Jeruk merupakan komoditas buah yang paling banyak diimpor di Indonesia. Berdasarkan data dari Direktorat Jenderal Hortikultura (2013) nilai impor jeruk Indonesia mencapai US $ 227.300.473. Jeruk impor lebih diminati konsumen karena memiliki kriteria yaitu warna yang menarik, kulitnya mudah dikupas, rasanya segar dan hampir tidak mempunyai biji (seedless). Jeruk Siam Simadu merupakan jeruk Siam lokal yang hampir mendekati kategori tipe jeruk yang sesuai dengan kriteria konsumen dan pasar dunia untuk dikonsumsi dalam keadaan segar tetapi mempunyai biji yang relatif banyak yaitu lebih dari 15 biji per buah sehingga kalah bersaing dengan jeruk impor (Husni et al. 2010).
Perbaikan kualitas jeruk lokal yang sudah memiliki rasa dan warna yang sesuai dengan kriteria konsumen dan pasar dapat dilakukan dengan merakit tanaman jeruk lokal tersebut memiliki buah jeruk seedless. Jeruk Siam (Citrus nobilis Lour) termasuk dalam kelompok jeruk dengan jumlah kromosom 2n=2x=18. Menurut Wu dan Mooney (2002), metode yang paling efektif untuk mendapatkan tanaman jeruk seedless atau triploid (2n=3x=27) yaitu dengan cara menyilangkan tanaman jeruk tetraploid (2n=4x=36) dengan tanaman jeruk diploid (2n=2x=18).
Tanaman jeruk tetraploid dapat dihasilkan dengan perlakuan kolkisin. Menurut Takahira et al. (2011), kolkisin dapat digunakan untuk menggandakan jumlah kromosom. Kolkisin dapat menghambat pembentukan dan aktivitas benang-benang spindle pada saat pembelahan sel mitosis serta mencegah inti dan sel membelah sehingga jumlah kromosom sel mengganda (Ascough et al. 2008). Menurut Dhooghe et al. (2011), penggandaan jumlah kromosom menggunakan kolkisin sangat tergantung pada konsentrasi kolkisin yang diberikan, lama perendaman, dan jenis eksplan.
Gmitter et al. (1991) berhasil mendapatkan tanaman jeruk tetraploid Orlando Tangelo dengan menggunakan eksplan ovul yang diberi perlakuan kolkisin 0.1% selama 21 hari. Berdasarkan penelitian Zeng et al. (2006), perlakuan kolkisin 0.1% diberikan selama 4 hari pada kalus embrionik dapat menghasilkan tanaman jeruk tetraploid Frost (Citrus sinensis Osbeck). Aleza et al. (2009) dapat memperoleh tanaman jeruk tetraploid varietas Clemenules dengan pemberian kolkisin 0.1% selama 3 jam pada penyambungan tunas pucuk.
Perumusan Masalah
Jeruk Siam Simadu merupakan jeruk Siam lokal yang hampir mendekati kategori tipe jeruk yang sesuai dengan kriteria konsumen dan pasar dunia untuk dikonsumsi dalam keadaan segar. Buah jeruk ini mempunyai biji yang banyak yaitu lebih dari 15 biji per buah sehingga kalah bersaing dengan jeruk impor. Perbaikan kualitas jeruk lokal yang sudah memiliki rasa dan warna yang sesuai dengan kriteria konsumen dan pasar
2
dapat dilakukan dengan merakit tanaman jeruk lokal tersebut memiliki buah seedless.
Metode yang efektif digunakan untuk mendapatkan tanaman jeruk seedless atau triploid (2n=3x=27) yaitu dengan cara menyilangkan tanaman jeruk tetraploid (2n=4x=36) dengan tanaman jeruk diploid (2n=2x=18). Tanaman jeruk tetraploid dapat dihasilkan dengan perlakuan kolkisin. Kolkisin dapat digunakan untuk menggandakan jumlah kromosom dengan cara menghambat pembentukan dan aktivitas benang-benang spindle pada saat pembelahan sel mitosis serta mencegah inti dan sel membelah. Penggandaan jumlah kromosom menggunakan kolkisin sangat tergantung pada konsentrasi kolkisin yang diberikan, lama perendaman, dan jenis eksplan.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan planlet jeruk Siam Simadu tetraploid yang akan dijadikan sebagai tetua untuk menghasilkan jeruk Siam Simadu seedless.
Manfaat Penelitian
Planlet jeruk Siam Simadu tetraploid yang diperoleh akan digunakan sebagai tetua untuk merakit tanaman triploid melalui persilangan dalam upaya mendapatkan buah jeruk Siam Simadu seedless.
Ruang Lingkup Penelitian
Rangkaian percobaan dilakukan untuk menjawab tujuan dari penelitian (Gambar 1). Terdapat tiga percobaan yang dilaksanakan dari bulan Januari 2013 sampai Agustus 2013 di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB- BIOGEN), Cimanggu, Bogor serta Laboratorium Micro Technique Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB. Percobaan 1 adalah induksi tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin. Percobaan 2 adalah induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin. Percobaan 3 adalah induksi tetraploid embrio somatik jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin. Tiga set percobaan dilakukan untuk mendapatkan planlet jeruk Siam Simadu tetraploid.
3
Gambar 1 Bagan Alir kegiatan penelitian induksi tetraploid jeruk Siam Simadu menggunakan kolkisin secara in vitro
2 TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman JerukJeruk (Citrus sp) adalah tanaman buah tahunan yang berasal dari Asia. Menurut Spiegel-Roy dan Goldschmidt (1996), China di percaya sebagai tempat pertama kali jeruk tumbuh. Sejak ratusan tahun yang lalu, jeruk sudah tumbuh di Indonesia baik secara alami maupun yang dibudidayakan. Jeruk yang ada di Indonesia didatangkan dari Amerika dan Italia oleh orang Belanda (Khan 2007). Daerah-daerah yang terkenal sebagai daerah pusat jeruk di Indonesia diantaranya Garut (Jawa Barat), Tawamangu (Jawa Tengah), Batu (Jawa Timur), Tejakula (Bali), Selayar (Sulawesi Selatan), Pontianak (Kalimantan Barat), Brastagi (Sumatera Utara) dan Soe (Nusa Tenggara Timur) (Martosupono et al. 2007).
Berbagai jenis jeruk banyak dijumpai dan dibudidayakan di Indonesia mulai dari dataran rendah hingga dataran tinggi. Beberapa jenis jeruk tersebut telah menjadi unggulan daerah maupun nasional seperti jeruk manis Pacitan dari daerah Pacitan, Jawa Timur; jeruk manis Waturejo dari Jawa Tengah; keprok SoE dari Nusa Tenggara Timur; Keprok Batu 55 dari Batu, Jawa Timur; Siam Madu, Keprok Maga, dan Beras Sitepu dari Medan, Sumut; Siam Pontianak dari Kalimantan Barat; dan Pamelo Nambangan, Sri
Percobaan 1 Induksi tetraploid tunas pucuk jeruk
Siam Simadu Perlakuan konsentrasi kolkisin : 0%, 0.1%, 0.2%, dan 0.3% Lama perendaman 3 jam
Analisis tingkat ploidi
Planlet jeruk Siam Simadu tetraploid Percobaan 2
Induksi tetraploid tunas samping jeruk
Siam Simadu
Percobaan 3 Induksi tetraploid
embrio somatik jeruk Siam Simadu
Perlakuan konsentrasi kolkisin : 0%, 0.1%, 0.2%, dan 0.3% Lama perendaman 6 jam Perlakuan konsentrasi kolkisin : 0%, 0.1%, 0.2%, dan 0.3% Lama perendaman 1 jam
4
Nyonya, serta Magetan dari Magetan, Jawa Timur (Martasari dan Mulyanto 2008).
Jeruk merupakan sumber vitamin C yang sangat baik. Jus jeruk mengandung asam askorbat 20-60 mg per 100 ml. Vitamin lain yang tak kalah penting adalah vitamin A, tiamin, niasin, riboflavin, asam pantotenat, biotin, asam folat, inositol, dan tokoferol. Kandungan vitamin A berkisar antara 250-420 IU, tiamin 70-120 μg,asam folat 1.2 μg, dan inositol 135 mg setiap 100 ml jus (BB Pascapanen 2009).
Jeruk Siam Simadu
Salah satu varietas atau jenis jeruk yang banyak disukai oleh masyarakat adalah jeruk Siam. Jenis jeruk ini banyak disukai masyarakat karena rasanya yang lebih manis dibanding jeruk keprok. Jeruk Siam dan jeruk keprok sulit dibedakan karena mempunyai aroma daun yang sama, ukuran bunga dan buah yang hampir sama (Badan Litbang Pertanian 2005).
Nama ilmiah jeruk siam adalah Citrus nobilis, dinamakan jeruk siam karena berasal dari Siam (Thailand) (Deptan 1994). Klasifikasi botani tanaman jeruk adalah sebagai berikut:
Divisi : Spermatophyta Sub Divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Ordo : Rutales Famili : Rutaceae Subfamili : Aurantioidae Genus : Citrus
Spesies : Citrus nobilis Lour
Jeruk siam memiliki ciri khas yang tidak dimiliki jeruk keprok lainnya karena mempunyai kulit yang tipis sekitar 2 mm, permukaannya halus dan licin, mengkilap serta kulit menempel lebih lekat dengan dagingnya. Dasar buahnya berleher pendek dengan puncak berlekuk. Tangkai buahnya pendek, dengan panjang sekitar 3 cm dan berdiameter 2.6 mm. Biji buahnya berbentuk ovoid, warnanya putih kekuningan dengan jumlah sekitar 20 biji. Daging buahnya lunak dengan rasa manis dan harum. Bobot buah cukup berat dengan berat per buah sekitar 75.6 g. Satu pohon rata-rata menghasilkan sekitar 7.3 kg buah. Panen biasanya dapat dilakukan pada bulan Mei – Agustus (Deptan 1994).
5 Jeruk Siam Simadu (Gambar 2) berasal dari Sumatra Utara. Jeruk ini memiliki rasa yang manis sedikit asam, ukuran buah sedang, warna daging buah oranye, warna kulit buah kekuningan, dan tumbuh di dataran rendah yaitu kurang dari 1200 mdpl (Balitjestro 2013). Ketinggian tempat penanaman berpengaruh jelas terhadap rasa. Penanaman di atas 900 dpl menyebabkan rasa buah jeruk siam menjadi sedikit asam (Deptan 1994).
Buah Jeruk Tanpa Biji (Seedless)
Seedless adalah merupakan sifat buah yang memiliki sedikit biji. Menurut Khalil et al. (2011) jeruk dapat dikatakan seedless jika memiliki biji kurang dari 5 biji per buah.Sifat seedless tersebut dapat diperoleh secara alami pada beberapa jenis tanaman yang mempunyai kemampuan membentuk buah dengan biji yang sangat sedikit tanpa adanya penyerbukan dan pembuahan yang disebut dengan buah partenokarpi (Frost dan Soost 1968; Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996). Sifat tersebut merupakan sifat yang mempunyai nilai ekonomi tinggi pada tanaman jeruk karena merupakan karakter yang harus dimiliki buah jeruk konsumsi segar agar dapat bersaing di pasar global (Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996; Cai et al. 2007). Sifat tersebut juga merupakan salah satu objek penelitian yang banyak dilakukan pada program pemuliaan tanaman jeruk, baik secara konvensional maupun non konvensional (Nicotra 2007).
Metode yang paling efektif untuk mendapatkan tanaman jeruk tanpa biji atau triploid (2n=3x=27) yaitu dengan cara menyilangkan tanaman jeruk tetraploid (2n=4x=36) dengan tanaman jeruk diploid (2n=2x=18) (Wu dan Mooney 2002; Grosser dan Chandler 2004; Reforgiato Recupero et al. 2005). Menurut Aleza et al. (2009), metode yang paling efektif untuk mendapatkan tanaman jeruk triploid adalah dengan cara menyerbuki putik kultivar tetraploid dengan pollen yang berasal dari varietas diploid. Tanaman jeruk tetraploid dibutuhkan untuk menghasilkan buah jeruk tanpa biji.
Perkembangan Penelitian Tanaman Jeruk Tetraploid
Tanaman jeruk tetraploid dapat dihasilkan dari 1) pembibitan nuselus secara spontan (Barrett dan Hutchison 1978), 2) perlakuan kolkisin pada meristem aksilar (Barrett 1974), 3) persilangan jeruk 2x × 4x (Cameron dan Soost 1969), 4) variasi somaklonal yang terjadi secara spontan pada kultur jaringan (Vardi 1981; Zhang 1985), dan 5) melalui hibridisasi somatik (Kobayashi dan Ohgawara 1988; Grosser dan Gmitter 1990). Perlakuan kolkisin banyak digunakan untuk menghasilkan tanaman jeruk tetraploid karena cepat dan mudah.
Gmitter et al. (1991) berhasil mendapatkan tanaman jeruk tetraploid Orlando Tangelo dengan menggunakan eksplan ovul yang diberi perlakuan kolkisin 0.1% selama 21 hari. Mirza et al. (2003) melakukan poliploidisasi pada empat kultivar embrio jeruk dengan menggunakan kolkisin 0.01% dan 0.10%. Berdasarkan penelitian Zeng et al. (2006), perlakuan kolkisin 0.1% diberikan selama 4 hari pada kalus embrionik dapat menghasilkan tanaman
6
jeruk tetraploid Frost (Citrus sinensis Osbeck). Aleza et al. (2009) dapat memperoleh tanaman jeruk tetraploid varietas Clemenules dengan pemberian kolkisin 0.1% selama 3 jam pada penyambungan tunas pucuk.
Induksi Mutasi Kromosom dengan Mutagen Kimia
Pada dasarnya evolusi tanaman terjadi karena mutasi yang terus menerus di alam. Oleh karena itu banyak yang beranggapan bahwa keragaman yang ada sekarang terutama disebabkan oleh mutasi (Lubis 2005). Mutasi adalah perubahan pada materi genetik suatu organisme yang terjadi secara tiba-tiba, acak, dan merupakan dasar bagi sumber variasi yang bersifat terwariskan (heritable). Mutasi dapat terjadi secara spontan (spontaneous mutation) dan dapat juga terjadi melalui induksi (induced mutation). Secara mendasar tidak terdapat perbedaan antara mutasi yang terjadi secara alami dan mutasi hasil induksi. Keduanya dapat menimbulkan variasi genetik untuk dijadikan dasar seleksi tanaman, baik seleksi secara alami (evolusi) maupun seleksi buatan (pemuliaan) (BATAN 2005). Menurut Crowder (2006) mutasi adalah suatu proses dimana suatu gen mengalami perubahan struktur. Dalam arti luas, mutasi dihasilkan dari segala macam tipe perubahan bahan genetik yang mengakibatkan perubahan penampakan fenotipe yang diturunkan yang bukan dihasilkan dari proses seksual. Batasan ini termasuk keragaman kromosom dan position effect maupun mutasi gen.
Bahan mutagen dapat secara kimia dan fisik. Mutasi fisik bersifat sebagai radiasi pengion (ionizing radiation) yang dapat melepas energi (ionisasi), begitu melewati atau menembus materi. Mutagen fisika termasuk diantaranya sinar-X, radiasi gamma, radiasi beta, neutrons, dan partikel dari akselerator sudah umum digunakan dalam pemuliaan tanaman. Mutagen kimia pada umumnya berasal dari senyawa alkyl (alkylating agents) misalnya seperti ethyl methane sulphonate (EMS), diethyl sulphate (DES), methyl methane sulphonate (MMS), hydroxylamine, nitrous acids, acridines, dan sebagainya. Beberapa mutagen kimia penting lainnya ialah gas metan, asam nitrat, kolkisin, digitonin, hidroksil amin, akridin, etil etan sulfonat (EES), 5-bromo urasil, 2-aminopurin.
Tanaman jeruk mempunyai jumlah kromosom 2n = 2x = 18, melalui perlakuan kolkisin diharapkan terjadi ploidisasi kromosom untuk menghasilkan tanaman jeruk Siam Simadu tetraploid. Kolkisin adalah suatu alkaloid yang dihasilkan oleh tanaman krokus (Colchicum autumnale, L.) yang banyak ditanam di Eropa, India, dan Afrika Utara (Snustad et al. 1997). Lama waktu perendaman dan konsentrasi kolkisin akan mempengaruhi terjadinya poliploidi. Poliploidi adalah keadaan suatu individu yang memiliki lebih dari dua set kromosom (Welsh 1991; Snustad et al. 1997; Griffiths et al. 1999). Poespodarsono (1988) melaporkan bahwa kepekaan masing-masing spesies tanaman terhadap perlakuan kolkisin sangat berbeda. Rumus kimia kolkisin adalah C22H25O6N dan merupakan senyawa alkaloid
yang mudah larut dalam air dan digunakan dalam konsentrasi rendah (Gambar 3).
7
Gambar 3 Struktur kimia kolkisin (Matthew 1998)
Mitosis Sel Somatik
Mitosis merupakan pembelahan sel somatik. Setiap sel yang membelah secara mitosis akan menghasilkan dua sel baru yang jumlah kromosom dan kandungan genetiknya identik dengan sel asal (Sastrosumarjo et al. 2006). Kolkisin merupakan inhibitor mitosis karena dapat mengikat tubulin (suatu protein), konstituen utama mikrotubula. Mikrotubula mempunyai fungsi dalam pembentukan benang spindle pada mitosis. Kolkisin dapat menghambat pembentukan dan aktivitas benang- benang pembelahan pada saat mitosis, dimana pada tahap metafase kromosom tidak bergerak ke arah dua kutubnya tetapi tetap berada di daerah ekuator bahkan dapat kembali mengganda (Strickberger 1985).
Kolkisin dapat menyebabkan jumlah ploidi yang dihasilkan sel berbeda dengan normalnya karena adanya perubahan jumlah kromosom. Perubahan tersebut dapat karena komposisi molekul DNA suatu gen atau pada benang kromatinnya. Perlakuan kolkisin dalam waktu yang makin lama bisa menghasilkan pertambahan genom sebagai suatu deret ukur seperti 4x, 8x, 16x dan seterusnya (Brewbaker 1983). Ciri-ciri fisik tunas poliploid yang umum adalah meningkatnya ukuran sel, laju pertumbuhan sel lambat, daun lebih tebal, bunga lebih besar dan sedikit, buah lebih besar, serta menurunnya fertilitas pada berbagai tingkat dibandingkan dengan tunas diploid (Griffith et al. 1999).
Kolkisin adalah senyawa antimitotik. Setiap organisme mempunyai respons yang berbeda terhadap pemberian perlakuan kolkisin. Jika konsentrasi larutan kolkisin dan lamanya waktu perlakuan kurang mencapai keadaan yang tepat, maka poliploidi belum dapat diperoleh. Konsentrasi terlalu tinggi akan menyebabkan kematian pada tanaman (Suryo 2007). Menurut Welsh (1991) bahwa setiap tanaman memiliki ambang batas maksimum untuk tingkat ploidinya, apabila melebihi batas tersebut umumnya tanaman tidak normal, lemah atau tidak dapat hidup. Toleransi setiap sel tanaman terhadap perlakuan kolkisin berbeda-beda.
8
3
METODE
Kegiatan penelitian dilaksanakan dari bulan Januari 2013 sampai Agustus 2013. Tempat pelaksanaan penelitian in vitro dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), Cimanggu, Bogor. Uji sitologi dilakukan di Laboratorium Micro Technique, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini terdiri atas tiga percobaan yaitu Induksi tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin, Induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin, dan Induksi tetraploid embrio somatik jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin.
Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan Induksi tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin yaitu Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) satu faktor yaitu konsentrasi kolkisin. Konsentrasi kolkisin yang diberikan yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3%. Setiap perlakuan diulang sebanyak lima kali, satu ulangan terdiri atas dua tunas pucuk jeruk yang ditanam dalam satu botol. Tunas pucuk direndam pada larutan perlakuan kolkisin 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3% selama tiga jam.
Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan Induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin yaitu Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) satu faktor yaitu konsentrasi kolkisin. Konsentrasi kolkisin yang diberikan yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3%. Setiap perlakuan diulang sebanyak sepuluh kali, satu ulangan terdiri atas dua tunas samping jeruk yang ditanam dalam satu botol. Tunas pucuk direndam pada larutan perlakuan kolkisin 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3% selama enam jam.
Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan Induksi tetraploid embrio somatik jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin yaitu Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) satu faktor yaitu konsentrasi kolkisin. Konsentrasi kolkisin yang diberikan yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3%. Setiap perlakuan diulang sebanyak lima kali, satu ulangan terdiri atas lima embrio somatik jeruk yang ditanam dalam satu botol. Embrio somatik direndam pada larutan perlakuan kolkisin 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3% selama satu jam.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan yaitu tunas pucuk, tunas samping, dan embrio somatik fase globular in vitro jeruk Siam Simadu (Gambar 4). Bahan media yang digunakan adalah media dasar Murashige-Skoog (MS), vitamin MS, vitamin Morel and Wetmore (MW) dan ekstrak malt (EME) 0.5 g L-1. Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah IBA (Indole 3-Butyric Acid), TDZ (Thidiazuron) dan NAA (Naphthalene Acetic Acid). Bahan mutasi yang digunakan yaitu kolkisin C22H25O6N (SIGMA). Bahan untuk analisis
9 sitologi yang digunakan yaitu Aceto orcein 2%, 8-hydroxyquinolin 0.002 M, HCL 1.0 N, CH3COOH 45%, cat kuku bening dan aquades.
Gambar 4 (1) Tunas pucuk, (2) tunas samping, dan (3) embrio somatik fase globular (kanan) in vitro jeruk Siam Simadu
Alat
Peralatan yang digunakan yaitu gelas ukur, labu takar, erlenmeyer, gelas piala, pipet volumetrik, magnetic stirer, spatula, hot plate, botol kultur, corong, timbangan analitik, pH meter, autoclave, oven, Laminar Air Flow Cabinet, cawan petri, lampu bunsen, pinset, hand sprayer, pisau, gunting, shaker, milipore 0.20 µm, jarum suntik, pensil, silet, cover glass, gelas arloji, dan mikroskop Olympus BX51.
Prosedur Analisis Data
Analisis data menggunakan uji F. Apabila hasil uji F berbeda nyata, maka dilakukan uji lanjut DMRT (Duncan’sMultiple Range Test) pada taraf nyata 5%. Pengolahan data menggunakan program Statistic Analysis System (SAS 9.1.3 portable). Penghitungan tebal daun, jumlah kloroplas pada sel penjaga (guard cell), kerapatan stomata, ukuran stomata, dan jumlah kromosom dengan menggunakan microsoft office excel serta dihitung rata- rata dan standar deviasinya.
Pelaksanaan Percobaan
Pembuatan larutan kolkisin dilakukan dengan cara melarutkan kolkisin ke dalam aquades steril, pH larutan tersebut diukur hingga 5.6. Larutan kontrol merupakan aquades steril yang diukur pH hingga 5.6. Sterilisasi larutan kolkisin dan kontrol menggunakan milipore 0.20 µ m di dalam laminar.
Pembuatan media dilakukan dengan cara menimbang hara makro MS, hara mikro MS, vitamin MW, vitamin MS dan zat pengatur tumbuh (IBA, TDZ, dan NAA) sesuai dengan takaran, lalu dibuat larutan stok dengan jumlah volume tertentu. Setiap satu liter media dibuat dengan cara mencampurkan larutan stok hara makro MS dan hara mikro MS menggunakan pipet. Campurkan vitamin ke dalam larutan tersebut. Tambahkan zat pengatur tumbuh apabila digunakan. Gula pasir sebanyak
10
30 g L-1 ditambahkan pada campuran larutan stok. Apabila media yang dibuat menggunakan EME 0.5 g L-1, maka ditambahkan ke dalam campuran larutan stok. Aquades ditambahkan sampai volume campuran larutan stok mencapai hampir 1 liter. Campuran larutan stok diukur pH hingga 5.8. Campuran larutan stok ditambahkan 2.5 g L-1 phytagel sebagai pemadat. Campuran larutan stok dimasak dan terus diaduk sampai mendidih. Media campuran tersebut dimasukkan ke dalam botol-botol sebanyak 25 ml per botol lalu ditutup dengan alumunium foil. Alumunium foil penutup botol diberi kode, kemudian media disterilisasi dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 121 oC. Media yang telah disterilisasi disimpan di ruang media pada suhu 16 oC.
Planlet (tunas pucuk dan tunas samping) dan embrio somatik jeruk Siam Simadu diletakkan dalam ruang gelap selama satu malam kemudian diletakkan kembali ke ruang terang pada pukul 07.00. Perlakuan kolkisin dilakukan pada pukul 09.00. Hal ini dilakukan agar perlakuan kolkisin tepat diberikan saat pembelahan mitosis terjadi sehingga dapat menghambat pembentukan benang-benang spindle serta mencegah inti dan sel membelah sehingga jumlah kromosom sel mengganda.
Percobaan I. Induksi Tetraploid Tunas Pucuk Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.) Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
Induksi tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu menggunakan kolkisin secara in vitro dilakukan dengan cara merendam tunas tanpa daun pada larutan perlakuan kolkisin yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3% yang disterilisasi dengan milipore selama 3 jam. Tunas yang telah diberi perlakuan kolkisin kemudian dibilas dengan aquades steril dan dikeringkan dengan kertas saring lalu ditanam pada media recovery (MS + vitamin MW + EME 0.5 g L-1) dan diletakkan dalam ruang terang selama dua minggu kemudian disubkultur ke media pertumbuhan (MS + vitamin MW) dan diletakkan dalam ruang terang. Induksi akar dilakukan dengan menggunakan media MS + vitamin MS + IBA 3 ppm dan media MS + vitamin MS + NAA 3 ppm. Pengamatan yang dilakukan adalah LD50
(Lethal Dose), pertambahan tinggi tunas, jumlah buku, jumlah daun baru yang terbentuk, panjang, lebar dan tebal daun (diukur pada bagian tengah daun), panjang akar, jumlah akar, dan analisis stomata (jumlah kloroplas, kerapatan stomata, serta ukuran panjang dan lebar stomata pada sel penjaga) Analisis stomata dilakukan dengan memotong daun. Bagian atas daun diletakkan pada gelas arloji dan ditetesi aquades. Bagian atas daun dikerok dengan hati-hati menggunakan silet sampai menghasilkan lapisan yang tipis. Lapisan tipis daun yang dihasilkan kemudian dibalik dan ditetesi aquades secukupnya lalu ditutup dengan cover glass. Sekeliling cover glass diberi cat kuku bening dan dikeringkan. Preparat diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x 100. Pengamatan dilakukan pada lima bidang pandang yang dipilih secara acak.
11 Percobaan II. Induksi Tetraploid Tunas Samping Jeruk Siam Simadu
Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
Induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam Simadu menggunakan kolkisin secara in vitro dilakukan dengan cara merendam tunas samping tanpa daun pada larutan perlakuan kolkisin yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3% yang disterilisasi dengan milipore selama 6 jam. Tunas yang telah diberi perlakuan kolkisin kemudian dibilas dengan aquades steril dan dikeringkan dengan kertas saring lalu ditanam pada media recovery (MS + vitamin MW + EME 0.5 g L-1) dan diletakkan dalam ruang terang selama dua minggu kemudian disubkultur ke media pertumbuhan(MS + vitamin MS + TDZ 0.2