adalah satu kelompok bukan perindividu. Contoh: uji efek tidur untuk obat golongan Barbiturat, maka yang diperhatikan adalah efek bisa menidurkan atau tidak bisa, intensitas tidurnya tidak diperhatikan, sehingga data yang diperoleh berupa frequensi tidur hewan uji (berapa jumlah hewan uji yang tidur dalam tiap kelompoknya).
Desain penelitian adalah rancangan penelitian yang disusun sedemikian rupa sehingga dapat menuntun peneliti untuk mendapatkan jawaban terhadap pertanyaan penelitian. Desain tersebut memiliki manfaat yaitu: sebagai sarana bagi peneliti untuk memperoleh jawaban terhadap pertanyaan penelitian dan alat bagi peneliti untuk mengontrol atau mengendalikan variabel-variabel yang berpengaruh pada penelitian. Sedangkan hakekat penelitian, merupakan konfirmasi kebenaran hipotesis dalam rangka menjawab pertanyaan yang ada.
Desain penelitian adalah berbagai hal yang akan dilakukan oleh peneliti meliputi:
1. Identiftkasi masalah 2. Rumusan masalah
3. Operasionalisasi hipotesis 4. Cara pengumpulan data 5. Analisis data
Materi-materi yang akan dibahas metiputi:
a. Rancangan penelitian secara garis besar yang dibagi menjadi dua bagian yaitu rancangan observasional dan eksperimental. Ciri-ciri yang membedakan keduanya yaitu, pada rancangan penelitian eksperimental dilakukan:
o Manipulasi variabel
o Monitor perubahan (efek) pada variabel lain
o Pengendalian pengaruh variabel yang tak dikehendaki
non eksperimental dan cara manipulasi subyek penelitian.
o Jenis-jenis variabel pengacau yang berasal dari variabel subyek,
lingkungan, pengukuran dan peneliti.
o Klasifikasi penelitian berdasarkan ruang lingkup penelitian,
berdasar waktu, substansi penelitian, ada dan tidaknya hubungan antar variabel dan desain khusus penelitian.
o Pengantar statistika secara umum, dan metode metode
statistika yang berkaitan erat dengan bidang kesehatan dan farmasi.
c. Pembahasan lebih detil mengenai beberapa rancangan penelitian
o Rancangan sederhana o Cross-over design
o Latyn cross-over design o Analisis probit
Materi yang akan disampaikan meliputi: Sistem Hayati:
o bakteria o ragi (yeast)
o jamur
Obat yang diuji:
o Antibiotika (bactericide, fungicide)
o Vitamin (Vit.B, Ca-Pantotenat, B12, Niasinamid)
Respon:
1. Antibiotika: Kematian mikroorganisme (m.o.) 2. Vitamin: Pertumbuhan mikroorganisme (m.o.)
Bentuk media dan hasil yang diamati:
Lempeng/plate (media padat pada petrie disk): diameter Zone of Inhibition pada media agar.
Tabung/turbidimetri (media cair pada tabung): kejernihan dari media.
Cara Pengujian:
1. Berbagai kadar (antibiotika) a.b. yang diuji (dari konsentrasi rendah ke tinggi)
2. Berbagai kadar a.b. standard (dari konsentrasi rendah ke tinggi) 3. Gunakan:
Kondisi yang sama: suhu (37 0C), lama inkubasi, aerasi
Koloni onganisme yang homogen
4. Ukur diameter zone penghambatan atau tingkat kejernihan pada tiap kadar a.b.
5. Buat Plot Kadar terhadap Respon 6. Tentukan potensi a.b. yang diuji
Metode pengukuran pertumbuhan bakteri :
Metode 1:
Penghitungan Langsung
menggunakan mikroskop yang dikalibrasi yang dihitung jumlah bakteri
tidak membedakan bakteri hidup atau mati
Metode 2:
Penghitungan Sel hidup
aliquot kultur ditumbuhkan pada media padat, diinkubast dan koloni yang hidup dihitung.
yang dihitung jumlah koloni, bukan bakteri.
jumlah koloni dinyatakan sebagai C.F.U. (Colony Forming Units).
Metode 3:
Penghitungan Populasi Bakteri
bakteri dalam suspensi akan menyerap sinar dan intensitas sinar yang lewat akan diukur.
mengukur bakteri hidup dan mati, juga kemungkinan partikel lain.
Waktu pembiakan rata-rata yaitu: waktu yang diperlukan oleh satu seluntuk membelah menjadi sel berikutnya (jadi 2 sel).
Dasar: jika 1 sel bakteri membelah jadi 2, maka jumlah bakten N akan menjadi:
o Generasi pertama N = 1 X 2 = 21 o kedua N = 1 x 2 x 2 = 22 o ketiga N = 1 x 2 x 2 x 2 = 23 o Generasi ke-y N = 1 x 2y = 2y
Jika mula-mula ada N0sel, maka pada generasi ke-y, populasi sel menjadi: N = No x
Log N = Log N0+ Y Log 2 Y = Log N — Log No
0,301
G = T = T x 0,301 G =w Y LogN – Log No
G = waktu pembiakan rata-rata
Hal hal yang harus diperhatikan adalah : 1. Kontaminasi m.o. lain harus dicegah.
2. Sterilisasi alat dan bahan harus sesuai dengan prosedur baku.
3. Digunakan larutan kontrol (tanpa a.b), jika larutan ini menimbulkan hambatan harus dihitung factor koreksi.
5.1 Penetapan Hayati Vitamin
Dasar:
o Mikroorganisme tidak mensintesis vitamin
o Untuk tumbuh secara normal perlu adanya vitamin
Teknik Analisa:
a. Media : sedimikian rupa sehingga tidak mengandung vitamin - Kontrol: tidak ada pertumbuhan
- Uji: ada pertumbuhan sebanding dengan senyawa yang ditambahkan
b. Pengukuran :
- Turbidimetri
- Titrasi, contoh asidimetri
- Senyawa Baku: yang dibandingkan
Contoh:
1. Niasin (Niacinamide) USP;NF
Jasad Renik:
o Lactobacillus plantarum o Non patogen
o Mudah dibiakkan
Media: sederhana dengan komposisi glukosa, gelatin, ekstrak ragi
Senyawa uji: 0,05 - 0,5 μg/tabung
Larutan Uji:
o Perlu ditambah H
2S04 untuk menghidrolisa prekursor
niasin, autoklaf selama 30 menit
o Sisa H2SO4dinetralkan dengan NaOH I N o Pengenceran biasa
Pengukuran : turbidimetri (spektrofotometri)
2. Vitamin
B12- Media: sangat kompleks
Larutan Baku: sianokobalamin
Pengukuran: spektrofotometri
5.2 Penetapan Hayati Antibiotika
Parameter yang menentukan antibiotika (a.b.)
1. Aktivitas/tingkat aktivitas terhadap mikroorganisme pathogen 2. Luas spektrum
3. Bakteriostatika atau bakterisida 4. Resistensi (cepat/lambat)
5. Daya tahan a.b. terhadap enzim bacteria 6. Stabilitas terhadap jaringan binatang 7. Protein binding
8. Farmakokinetika pada hewan uji untuk berbagai jalur pemberian
9. Apakah a.b. mampu mengobati hewan terinfeksi, jika “ya” maka harus ditentukan:
Toksisitas pada hewan uji
Farmakokinetika pada manusia (sukarelawan)
Efek samping:
- sakit pada tempat suntikan - mual, pusing
- simptom lain yang tiadk teramati pada hewan 10. Dicari korelasi:
Farmakokinetika pada hewan dan aktivitas a.b.
5.3 Test Invitro
Meliputi:
1. Rentang dan tingkat aktivitas antimikroba 2. Aksi bakterisida
3. Cross-resistance
4. Resisstance development
5. Pengaruh oleh enzim bakteria (rnsak/berubah) 6. Stabilitas thd. Enzim mamalia
7. Protein binding
Rentang dan tingkat aktivitas antimikroba 1. Pemilihan organisme
2. Pemilihan media kultur
Prinsip:
o Digunakan medium sederhana o Random error/variasi rendah
o Kandungan senyawa pengganggu kecil
MIC dipengaruhi oleh
o PH medium o Kadar Ca o Osmolalitas
3. Evaluasi hasil
Fase I: ada/tidak aktivitas
Fase II: aktivitas dinyatakan dalam MIC untuk organisme tertentu
Penilaian Antibiotika Baru
Faktor-faktor penilaian:
1. Fase-fase evaluasi a.b. baru
2. Parameter yang menentukan manfaat a.b. baru 3. Uji in-vitro
4. Uji in-vivo
5. Uji farmakokinetika pada manusia
Fase-fase Evaluasi Antibiotika Baru
A. Fase I (Skrining Primer)
Seleksi a.b. potensial, sebagian besar senyawa dibuang
Uji in-vitro menggunakan m.o. patogen (standar) Bakteria: 1. Staphylococcus aureus 2. Escherichia ccli 3. Proteus mirabilis 4. Pseudomonas aeruginosa Fungi: 1. Candida albicans 2. Aspergillus niger 3. Micmspcrum canis
Aktivitas: sembarang (tidak ada kriteria khusus)
PenetapanCross-resistance
B. Fase II (Skrining Sekunder)
Senyawa yang masuk nominasi diteliti lebih lanjut
Fase I diulang secara lebih terperinci
Organisme:
- dari isolat klinik
Hasil test positif, indikasi a.b. potensial Penetapan luas spektrum a.b.
PenetapanCross-resistance
Hasil test dinyatakan sebagai MIC pada species tertentu
C. Fase III (Uji Toksisitas)
Bisa dimulai sebelum Fase II selesai,
Senyawa yang lolos Fase II diuji meluas, dengan berbagai species binatang.
Indeks terapi cukup besar akan lolos seleksi.
Besaran dosis ditentukan dengan farmakokinetika pada uji menggunakan binatang
D. Fase IV (Farmakokinetika pada Manusia)
Dari Fase III: dapat diperkirakan besaran dosis, frekuensi pemberian dan jalur pemberian.
Alasan: Farmakokinetika pada hewan kurang akurat meramalkan farmakokinetika pada manusia.
E. Fase V (Percobaan Klinik)
Persiapan percobaan klinik ada pada Fase IV
Penetapan hayati dengan hewan percobaan bisa dilakukan dengan hewan utuh maupun dengan mengambil bagian khusus dari hewan uji (organ terisolasi). Kelebihan penggunaan hewan utuh dibanding organ terisolasi yaitu:
• Pada hewan utuh (whole animal) memberikan overall/net effect dari
suatu obat karena obat tetah mengalami penistiwa
o Absorpsi o Distribusi o Metabolisme o Ekskresi
Seperti halnya saat digunakan pada manusia.
• Faktor koreksi karena perbedaan kondisi percobaan diharapkan tidak
terlalu besar. Penggunaan organ terisolasi juga memiliki keuntungan dibanding uji dengan hewan utuh:
• efek obat bisa langsung pada tempat sasaran
Materi yang akan disampaikan meliputi:
1. Jenis-jenis hewan uji, dan persyaratan untuk hewan uji yang bisa digunakan dalam percobaan.
Syarat-syarat Media Hidup:
Hewan Utuh: strain dan jenis kelamin sama, berasal dari biakan murni, berat badan seragam.
Organ Terisolir: berasal dan satu binatang, biakan murni dan persyaratan lain sama dengan hewan utuh.
Mikroorganisme : dipilih yang sesuai dengan tujuan penelitian; berasal dari biakan murni; satu strain; pembiakan., pemeliharaan dan penyimpanan memenuhi standar baku.
Alternatif Biakan Murni:
Diketahui asal usulnya Bersumber dan satu induk
Sebelum digunakan untuk pengujian hewan uji harus dikondisikan selama kira-kira 2 minggu dan diamati perkembangan :
kesehatan hewan uji
pertumbuhan hewan uji (korelasi umur dengan berat badan) pertambahan berat badan rata-rata (± 10 %)
suhu badan normal (± 1 0C) tinja normal (tidak ada parasit)
Jenis-jenis hewan uji yang sering digunakan dalam percobaan: 1. Mencit 2. Tikus 3. Marmot 4. Kelinci 5. Merpati 6. Kucing 7. Anjing 8. Domba
2. Persyaratan pemeliharaan meliputi kandang, pakan, minum dan cara penanganan hewan uji
Kandang :
ukuran dan jenis bahan harus disesuaikan dengan hewan uji
bahan plastic, sifat ringan dan mudah dipindahkan
alas kandang bisa berupa grajen, kawul atau sekam padi
alas sebaiknya diganti tiap 3 hari sekali
jumlah hewan uji tiap kandang harus proporsional, jangan sampai berdesakan
Pakan :
komposisi komponen penyusun harus disesuaikan dengan syarat ideal pertumbuhan masing-masing hewan uji
jumlah dan jenis makanan juga harus disesuaikan
contoh:
Mencit jenis makanan pelet (5-7 gram sehari)
Minuman :
direbus lebih dulu
jumlah cukup
wadah dibersihkan minimal 3 hari sekali
Penanganan hewan uji:
Hewan uji harus diperlakukan dengan lembut dan penuh kasih sayang untuk mencegah stress
Kucing, kelinci, marmot dipegang pada bagian tengkuk
Tikus dan mencit dipegang pada ekor
Berat badan ideal untuk percobaan:
Mencit : 20 - 40 g Tikus : 150 - 250 g Marmot : 300 - 500 g Kelinci : 1,5 - 2,5kg Kucing : > 2,5 kg Merpati :100 – 200 g Anjing :10 – 16 kg
3. Pemilihan hewan uji untuk percobaan, alasan pemilihan dan cara pengorbanannya
Pemilihan hewan uji:
Kesesuaian atau kesamaan dengan manusia: misalnya susunan saluran pencernaan, susunan kulit, sisitem enzim atau fungsi lain.
Kepraktisan dipandang dari sisi analisis dan ekonomis: meliputi jumlah dan harga.
Ekstrapolasi hasil harus mempertimbangkan adanya variasi antar spesies
Faktor penyebab variasi antar spesies:
a. Fase Absorbsi
- waktu transit (lama waktu pengosongan lambung) - pH tempat absorbsi (saluran cerna)
- keadaan makanan (puasa atau tidak) - microbial
- aliran darah
- jenis hewan (carnivore atau herbivore) b. Fase Distribusi
- aliran darah organ - koefisien partisi - derajat ionisasi
- ikatan obat dengan protein plasma c. Fase Metabolisme
- aliran darah organ - defisiensi enzim d. Fase Ekskresi
- aliran darah organ - pH urin
Cara pengorbanan hewan uji:
- secara kimiawi, menggunakan eter, C02, pentobarbital - secara fisik, dislokasi leher
4. Contoh-contoh uji hayati menggunakan hewan utuh
GLUKAGON
Pengukuran peningkatan kadar gula darah pada kucing: sehat, dipuasakan atau dianesthesi
Pemberian secara intravena
“alternating dosis” sampel dan standard
DIGITALIS (Tanaman, Digitalis purpurea) Prinsip:
o Glikosida kardioaktif terdiri atas: digitosin dan gitoxin
o Saponin like glicosides: golongan digitonin tetapi hampir tidak
mempunyai efek pada jantung.
digitoflavin
digitophyllin
lipid dan karbohidrat
o Glikosida kardioaktif: mempunyai struktur kimia dan aktivitas
farmakodinamika yang sama, tetapi berbeda pada:
potensi
absorpsi di saluran gastro intestinal.
onset dan durasi
o Prosedur:
hewan uji: digunakan merpati teranesthesi
cara pemberian: infus, intravena
akhir penetapan: matinya merpati karena berhentinya denyut jantung
(evaluasi: sejumlah obat (dosis tertentu) yang menyebabkan kematian merpati)
o Kerugian dan keterbatasan metode
1. Pada percobaan pemberian secara oral, sedangkan pada pasien secara oral sehingga kemungkinan terjadi perbedaan dosis atau efek
TUBOCURARIN CHLORIDE INJEKSI Prinsip:
Relaksasi otot sketet
Hewan uji: kelinci, obat diberikan secara intravena
Data: Head-drop (paralisis dan otot skelet leher)
CHORIONIC GONADOTROPIN Prinsip:
Gonad stimulating
Hewan uji: tikus betina
Pemberian: injeksi subkutan setiap hari selama 3 hari
Data: peningkatan bobot uterus
HEPARIN (SODIUM) Prinsip uji:
Anticoagulant
Media uji: darah domba
Metoda: penambahan heparin pada plasma darah
Data: penghambatan terjadinya clot(penjendalan)
PROTAMIN SULFAT Prinsip:
Netralisasi heparin
Media uji: darah domba
Invitro pada plasma yang mengandung jumlah tertentu heparin
COD LIVER OIL (VITAMIN D) Prinsip:
Anti rachitic
Hewan uji: tikus rachitis
Pemberian: ½ dosis total pada hari pertama 1/2 sisanya dalam 3-4 hari
Materi yang akan disampaikan meliputi :
1. Kelebihan dan kekurangan uji dengan organ terisolasi Kelebihan:
Efek obat lebih spesifik untuk suatu organ
Dapat diketahui letak atau jenis reseptornya Kelemahan:
Tidak 100% menggambarkan keadaan in-viva karena: a. tidak ada supply darah ke organ
b. system faali berubah (enzim, syaraf)
c. bila teknik preparasi kurang cermat hasil tidak valid karena timbul variabel baru yang tak terkendali, misalnya: larutan garam fisiologis tidak sesuai, kurang oksigenasi, preparasi organ terlalu lama sehingga banyak sel yang mati, suhu tidak sesuai
2. Jenis-jenis larutan fisiologis untuk uji
Beberapa contoh garam fisiologis yang digunakan untuk uji menggunakan organ terisolasi:
a. Frog ringer, digunakan untuk jaringan amfibi b. Krebs ringer, digunakan untuk jaringan mamalia c. Tyrode solution, digunakan untuk jaringan intestine d. Locke ringer, digunakan untuk otot jantung
e. Solutio de Jalon, digunakan untuk jaringan uterus
3. Prinsip preparasi jaringan secara umum dan prinsip kerja a. Prinsip prosedur penetapan
- preparasi jaringan
- perlakuan dan pencatatan respon - pengolahan data
- evaluasi dan pengambilan kesimpulan
b. Prinsip preparasi jaringan secara umum
hewan uji dikorbankan secara fisik, dan diletakkan pada papan fiksasi, dibuka badannya, dan diambil organ atau jaringan yang diperlukan
preparat dibersihkan dari jaringan lain yang tidak dikehendaki
pencucian jaringan:
menggunakan larutan fisiologis yang sesuai
over flow, larutan sekali pakai dan langsung dibuang
intestine, jaringan sangat lunak sehingga harus hati-hati untuk menghindari penekanan mekanik
perlu diperhatikan alat-alat yang digunakan karena jaringan sensitive terhadap logam (Cu, Mg dan Fe) sehingga disarankan digunakan stainless steel, platina atau yang lain
organ diikat dengan benang dan dipasang pada kait yang tersedia
penting untuk diperhatikan, temperature dan aliran gas untuk menjaga kondisi organ tetap baik
c. Jenis-jenis jaringan yang sering digunakan untuk uji organ terisolasi yaitu: thoracic aorta pada kelinci, ileum, trachea marmot, fundus stripdari tikus dan jantung terisolasi dari kelinci
pengertian sempit yaitu merupakan analisis obat dalam cairan hayati atau sampel biologis. Sampel biologis ini ada karena adanya uji hayati baik uji hayati kualitatif maupun kuantitatif, sehingga antara bioassay dan bioanalisis sesungguhnya tidak bisa benar-benar dipisahkan.
9.1 Definisi Dan Ruang Lingkup
Bioanalisis
Bioanalisis merupakan analisis baik secara kualitatif maupun kuantitatif suatu bahan obat maupun sediaan obat dalam s ampel biologis.
1) Bioanalisis kualitatif
Bioanalisis kualitatif merupakan analisis suatu bahan obat maupun sediaan obat dalam sampel biologis yang berdasarkan ciri atau sifat fisika kimia senyawa. Disini tidak dihitung jumlahnya atau ditetapkan kadarnya, namun lebih ditekankan pada pemeriksaan untuk mengetahui keberadaan senyawa yang diinginkan.
2) Bioanalisis kuantitatif
Bioanalisis kuantitatif merupakan analisis suatu bahan obat maupun sediaan obat dalam sampel biologis yang didasarkan pada keberadaan senyawa, dengan cara melakukan penetapan kadarnya. Sehingga bisa diketahui besarnya senyawa dan bisa dinyatakan secara kuantitatif.
3) Bioanalisis dalam percobaan in-vivo
Percobaan in-vivo dilakukan menggunakan subyek uji secara utuh baik pada penelitian pre-klinik (menggunakan hewan uji utuh) atau uji klinik pada sukarelawan sehat ataupun pasien. Percobaan bisa meliputi uji farmakologi, farmakokinetika, toksikologi, uji bioekivalensi, uji klinik dari fase I sampai IV, monitoring obat, pengembangan dan modifikasi struktur maupun pengembangan formulasi obat.
Obat dimasukkan ke dalam tubuh subyek uji (di dalam tubuh makhluk hidup), untuk dilihat efeknya atau pengaruh tubuh terhadap obat, dan sampel biologis bisa berupa sampel darah, urin, saliva, biopsi jaringan, organ atau sampel yang lain tergantung jenis percobaan yang dilakukan.
4) Bioanalisis dalam percobaan in-vitro
Percobaanin-vitro merupakan percobaan yang dilakukan diluar tubuh makhluk hidup, tetapi media yang digunakan tetap berasal dari tubuh makhluk hidup yang diambil dari bagian tertentu. Bisa berupa darah, kultur sel, atau organ terisolasi (jantung, usus, otot trachea dan sebagainya).
Pada percobaan in-vitro perlu keahlian khusus dan pengalaman agar diperoleh hasil yang valid, perlu latihan bagaimana untuk preparasi organ, bagaimana menjaga kondisi agar organ tetap berfungsi, medium apa yang cocok untuk digunakan dalam kultur sel, bagaimana komposisi medium yang sesuai harus diperhatikan dengan seksama.
Penanganan sampel juga tidak kalah rumit dibanding sampel dari pencobaan in-vivo, masing-masing memiliki karaktenistik tersendiri
9.2 Arti Penting Bioanalisis
1) Dasar penelitian biomedik dan farmasetikPenelitian biomedik dan farmasetik akan menghasilkan sampelsampel biologis, pengetahuan tentang penanganan sampel mulai saat pengumpulan, penyimpanan maupun saat dilakukan analisis sangat penting dimiliki oleh peneliti.
2) Pengembangan obat baru
Penelitian untuk pengembangan obat baru akan melibatkan uji-uji farmakologi, toksikologi, farmakokinetika, mungkin juga uji mikrobiologi dan uji lain yang dibutuhkan, jelas kesemuanya membutuhkan pengetahuan tentang bioanalisis, karena memang akan ada banyak sampel biologis yang dihasilkan.
3) Studi bioavailabilitas dan bioeqivalensi
Studi bioavailabilitas dan bioeqivalensi tidak akan terlepas dari penetapan kadar obat dalam sampel bialogis terutama darah dan unin. Disini bioanalisis kuantitatif memiliki peran besar. Dari hasil penetapan kadar obat dalam darah dan unin maka akan dilakukan perhitungan untuk mengetahui harga parameter-parameter farmakokinetika dari satu obat atau lebih yang akan dibandingkan dengan parameter farmakokinetika obat standar. Dan hasil evaluasi akan diketahui apakah obat bioeqivalen atau tidak, memiliki bioavailabititas yang sama atau tidak antara obat uji dengan obat standar. Penelitian ini berkaitan erat dengan pengembangan formulasi karena formulasi obat akan sangat menentukan bagaimana proses absorbsi, yang selanjutnya akan berpengaruh pula pada proses distribusi, metabolisme dan juga ekskresi obat.
4) Penyalahgunaan obat dan farmasi forensik
Pada kasus penyalahgunaan obat dan farmasi forensic yang berkaitan dengan kasus-kasus criminal biasanya yang lebih berperan adalah bioanalisis kualitatif bukan kuantitatif. Sebagai contoh bila ada seseorang yang keracunan obat, akan diutamakan pemeriksaan yang bersifat kualitatif untuk menentukan jenis obatnya, berapa lama obat digunakan sehingga dapat ditentukan tindakan yang tepat untuk menangani keracunan tersebut. Bukan berapa jumlah obat yang digunakan atau berapa jumlah obat yang terdapat dalam tubuh, karena hal ini disamping sulit untuk diketahui juga tidak akan bermanfaat untuk penanganan pasien.
Sampel-sampel biologis dari suatu uji harus segera mendapatkan penanganan yang tepat supaya diperoleh hasil yang baik dan valid. Apabila penanganan sampel terlambat atau tidak tepat, kemungkinan besar sampel akan mengalami kerusakan atau perubahan yang tentunya akan mempengaruhi hasil analisanya atau penetapan kadarnya. Bila hal ini terjadi tentu saja akan berakibat fatal, karena jelas akan mempengaruhi hasil evaluasi yang mana kesimpulan yang diambil akan dijadikan dasar pijakan untuk membuat kebijakan. Sebagai contoh penetapan kadar obat jantung dalam darah seorang pasien untuk suatu uji farmakokinetika. Dari uji ini akan diperoleh kadar obat dalam darah pada berbagai waktu, kemudian akan dihitung harga parameter-parameter farmakokinetika obat tersebut. Selanjutnya akan dievaluasi berdasarkan harga parameter farmakokinetika yang diperoleh apakah perlu dilakukan perubahan dosis untuk si pasien. Apabila terjadi kesalahan dalam penetapan kadar obat tentunya akan terjadi kesalahan pula dalam pengambilan keputusan tersebut, hal mana akan sangat menentukan kelangsungan hidup jiwa pasien karena penetapan dosis yang salah bisa mengakibatkan kematian pasien.
Penanganan sampel awal seharusnya memenuhi cara penanganan sampel yang baik, sehingga diharapkan dapat meminimalkan kesalahan. Penanganan ini meliputi saat pengumpulan atau pengambilan, penyimpanan dan pengangkutan sampel serta pengembangan metode analisis yang sesuai. Sebagai contoh metriphonate dan dichlorvos dalam sampel darah dapat mengalami kerusakan yang cepat, hal ini bisa dicegah lewat pengasaman langsung dengan penambahan asam phosphor. Terjadinya dekomposisi diamorphine dalam plasma juga harus menjadi perhatian. Obat ini juga akan mengalami deasetilasi dalam larutan basa membentuk
6-monoacetilmorphine dan selanjutnya membentuk morphine. Untuk mencegah degradasi tersebut disarankan agar sampel disimpan pada suhu 40C, pembekuan sampel plasma sesegera mungkin dan esktraksi cair-cair untuk mencegah kesalahan analisis selanjutnya dalam studi pharmakokinetik heroin.
10.1Penanganan Awal Sampel-Sampel Biologis
1) Denaturasi proteinObat dalam sampel biologis berada bersama-sama dengan senyawa lain terutama protein, karena obat akan berikatan dengan protein plasma untuk didistribusikan, sehingga harus dilakukan pemisahan. Proses pemisahan bisa dilakukan dengan cara denaturasi protein, bisa dengan penambahan asam, misalnya TCA 10% (trichloro acetic acid) atau dengan pemanasan pada suhu tertentu. Perlu diperhatikan adalah pengaruh bahan yang digunakan atau pemanasan terhadap obatnya, karena bisa mengakibatkan perubahan struktur kimia atau kerusakan. Jadi harus dipilih bahan yang cocok atau metode denaturasi yang sesuai.
Denaturasi protein bisa dilakukan dengan mengatur pH medium, misalnya menggunakan asetonitril. Setelah plasma dicampur dengan asetonitril dengan volume yang sebanding, larutan dijenuhkan dengan sodium bisulfate atau sodium klorida, maka protein akan mengendap dan obat terpisah berada dalam fase atas. Bisa juga dilakukan dengan enzim proteolitik yang sesuai. Misalnya enzim subtilisin bisa mendenaturasi protein plasma dengan baik.
2) Ekstraksi pelarut untuk senyawa hidrofobik
Senyawa hidrofobik merupakan senyawa tidak suka air, sehingga harus dipertimbangkan bagaimana sifat senyawa pengekstraksi, apakah berupa pelarut organic atau anorganik. Apalagi jika pelarut yang digunakan untuk ekstraksi lebih dari satu, maka harus dipilih kombinasi yang tepat sehingga dihasilkan komposisi pelarut yang dapat mengektraksi secara efektif dan efisien. Artinya jumlah pelarut sesedikit mungkin, tetapi dapat menghasilkan senyawa terekstraksi sebanyak mungkin.
3) Liofilisasi
Kestabilan senyawa kimia sangat dipengaruhi oleh sifat fisika-kimianya, apalagi jika berada dalam sampel biologis, oleh sebab itu diperlukan penanganan tepat agar tidak terjadi kerusakan. Salah satu upayanya adalah dengan melakukan liofilisasi (pembekuan), yaitu dengan menyimpan sampel pada suhu dibawah 0 0C lazimnya -20 0C , -70 0C atau dalam nitrogen cair. Suhu yang dipilih biasanya tergantung jenis sampel dan lama penyimpanan yang diinginkan.
4) Hidrolisis konjugat
Hidrolisis konjugat diperlukan bila senyawa yang akan kita analisis dalam bentuk terkonjugasi dengan senyawa lain. Macam senyawa penghidrolisis bisa berupa enzim atau senyawa kimia biasa, hal ini sangat tergantung pada jenis ikatan konjugasi dan proses pembentukannya.
5) Derivatisasi kimia sebagai pendahuluan ekstraksi
Proses derivatisasi diperlukan jika senyawa sulit untuk diisolasi, tetapi akan lebih mudah bila berada dalam bentuk derivatnya. Untuk membentuk derivatnya tentu diperlukan suatu senyawa spesifik yang harus ditambahkan sehingga bereaksi dan dapat mengubah struktur kimia senyawa
awal menjadi derivatnya. Pemilihan senyawa apa yang harus ditambahkan dan kondisi bagaimana yang harus dipenuhi, tentunya diperlukan pengetahuan khusus dan juga pengalaman untuk mengerjakanya. Harus pula diketahui proses reaksi dan mekanismenya, sehingga tidak keliru membentuk senyawa lain.
6) Prosedur ekstraksi dan prinsip pengukuran untuk obat dan metabolitnya
Ekstraksi padat-cair dan cair-cair
Metode kromatografi, spektroskopi dan radiokimia dalam bioanalisis kualitatif dan kuantitatif (review)
Metode difusi
Metode turbidimetri
Bioantografi
B. Metode non-tradisional
Metode pembahan permeabilitas membran pada yeast
Enzim memiliki sifat khas, yang biasanya sangat dipengaruhi oleh perubahan pH, temperatur dan hanya bekerja pada kondisi yang sesuai sehingga memerlukan penanganan khusus. Enzim juga hanya bereaksi untuk senyawa tertentu atau bekerja spesifik. Kapasitas kerja enzim biasanya berbanding lurus bila konsentrasi kecil, tetapi suatu saat akan mencapai maksimum, kapan hal ini terjadi, tentunya dipengaruhi juga substrat yang digunakan.
b. Enzim ammobil
Enzim merupakan senyawa yang labil dan mudah rusak, padahal manfaatnya sangat besar dalam kehidupan. Untuk mengatasi hal tersebut dilakukan usaha agar enzim bersifat lebih stabil, yaitu dengan membuat mikroba menjadi termofilik (dengan asumsi karena enzim dihasilkan oleh mikroba, sehingga diharapkan mikroba yang tahan panas juga akan menghasilkan enzim yang tahan panas) atau dibuat bentuk ammobil dengan cara memerangkap enzim tersebut dalam suatu bahan khusus.
Bentuk enzim ammobil ini memiliki beberapa keuntungan antara lain: enzim lebih stabil, bisa digunakan berkali-kali dan mudah dipisahkan dari produk. Ada beberapa cara yang bisa dilakukan untuk membentuk enzim amobil:
1. Adsorpsi, enzim ditempelkan pada pembawa yang bersifat inert, misalnya CaSO4, Bentonit atau Tanah Lempung
2. Enzim ditempelkan pada carier melalui ikatan ionic, enzim diatur bermuatan negative atau positif dengan mengatur pH pelarutnya, contoh: Dietil Amino Etil yang bermuatan positif
pembawa, ikatan ini cukup kuat dan stabil, contoh: glutaraldehide 4. Dibuat ikatan kovalen antar system, ikatan ini juga kuat,
menggunakan pereaksi gluraldehide
5. Penjebakan atau trapning. Enzim dijebak dalam suatu matrik, biasanya berupa poliakrilamid yang dibuat bersilang-silang dengan senyawa lain sehingga berbentuk jaring. Cara ini banyak dipilih juga untuk amobil sel, terlebih bila sel pathogen karena ikatan sangat kuat.
6. Membuat bentuk kapsul, enzim diliputi dengan bahan tertentu missal karagen atau pati sehingga berbentuk kapsul, banyak digunakn juga untuk trapping sel tanaman
Cara a dan b biasanya mudah bocor, tetapi kemungkinan terjadi penurunan aktivitas kecil. Sedangkan cara c dan d ikatan kuat, namun karena enzim bekerja pada ruang yang spesifik maka ada kemungkinan terjadi perubahan bentuk sehingga bisa terjadi penurunan aktivitas. Cara e lebih banyak dipilih karena ikatan cukup kuat dan aktivitas relative konstan, namun juga memiliki kelemahan yaitu sewaktu pembuatan matrik timbul panas yang kemungkinan bisa mendenaturasi enzim.
c. Penggunaan enzim dalam bioanalisis
Enzim memiliki fungsi sebagai biokatalis, bisa dimanfaatkan dalam proses isolasi dan purifikasi senyawa-senyawa yang diinginkan dalam berbagai sampel biologis. Enzim bisa digunakan juga dalam terapi misalnya pepsin, papain dan renin untuk membantu pencernaan, asparaginase sebagai
antikanker, lisosim sebagai antibakteri dan β-glukoronidase untuk pengobatan
Problem utama analisis obat dalam cairan hayati adalah untuk misahkan obat dan material endogen sebanyak mungkin. Kemudahan sampel untuk dianalisis akan meningkat seiring tingkat fluidisitasnya, cairan serebrospinal biasanya merupakan cairan yang paling mudah untuk ditangani, sementara darah total adalah yang paling sulit (tabel X.1). Untuk meningkatkan fluiditasnya, senyawa berbentuk padatan atau semipadat untuk analisis bisa dilakukan secara mekanik (tabel 10.2). Prosedur ini mungkin berpengaruh pada sampel dalam beberapa metode yang digunakan yang bisa berakibat berubahnya konsentrasi obat dalam sampel (efek temperature, pembentukan khelat logam tertentu, dan hidrolisis konjugat) dan beberapa bagian penanganan menjadi lebih sulit (penyabunan, emulsifikasi dan rupture sel). Pelarut yang digunakan sebagai media bersifat kritis dan masing-masing memiliki keuntungan dan kerugian. Kemudahan ekstraksi obat dalam larutan anorganik ke pelarut organik akan bergantung pada pelarut yang digunakan, dan umumnya dilakukan dengan kombinasi polaritas pelarut pengekstraksi.
1. Darah
Darah, merupakan cairan biologis yang paling kompleks, dikoleksi dari subyek atau hewan uji. Darah terdiri atas cairan buffer encer yang mengandung protein terlarut (solubilized proteins), lemak dan padatan terlarut
(dissolved fats and solids), dan sel tersuspensi, untungnya, kandungan utamanya yaitu sel darah merah (erythrocytes) dapat dipisahkan dari cairan encer (plasma)
ditangani, sel dapat pecah atau rusak dan menyebabkan komponen-komponen yang tak diharapkan dan menjadikan keadaan makin sulit. Contohnya, ion feri dilepaskan oleh eritrosit mungkin akan membentuk khelat dengan senyawa analit dan mengakibatkan ekstraksi yang kurang baik dari fase air.
Tabel X.1. Daftar Sampel Biologis Bergantung pada Fluiditasnya dalam Kaitannya dengan Tingkat Kemudahan Analisisnya (Chamberlain,1 995)
Tingkat Fluiditas Jenis Sampel Biologis - Cairan serebrospinal - Air mata - Keringat - Ludah -Urin Cairan - Empedu - Plasma - Serum - Darah Campuran - Feses - Otak
- Jantung, Ginjal dan Hepar - Pam, Otot
Padatan
- Tulang
Sel bisa pecah karena pemanasan atau pembekuan, atau oleh factor mekanik seperti pengadukan, tetapi umumnya akibat perubahan kekuatan ion disekeliling cairan karena penambahan air, menghasilkan osmosa karena sel bengkak dan pecah (swell and rupture) sehingga perlu penambahan larutan garam isotonis untuk mengubah volume sampel darah utuh.
Ekstraksi umumnya bukan dari darah total, tetapi disiapkan sebagai serum atau plasma. Serum diperoleh dengan cara sentrifugasi langsung atau pengendapan sel darah merah tanpa penambahan antikoagulan, kemudian diambil supernatannya sehingga masih mengandung faktor penjendalan darah. Sedangkan plasma diperoleh dengan menambahkan antikoagulan dalam darah, disentrifugasi dan diambil supernatannya. Plasma maupun serum mengandung protein dalam jumlah besar yang harus dipisahkan dari analit bila akan diperiksa.
2. Urin
Urin, berbeda dengan plasma atau serum, biasanya bebas dari protein atau lemak sehingga bisa diekstraksi langsung dengan pelarut organic. Meskipun begitu, urin memiliki banyak variasi komposisi dan sangat tergantung pada jenis makanan yang dikonsumsi. Normalnya senyawa yang ditemukan dalam urin adalah larut air, sedangkan sebagian besar obat larut lipid sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut yang cocok.
Kesulitan dalam pengumpulan sampel urin adalah volume urin yang benar yang diproduksi selama interval waktu sampling, bukan pada penetapan kadarnya. Jumlah analit diperoleh dengan mengalikan volume konsentrasinya. Sampel urin juga sering memberikan hasil negative palsu misalnya pada pemeriksaan kreatinin.
Urin juga memiliki variasi pH yang lebar, dipengaruhi oleh konsumsi makanan atau obat-obatan. Penggunaan antasida misalnya, kemungkinan bisa menyebabkan urin menjadi basa. Asam kuat tidak besar pengaruhnya, pH urin normal berkisar 5,5 - 7.
3. Feses
Penanganan sampel feses cukup rumit, mengingat bentuknya semipadat dan juga berupa campuran sisa-sisa proses pencernaan maupun senyawa-senyawa sisa proses metabolisme tubuh. Harus dipikirkan pengambilan cuplikan yang tepat dan juga jenis pelarut yang cocok karena banyaknya senyawa yang terkandung, apalagi jika kadar analit dalam sampel kecil.
4. Sampel biologis lain
Sampel biologis yang lain bisa berupa air susu, cairan serebrospinal, empedu, ludah dan lain-lain, masing-masing memiliki kekhasan sifat dan kandungan senyawa yang berbeda. Kelarutan obat dalam tiap larutan juga berbeda sehingga pemilihan pelarut harus dilakukan secara cermat.
Studi Epidemiologi dan Evaluatif, Ed. III, diterjemahkan oleh Akhid, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
2. Chamberlain, J.,1995, The Analysis of Drugs in Biological Fluids 2nd Ed, CRC Press, New York
3. Departemen Kesehatan RI, 1972, Farmakope Indonesia, Ed. II, Jakarta 4. Departemen Kesehatan RI, 1979, Farmakope Indonesia, Ed. III, Jakarta 5. Departemen Kesehatan RI, 1995, Farmakope Indonesia, Ed. IV, Jakarta 6. Ecobichon, D.J., 1997, The Basis of Toxicity Testing, 2nd ed. CRC Press,
New York
7. Gad S.C., and Chengelis C. P., 1998, Acute Toxicology Testing, 2nd ed Academic Press, San Diego California
8. Hasan, I., 2002, Pokok-Pokok Materi Statistika 1, Statistika Deskriptif, Ed. II., PT. Bumi Aksara, Jakarta
9. Hasan, I., 2002, Pokok-Pokok Materi Statistika 2, Statistika Inferensif, Ed. II., PT Bumi Aksara, Jakarta
10. Hugo W B, dan Russel, A. D., 1987, Pharmaceutical Microbiology 4th ed, BSP- London
11. Matteis 0. F., and Smith L.L., 1995, Molecular and Cellular Mechanism of Toxicity, CRC Press, London
12. Pratiknya, A.W.,1993, Dasar-Dasar Metodologi Penelitian Kedokteran dan Kesehatan, PT. Radja Grafindo Persada, Jakarta
13. Rossi G.V., 1980, Biological Testing, in Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th ed
14. Robyt, J.F., dan White, B.J., 1987, Biochemical Techniques, Theoty and Practice,
Brooks/Cole Publishing Company, California
