Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman dan rumah kaca Cikabayan, IPB, mulai Juni 2013 sampai Desember 2014.
Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanaman padi sehat sebagai sumber bakteri endofit, media agar dan cair untuk isolasi serta pertumbuhan bakteri endofit, isolat X. oryzae pv. oryzae patotipe IV, benih padi sehat varietas Ciherang, media tanam, bahan untuk analisis ekspresi gen PR1 dan PBZ1, bahan untuk pengujian aktivitas enzim peroksidase, primer universal untuk identifikasi bakteri endofit, serta alat dan bahan untuk uji Gram dan pewarnaan endospora.
Metode
Pengambilan Sampel Tanaman Padi untuk Isolasi Bakteri Endofit
Pengambilan sampel tanaman padi dilakukan di tiga lokasi berbeda yang mewakili 3 tipe sawah di Indonesia, yaitu lahan sawah tadah hujan, lahan sawah irigasi, dan lahan sawah rawa pasang surut. Sampel tanaman padi yang diambil merupakan tanaman sehat yang berada diantara tanaman padi yang terserang penyakit hawar daun bakteri. Lokasi pengambilan sampel untuk lahan sawah tadah hujan dilakukan di dua lokasi yaitu di Desa Widodomartani, Kecamatan Ngemplak dan Desa Harjobinangun, Kecamatan Tratas, Kabupaten Sleman, Yogyakarta. Pengambilan sampel untuk lahan sawah irigasi dilakukan di Desa Gempol Sari, Kecamatan Patok Beusi, Kabupaten Subang, Jawa Barat. Lokasi pengambilan sampel terakhir adalah di Desa Karang Indah, Kecamatan Mandastana, Kabupaten Barito Kuala, Kalimantan Selatan.
Isolasi Bakteri Endofit
Isolasi bakteri endofit dilakukan mengikuti metode yang digunakan Munif et al. (2012) dengan sedikit modifikasi pada bagian sterilisasi sampel. Bagian akar, batang, dan daun padi secara terpisah dipotong dan dicuci dengan air mengalir, kemudian dikeringanginkan. Sebanyak 1 g sampel akar dan batang disterilisasi permukaan dengan alkohol 70% selama 1 menit, direndam dalam NaOCl 3% yang dicampur 0.05% Tween 20 selama 2.5 menit, dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Sebanyak 1 g sampel daun disterilisasi permukaan dengan cara direndam pada alkohol 70% selama 30 detik, NaOCl 3% yang dicampur 0.05% Tween 20 selama 2 menit, dan dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali. Sebelum digerus, masing-masing sampel digoreskan pada media nutrient agar (NA) (3 g beef extract, 5 bacto peptone, 15 agar, dan akuades sampai dengan
1 L) sebagai kontrol. Sterilisasi permukaan dianggap berhasil apabila kontrol tidak ditumbuhi oleh koloni bakteri.
Akar, batang, dan daun digerus secara terpisah dengan mortar dan ditambahkan 9 mL larutan fisiologis (0.85% NaCl). Ekstrak akar, batang dan daun diencerkan sampai pengenceran 10-4. Sebanyak 0.1 mL ekstrak dari pengenceran 10-3 dan 10-4 disebar pada media Tryptic Soy Agar (TSA) 5% (0.75 g pancreatic digest of casein, 0.25 g enzymatic digest of soybean meal, 0.75 g sodium chloride, 15 g agar, dan akuades sampai dengan volume 1 L), TSA 100% (15 g pancreatic digenst of casein, 5 g enzymatic digest of soybean meal, 15 g sodium chloride, 15 g agar, dan akuades sampai dengan volume 1 L), NA, King’s B 100% (20 g protease peptone, 1.5 g K2HPO4, 1.5 g MgSO4.7H2O, 15 ml gliserol, 15 g agar, dan akuades sampai volume 1 L), water-yeast extract-agar (WYE) (0.25 g yeast extract, 0.5 g K2HPO4, 15 g agar, dan akuades sampai volume 1 L), dan casamino acids-yeast extract-glucose agar (YCED) (0.3 g yeast extract, 0.3 g casamino acid, 0.3 g D-glukose, 2 g K2HPO4, dan akuades samapi volume 1 L) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Koloni bakteri yang tumbuh dimurnikan kemudian disimpan dalam akuades steril.
Penyiapan Isolat X. oryzae pv. oryzae
Isolat bakteri X. oryzae pv oryzae patotipe IV diperoleh dari Balai Besar Penelitian Padi. Isolat diremajakan pada media Wakimoto (kaldu dari 300 g kentang, 7 g bacto peptone, 17 g sukrosa, 0.5 g Ca(NO3)2.4H2O, 1 g Na2HPO4.12 H2O, 17 g agar, dan akuades sampai volume 1 L). Uji reaksi hipersensitif (HR) pada tanaman tembakau dilakukan sebagai konfirmasi bahwa isolat X. oryzae pv oryzae yang digunakan merupakan bakteri patogen tumbuhan penyebab hawar daun bakteri.
Uji HR dilakukan pada tanaman tembakau sehat mengikuti metode yang digunakan Wahyudi et al. (2011). Suspensi X. oryzae pv oryzae patotipe IV dibuat dengan cara mengambil bakteri sebanyak satu ujung jarum ose ke dalam 5 mL media Wakimoto cair. Inokulasi dilakukan dengan cara menyuntikkan suspensi menggunakan jarum suntik volume 1 mL ke bagian permukaan bawah daun tanpa menembus lapisan daun bagian atas. Gejala diamati maksimal 24 jam setelah inokulasi.
Uji patogenisitas dilakukan dengan cara menyiapkan tanaman padi (IR64) sehat beserta suspensi bakteri X. oryzae pv oryzae patotipe IV. Inokulasi dilakukan dengan cara menggunting bagian daun menggunakan gunting steril yang sebelumnya dicelupkan ke dalam suspensi bakteri X. oryzae pv oryzae patotipe IV. Tanaman padi disungkup untuk menjaga kelembapan. Gejala diamati setiap hari sampai 1 minggu setelah inokulasi.
Seleksi Isolat Bakteri Endofit Potensial
Uji viabilitas dan morfologi koloni. Bakteri endofit hasil isolasi diseleksi berdasarkan viabilitas dan morfologi koloni. Bakteri endofit ditumbuhkan pada media NA dan diinkubasi selama 24 sampai 72 jam. Penapisan dilakukan terhadap isolat yang tidak tumbuh atau pertumbuhannya lambat. Ciri morfologi koloni yang diamati diantaranya warna, bentuk, tepian, dan elevasi. Isolat yang memiliki karakter morfologi sama dianggap sebagai satu isolat.
Uji induksi ketahanan dan pemacu pertumbuhan di pembibitan. Bakteri endofit hasil seleksi berdasarkan viabilitas dan morfologi koloni diseleksi kembali berdasarkan pengaruhnya terhadap induksi ketahanan dan pemacu pertumbuhan padi di pembibitan. Isolat bakteri yang akan diuji ditumbuhkan pada media NA. Biakan yang berumur 24 jam kemudian disuspensikan dalam media luria bertani broth (LB) (10 g tryptone, 5 g NaCl, 5 g yeast extract, dan akuades sampai volume 1 L). Benih padi varietas Ciherang yang telah disterilisasi permukaan pada suhu 55 oC selama 20 menit dan direndam dalam suspensi bakteri endofit selama 13 jam ditanam pada media pasir dan kompos (1:1), kemudian ditempatkan dalam growth chamber. Setelah berumur 3 minggu, bagian ujung daun kedua dipotong menggunakan gunting yang telah dicelupkan dalam suspensi X. oryzae pv oryzae patotipe IV dengan kerapatan 108 sel mL-1. Peubah yang diamati terdiri atas panjang hawar, tinggi tanaman, serta panjang akar. Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Setiap perlakuan sebanyak 3 ulangan, dan setiap ulangan sebanyak 1 unit tanaman.
Uji HR. Isolat bakteri endofit hasil seleksi di pembibitan diseleksi kembali berdasarkan uji HR pada daun tembakau. Pengujian mengikuti metode yang digunakan oleh Wahyudi et al. (2011). Uji HR dilakukan dengan cara mengambil bakteri sebanyak 1 ujung jarum ose ke dalam 5 mL media Wakimoto cair, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Inokulasi dilakukan dengan cara menyuntikan suspensi menggunakan jarum suntik volume 1 mL pada bagian permukaan bawah daun tanpa menembus lapisan daun bagian atas. Gejala diamati maksimal 24 jam setelah inokulasi.
Pengaruh Aplikasi Bakteri Endofit terhadap Induksi Ketahanan dan Pertumbuhan serta Hasil Padi pada Percobaan Rumah Kaca
Penyiapan tanaman uji. Bibit padi yang berumur 2 minggu dipindah tanam pada tanah sawah steril dalam ember berukuran 13.5 cm x 11.5 cm. Pemupukan dilakukan berdasarkan dosis anjuran mengikuti metode Sasmita et al. (2006), yaitu 250 kg ha-1 urea, 100 kg ha-1 SP-36, dan 100 kg ha-1 KCl.
Perlakuan bakteri endofit. Bakteri endofit diaplikasikan pada 3 waktu aplikasi yang berbeda, yaitu W1 (aplikasi bakteri endofit pada benih saja), W2 (aplikasi bakteri endofit pada benih dan 4 MST), dan W3 (aplikasi bakteri endofit pada benih, 4, dan 6 MST). Inokulasi X. oryzae pv. oryzae dilakukan pada akhir masa vegetatif dengan cara yang sama seperti pada percobaan di pembibitan. Jumlah anakan yang digunting untuk setiap unit tanaman adalah 5 anakan, dan selanjutnya tanaman disungkup selama 3 hari. Setiap perlakuan sebanyak 3 ulangan, dan setiap ulangan sebanyak 1 unit tanaman. Kerapatan suspensi bakteri endofit pada waktu aplikasi perendaman benih maupun pada 4 dan 6 MST berkisar antara 107 sampai 109 sel mL-1. Aplikasi pada 4 dan 6 MST dilakukan dengan cara penyiraman di sekitar perakaran dan penyemprotan pada seluruh permukaan tanaman. Volume suspensi bakteri yang digunakan untuk penyiraman sebanyak 30 mL dan yang digunakan untuk penyemprotan sebanyak 20 mL.
Peubah pengamatan. Adapun peubah pengamatan yang diamati terdiri atas ekspresi gen PR1 dan PBZ1, aktivitas enzim peroksidase, periode inkubasi, dan perkembangan penyakit. Selain itu juga dilihat pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan hasil panen padi dengan parameter daya berkecambah, indeks
vigor benih, pertambahan tinggi tanaman, jumlah anakan maksimum, jumlah anakan produktif, bobot kering, dan kadar air gabah.
Ekspresi gen PR1 dan PBZ1 dianalisis dengan teknik RT-PCR mengacu pada metode Kurnianingsih (2008). Isolasi RNA total dilakukan dari tanaman yang diberi perlakuan bakteri endofit sebelum dan setelah diinokulasi X. oryzae pv. oryzae menggunakan peqGOLD Plant RNA kit (peqlab). Sebanyak 0.1 g sampel padi digerus dalam keadaan dingin, kemudian ditambahkan 450 µl RNA lysis buffer T. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 30 menit dan setiap 10 menit dihomogenkan menggunakan vorteks selama 10 detik. Larutan dimasukkan dalam tabung mikro volume 2 mL yang sudah dipasang DNA removing column. Sentrifugasi dilakukan selama 2 menit dengan kecepatan 10 000 g. DNA removing column dibuang, sedangkan tabung mikro disimpan dan ditambahkan 70% etanol sebanyak volume yang sama dengan larutan. Larutan kemudian dimasukkan dalam perfect bind RNA column. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 10 000 g selama 1 menit. Perfect bind RNA column dimasukkan pada tabung mikro baru dan ditambahkan 500 µL RNA wash buffer I, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 g selama 1 menit. Larutan dibuang, sedangkan tabung mikro dan saringan digunakan kemabli. Sebanyak 650 µL RNA wash buffer II ditambahkan dan Perfect bind RNA column disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 10 000 g. Larutan dibuang kemudian dimasukkan kembali 650 µL RNA wash buffer II. Perfect bind RNA column disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 10 000 g dan cairan dibuang kembali. Column ditempatkan pada tabung mikro yang sama dan disentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 10 000 g, selanjutnya ditempatkan dalam 1.5 mL tabung mikro baru. Sebanyak 30 sampai 80 µL RNAse free water kemudian diinkubasi selama 1 menit. Tahap terakhir adalah sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 10 000 g.
Amplifikasi gen PR1 dan PBZ1 menggunakan TransScriptTM II One-Step RT-PCR SuperMix (TransGen Biotech). Amplifikasi gen PR1 menggunakan primer spesifik PR1 forward (5’-TAACTATGGAGGTATCCAAGCTGCC-3’) dan primer reverse (5’-CCAGTACGTACGCCCGTGTGTATAA-3’) dengan target amplikon berukuran ± 523 pb (Kurnianingsih 2008). Amplifikasi gen PBZ1
menggunakan primer spesifik PBZ1 forward (5’-
CAGTGGTCAGTAGAGTGATC-3’) dan primer PBZ1 reverse (5’- CTGGATAGAGGCAGTATTCC-3’) dengan target amplikon berukuran ± 900 pb (Midoh & Iwata 1996).
Program PCR yang digunakan mengacu pada Kurnianingsih (2008) yaitu reverse transcriptase pada 42 ºC selama 60 menit, predenaturasi pada suhu 94 ºC selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94 ºC selama 30 detik, annealing pada suhu 55 ºC selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72 ºC selama 2 menit, siklus denaturasi-ekstensi diulang sebanyak 39 kali, pasca PCR 72 ºC selama 5 menit dan pendinginan pada suhu 25 ºC selama 10 menit. Program PCR untuk deteksi gen PBZ1 sama dengan program PCR untuk deteksi gen PR1 kecuali tahap annealing yaitu pada suhu 56 ºC.
Hasil PCR diseparasi pada gel agarosa 1% (b v-1) di dalam larutan penyangga TAE 1x [(4.84 g Tris base, 1.142 mL glacial acetic acid dan 2 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0)].
Intensitas DNA gen PR1 dan PBZ1 diukur dengan menggunakan bantuan software ImageJ (Abramoff et al. 2004). Software ini dapat membantu untuk
menganalisis gambar secara kuantitatif sehingga dapat mengilustrasikan perbandingan intensitas DNA gen PR1 dan PBZ1 antara satu perlakuan dengan perlakuan lainnya.
Analisis aktivitas enzim peroksidase dilakukan pada 2 hari setelah inokulasi X. oryzae pv. oryzae. Analisis menggunakan metode yang digunakan oleh Damayanti et al. (2007). Sebanyak 0.5 g sampel yang diambil secara komposit dari masing-masing perlakuan ditambahkan dengan 1.5 mL dari 0.1 M buffer fosfat pH 7.0 pada suhu 4 oC dan digerus menggunakan mortar dalam kondisi dingin. Suspensi diambil dan dimasukkan pada tabung berukuran 1.5 mL, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 16 000 g selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk digunakan sebagai sumber enzim.
Sebanyak 1.5 mL dari 5 molal pyrogallol dan 0.5 mL dari 1% hydrogen peroxide (H2O2) dimasukan dalam supernatan. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang dan dihitung aktivitas enzim dengan menggunakan spektrofotometer pada penjang gelombang 420 nm dengan interval 30 detik sampai 3 menit. Aktivitas enzim peroksidase terekspresi sebagai perubahan nilai absorban min-1mg-1 protein. Total protein diukur dengan menggunakan Bradford reagent dengan bovine serum albumin (BSA; Sigma Aldrich, USA) sebagai standar.
Periode inkubasi diamati setiap hari setelah inokulasi patogen. Pengamatan berhenti setelah muncul gejala pertama pada setiap unit percobaan. Perkembangan penyakit diamati dengan menghitung panjang hawar setiap hari dan berhenti setelah gejala hawar sampai pada pangkal daun, selanjutnya dihitung keparahan penyakit dengan menggunakan rumus:
KP = keparahan penyakit
n = jumlah daun dari setiap kategori serangan v = kategori serangan
N = jumlah daun yang diamati V = nilai kategori serangan tertinggi
Nilai keparahan penyakit dihitung dengan skor kerusakan daun berdasarkan sistem evaluasi baku dari Standard Evaluation System for Rice (IRRI 1996). Kategori serangan X. oryzae pv. oryzae yang digunakan yaitu
0 = tidak ada gejala 1 = skala kerusakan 1-5% 3 = skala kerusakan 6-12% 5 = skala kerusakan 13-25% 7 = skala kerusakan 26-50% 9 = skala kerusakan 51-100%
Data seluruh keparahan penyakit dianalisis menggunakan formula Area Under Disease Progress Curve (AUDPC) (Van der Plank 1963), yaitu:
Ri = keparahan penyakit waktu i; ti = waktu ke-i
Pengujian pengaruh bakteri endofit terhadap daya berkecambah dan indeks vigor benih menggunakan metode uji kertas digulung dan didirikan dalam plastik (UKDdp) berdasarkan standar International Rules for Seed Testing Asosiation (ISTA 2010). Sebanyak 100 benih ditumbuhkan pada media kertas yang telah dibasahi dengan akuades steril dan dilapisi dengan plastik. Kertas kemudian digulung dan disimpan dalam germinator dengan kelembapan 80 sampai 90% dan suhu sekitar 26 sampai 30 oC. Indeks vigor dihitung berdasarkan jumlah kecambah normal pada 5 HST, sedangkan daya kecambah dihitung berdasarkan jumlah kecambah normal pada 7 dan 14 HST. Rumus yang digunakan untuk menghitung persen daya berkecambah (DB) adalah:
Sedangkan rumus untuk menghitung indeks vigor benih (IV) adalah:
DB = daya berkecambah IV = indeks vigor benih KN = kecambah normal
Pengamatan terhadap pertambahan tinggi tanaman dilakukan setiap minggu sampai 16 MST. Nilai pertambahan tinggi tanaman dianalisis menggunakan formula area under high of plant growth progress curve (AUHPGC) menggunakan rumus Van der Plank (1963) yang dimodifikasi, yaitu:
AUHPGC
Yi = pertambahan tinggi tanaman waktu i; ti = waktu ke-i
Pengamatan jumlah anakan dilakukan setiap minggu. Jumlah anakan maksimum dihitung berdsarkan jumlah keseluruhan anakan yang muncul pada 1 unit tanaman. Jumlah anakan produktif dihitung berdasarkan jumlah anakan yang menghasilkan malai. Bobot kering gabah ditentukan dengan cara menghitung bobot gabah hasil panen yang telah dikeringkan. Proses pengeringan dilakukan
dengan cara gabah dikeringkan dalam oven pada suhu 60 oC selama 3 hari. Kadar air gabah ditentukan menggunakan rumus:
Kadar air gabah = x 100%
Rancangan percobaan. Rancangan yang digunakan dalam pengujian ini adalah rancangan 2 Faktorial dalam Rancangan Acak Lengkap. Faktor pertama adalah jenis isolat bakteri endofit yang terdiri atas 8 taraf, sedangkan faktor yang kedua adalah waktu aplikasi bakteri endofit terdiri atas 3 taraf. Kombinasi perlakuan yang diujikan sebanyak 24 kombinasi perlakuan. Masing-masing perlakuan terdiri atas 3 ulangan, dan masing-masing ulangan terdiri atas 1 unit tanaman. Pengujian daya berkecambah Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Masing-masing perlakuan terdiri atas 4 ulangan, masing-masing ulangan terdiri atas 100 unit, dan masing-masing unit terdiri atas 1 butir benih padi.
Identifikasi Bakteri Endofit Potensial sebagai Agens Penginduksi Ketahanan Tanaman Padi terhadap Infeksi X. oryzae pv oryzae
Identifikasi berdasarkan karakter morfologi dan fisiologi. Identifikasi dilakukan berdasarkan karakter morfologi koloni, pewarnaan Gram dan endospora. Morfologi koloni yang diamati meliputi diameter, warna, elevasi, tepian, bentuk, dan bau. Pewarnaan Gram dan endospora menggunakan metode yang digunakan Schoenhard (1978). Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara sel bakteri endofit dioleskan pada permukaan kaca preparat, selanjutnya difiksasi panas di atas api sedang. Olesan bakteri digenangi pewarna primer yaitu kristal ungu selama 1 menit. Kelebihan pewarna dibuang, lalu dibilas menggunakan air. Kaca preparat ditiriskan kemudian digenangi iodium Gram selama 1 menit. Kelebihan pewarna dibuang, kemudian dibilas menggunakan air. Olesan bakteri dicuci dengan pemucat warna etanol 95% selama 30 detik, selanjutnya dicuci dengan air dan ditiskan. Olesan bakteri kembali digenangi dengan pewarna tandingan safranin selama 30 detik, kemudian dibilas menggunakan air. Kaca preparat ditiriskan, kemudian diamati dibawah mikroskop compound dengan perbesaran 1000 kali.
Pewarnaan endospora dilakukan dengan cara sel bakteri endofit dioleskan pada permukaan kaca preparat, selanjutnya difiksasi panas di atas api sedang. Olesan bakteri digenangi dengan hijau malakit. Masuknya pewarna ke dalam endospora dibantu dengan cara dipanaskan dengan api dari pembakar Bunsen sampai beruap selama 10 menit. Kelebihan pewarna dicuci dengan air. Olesan bakteri selanjutnya digenangi dengan safranin selama 1 menit. Safranin dicuci dengan air mengalir, selanjutnya kaca preparat ditiriskan kemudian diamati dibawah mikroskop compound dengan perbesaran 1000 kali.
Identifikasi bakteri endofit potensial dengan teknik molekuler. Identifikasi bakteri endofit potensial yang mampu menginduksi ketahanan tanaman padi terhadap X. oryzae pv. oryzae dilakukan berdasarkan runutan gen 16S rRNA. Isolasi DNA total menggunakan GeneJET Genomic DNA purification Kit (Thermo Scientific). Isolasi DNA diawali dengan penyiapan kultur bakteri
Bobot basah – bobot kering Bobot basah
pada media cair. Sebanyak 1.5 mL biakan bakteri dimasukkan dalam tabung mikro kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10 000 g selama 5 menit pada suhu ruang. Pelet yang terbentuk disuspensikan dengan 1800 µL lysis buffer A yang mengandung 20 mg ml-1 lysozim. Suspensi diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit menggunakan shaker water bath.
Sebanyak 200 µL lysis solution dan 20 µL proteinase K ditambahkan, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan shaker water bath pada suhu 56 o
C selama 30 menit. Sebanyak 20 µL RNAse A solution ditambahkan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vorteks. Inkubasi dilakukan selama 10 menit, kemudian ditambahkan 400 µL etanol 50% dan dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Suspensi dimasukan dalam GeneJET Genomic DNA purification column baru. Sebanyak 500 µL buffer wash I ditambahkan, kemudian disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 12 000 g. GeneJET Genomic DNA purification column dalam tabung mikro ukuran 1.5 mL. Sebanyak 200 µL buffer ulusi ditambahkan kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tahap terakhir adalah tabung mikro disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 8 000 g, kemudian disimpan pada suhu -20 oC.
Amplifikasi DNA kromosom dengan teknik PCR menggunakan sepasang primer general 16S rRNA untuk prokariot yaitu 27F forward (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan 1492R reverse (5’-GGT TACCTTACGACTT-3’) yang digunakan Lane (1991) dengan target amplikon ± 1500 pb. Reaksi PCR dilakukan pada volume total 25 µ L. Bahan-bahan PCR dicampur dalam tabung mikro 1.5 mL pada kondisi dingin di atas es. Sebanyak 1 µL DNA template dimasukkan ke dalam tabung PCR. Bahan-bahan PCR yang telah dicampurkan dimasukkan ke dalam tabung PCR yang berisi DNA template. Selanjutnya tabung ditempatkan pada mesin PCR. Program PCR yang digunakan yaitu denaturasi awal pada suhu 92 oC selama 1 menit, denaturasi pada suhu 95 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 55 oC selama 1 menit, ekstensi pada suhu 72 o
C selama 1.5 menit, ekstensi akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit, dan dilakukan sebanyak 35 siklus.Visualisasi hasil PCR diseparasi pada 1.5% agarosa dengan voltase 75 volt, selama 30 menit.
Sekuen parsial nukleotida yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen di NCBI genbank database dengan software Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Analisis Data
Data hasil pengamatan diolah dengan menggunakan program Excel 2007 dan dianalisis dengan bantuan program SAS versi 9.1.3. Uji beda nyata menggunakan uji lanjut Duncan dengan taraf kepercayaan 95%.
