BAB I I I
M ETODE PENELI TI AN
Penelitian ini dilakukan secara in silico di Laboratorium Bioinformatika Kampus FMIPA Universitas Indonesia. Peralatan yang dibutuhkan antara lain seperangkat komputer dengan processor intel dual core 2.1 GHz dengan kapasitas memori 3 GB dan operating system windows XP profesional yang dilengkapi dengan akses internet. Software yang digunakan pada penelitian ini adalah berupa
software bioinformatika baik offline maupun online.
3.1 Persiapan Neuraminidase Virus I nfluenza A (H5N1) 3.1.1 Pencarian Sekuen Neuraminidase
Sekuen neuraminidase Influenza A H5N1 diunduh dari database NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kemudian dilakukan multiple sequence
aligment dengan menggunakan program online ClustalW2. Hasil aligment
dengan nilai tertinggi akan digunakan sebagai neuraminidase target.
3.1.2 Pencarian Struktur Tiga Dimensi Neuraminidase Virus I nfluenza A (H5N1)
Pencarian struktur tiga dimensi dilakukan dengan menggunakan program online SWISS-MODEL yang diakses melalui website
http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=show_workspace dengan cara memasukkan file FASTA yang diunduh dari NCBI. Penentuan sekuens asam amino peptida didasarkan pada sifat asam amino yang memiliki perananan pada sisi aktif neuraminidase. Visualisasi sisi aktif enzim dilakukan dengan menggunakan software offline MOE 2008.10.
3.2 Persiapan Ligan
Ligan yang akan digunakan terlebih dahulu dirancang dengan menggunakan
software ACD/labs dengan format penyimpanan MDL Molfile. Setelah itu, format
26 Universitas Indonesia 3.3 Molecular Docking
3.3.1 Preparasi File Docking
Preparasi file docking dilakukan dengan mengoptimasi geometri dan minimisasi energi struktur tiga dimensi ligan dan neuraminidase menggunakan
software MOE 2008.10 yang dijalankan pada single computer dual core.
3.3.1.1 Optimasi Geometri dan M inimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi Neuraminidase
Proses optimasi geometri dan minimisasi energi neuraminidase dilakukan dengan software MOE 2008.10. Tahap awal dilakukan penambahan atom hidrogen dan protonasi dengan menggunakan fungsi protonate3D. Setelah itu, dilakukan pengaturan muatan parsial dengan menggunakan partial charge,
dengan parameter method yang digunakan adalah current force field. Selanjutnya, dilakukan minimisasi energi dengan force field MMF94x, solvasi yang digunakan adalah gas phase, dan RMS gradient NFDOǖPRO3DUDPHWHU\DQJODLQQ\D menggunakan default dan file output dalam format .moe.
3.3.1.2 Optimasi Geometri dan M inimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi Ligan
Optimasi ligan dilakukan pada MOE database viewer (dv) dengan format mdb. Proses optimasi diawali dengan melakukan wash pada seluruh ligan. Kemudian dilakukan pengaturan muatan parsial ligan menggunakan partial
charge, dengan parameter method yang digunakan adalah MMFF94x. Solvasi
yang digunakan selama proses optimasi ligan adalah dalam bentuk gas phase. Setelah itu, dilakukan proses minimisasi energi dengan RMS gradient 0.001 NFDOǖPRO3DUDPHWHU\DQJODLQQ\DPHQJJXQDNDQdefault dan file output dalam format .mdb.
3.3.2 Docking antara Neuraminidase dengan Ligan
Proses docking dilakukan dengan software MOE 2008.10. Tahap ini diawali dengan preparasi file docking dan memilih residu asam amino yang menjadi target
Universitas Indonesia Setelah preparasi selesai, dilakukan docking dengan program simulation-dock.
Placement method yang digunakan adalah triangle matcher dengan jumlah
putaran 1000. Fungsi scoring yang digunakan adalah London dG dengan menampilkan data terbaik sebanyak 100. Selanjutnya dari 100 tampilan data terbaik tersebut dilakukan pengukuran ulang (refinement) dengan menggunakan
refinement force field dengan konfigurasi ukuran pengulangan populasi sebesar
1000 sesuai dengan default MOE. Tampilan hasil keseluruhan proses docking yang dipilih adalah 1 data terbaik. Parameter lainnya sesuai dengan default dari MOE dan file output dalam format .mdb.
3.4 Analisis Docking
3.4.1 1LODL(QHUJL%HEDV,NDWDQ ¨*binding)
Energi bebas ikatan hasil docking dilihat pada output dalam format mdb. Kompleks ligan-enzim yang dipilih adalah kompleks yang memiliki nilai energi bebas ikatan terendah untuk kemudian dilakukan analisis lebih lanjut.
3.4.2 Uji Toksisitas
Uji toksisitas dilakukan terhadap hasil analisis docking ligan yang memiliki ǻ*binding yang rendah dan interaksi yang baik dengan target enzim analisis drug
scan dilakukan dengan membandingkan ligan terbaik hasil docking dengan
analisa sifat toksikologi. Parameter yang akan dilihat antara lain prediksi tingkat karsinogenesitas dan mutagenesitas dari ligan tersebut dengan menggunakan beberapa software baik online maupun offline seperti ToxTree, Osiris Property
Explorer, ACDLabs dan FAF-drugs.
3.4.3 I katan Hidrogen dan Kontak Residu
Ikatan hidrogen yang terjadi pada kompleks ligan-enzim terbaik hasil
docking diidentifikasi dan dianalisis dalam media tiga dimensi dengan
menggunakan software MOE 2008.10. Format file input yang digunakan untuk identifikasi dan analisis adalah mdb.
Kontak residu kompleks ligan-enzim hasil docking diidentifikasikan dan kemudian dilakukan visualisasi dengan menggunakan software MOE 2008.10
Universitas Indonesia pada program ligan interaction. Format file input yang digunakan untuk
identifikasi dan analisis adalah moe.
3.5 Simulasi Dinamika M olekul
3.5.1 Preparasi File Simulasi Dinamika M olekul
Preparasi file simulasi dinamika molekul dilakukan optimasi geometri dan minimisasi energi struktur tiga dimensi peptida siklis dengan menggunakan
software MOE 2008.10 yang dijalankan pada single computer Intel Pentium Dual Core. Optimasi geometri partial charge kompleks enzim-ligan dilakukan dengan
parameter method yang digunakan adalah current forcefield. Selanjutnya dilakukan minimisasi energi dengan forcefield MMFF94x, solvasi yang digunakan adalah born dan RMS gradient 0.05 kkal/mol Å. Parameter yang lainnya menggunakan default dan file output dalam format .moe.
3.5.2 Proses Simulasi Dinamika M olekul
Proses simulasi dinamika molekul terhadap ligan inhibitor, dilakukan dengan software MOE2008.10 program simulation-dynamics. Parameter yang digunakan sesuai dengan default pada simulation-dynamics yaitu ensemble NVT (N : jumlah atom; V: volume; T: temperatur) dengan algoritma NPA. Parameter lainnya sesuai dengan default pada simulation-dynamics. Selanjutnya, dilakukan analisis hasil dinamika kompleks enzim inhibitor berdasarkan pada hasil
perhitungan simulasi dinamika molekul. Penentuan waktu kestabilan konformasi kompleks enzim terhadap pelarut dilakukan selama 100 picosecond pada tahap inisialisasi. Simulasi dilakukan selama 5000 picosecond. Pada temperatur 310 K (kondisi temperatur tubuh normal pada manusia) dan 312K (kondisi temperatur demam pada manusia).
3.5.3 Visualisasi I nteraksi Kompleks Enzim-Ligan
Visualisasi interaksi antara ligan dengan enzim setelah kompleks enzim-ligan terbentuk dilakukan dengan menggunakan software MOE 2008.10.
26 Universitas Indonesia BAB I V