Tata Cara Penelitian - METODE PENELITIAN - Optimasi formula krim sunscreen ekstrak kering polif

BAB III METODE PENELITIAN

D. Tata Cara Penelitian

1. Ekstraksi polifenol teh hijau

a. Pembuatan serbuk teh hijau. Bahan baku teh hijau diserbuk menggunakan mortir dan stamper. Serbuk teh diayak menggunakan saringan dengan nomor mesh 12/20.

b. Penetapan kadar air serbuk teh hijau. Penetapan kadar air dilakukan menggunakan metode Karl Fischer. Serbuk teh hijau ditimbang 1000 mg, ditambah

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

10 mL metanol, lalu didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan pre-titrasi pada alat dan uji kebocoran alat, hingga didapat angka drift

10-50. Standarisasi dilakukan dengan cara menimbang spuit berisi air, kemudian

dimasukkan 1 tetes air ke dalam alat. Spuit ditimbang kembali untuk menentukan

berat air yang dimasukkan. Hitung kesetaraan air. Masukkan 1 mL metanol dan dititrasi dengan alat (blanko). Hitung kadar air. Sampel dimasukkan 1 mL, dititrasi dengan alat, dan dihitung kadar air dalam sampel. Kadar air dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus:

Kadar air = ⁻ ×100% ditimbang yang berat blanko x ...(5)

x = angka yang muncul pada alat (mg)

c. Ekstraksi. Serbuk teh hasil pengayakan (100 g, kadar air ~ 10%) diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol teknis (500 mL) dengan bantuan shaker (150 rpm) selama 48 jam. Ekstrak metanol yang diperoleh,

dipekatkan menggunakan vacum rotary evaporator sampai volume 100 mL.

Ditambahkan 100 mL kloroform dan 100 mL akuades pada ekstrak kental di dalam corong pisah. Pisahkan antara lapisan atas dan lapisan bawah, selanjutnya lapisan atas diekstraksi menggunakan etil asetat sebanyak dua kali, masing-masing 150 mL. Fraksi etil asetat dikumpulkan selanjutnya diuapkan hingga kering yang merupakan ekstrak kering polifenol teh hijau (Nagayama et al., 2002 dengan modifikasi).

2. Penentuan konsentrasi polifenol dalam ekstrak kering polifenol teh hijau

Konsentrasi polifenol ditentukan menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Waterman and Mole, 1994 cit Lindorst, 1998). Sebagai senyawa standar digunakan

senyawa kuersetin pro analisis. Penghitungan kadar menggunakan persamaan kurva baku kuersetin sehingga konsentrasi polifenol di dalam sampel dihitung equivalen

terhadap kuersetin.

a. Pembuatan larutan stok kuersetin. Timbang 50 mg kuersetin pro analisis kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75 % sampai volume 50,0 mL. Larutan stok dibuat 3 replikasi untuk pembuatan kurva baku larutan standar kuersetin.

b. Pengukuran operating time (OT). Diambil 4 mL larutan stok kuersetin

replikasi pertama kemudian dilarutkan dalam aseton 75 % sampai volume 10,0 mL. Diambil 0,5 mL seri larutan diatas kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin Ciocalteu 2N kemudian diamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na₂CO₃ 1,9M kemudian ditambahkan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran reaksi divortex dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 726 nm selama 120 menit untuk mengetahui reaksi terbentuk warna biru.

c. Penentuan panjang gelombang abasorbansi maksimum ( max). Diambil 4 mL larutan stok kuersetin replikasi pertama kemudian dilarutkan dalam aseton 75 % sampai volume 10,0 mL. Diambil 0,5 mL seri larutan diatas kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin Ciocalteu 2N kemudian diamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na₂CO₃

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

1,9M kemudian ditambahkan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran reaksi diinkubasi pada temperatur ruang selama OT untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru Campuran reaksi divortex dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm – 800 nm.

d. Pembuatan kurva baku larutan standar kuersetin. Dibuat seri konsentasi 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; dan 0,7 mg/mL dari masing-masing larutan stok kuersetin kemudian dilarutkan dalam aseton 75 % sampai volume 10,0 mL. Diambil 0,5 mL seri larutan diatas kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin Ciocalteu 2N kemudian diamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9M kemudian ditambahkan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran reaksi diinkubasi pada temperatur ruang hingga mencapai operating time untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk

warna biru. Campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm dalam waktu singkat (±5 menit) dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang absorbansi maksimal. Dibuat grafik hubungan kadar kuersetin terhadap absorbansi kemudian dilakukan uji linearitas dan ditentukan persamaan regresi untuk mendapatkan persamaan kurva baku.

e. Penentuan konsentrasi polifenol dalam ekstrak kering polifenol teh hijau. Ditimbang 0,5 g ekstrak kering polifenol teh hijau kemudian dilarutkan dalam 25 mL aseton 75%. Diambil 1 mL kemudian ditambahkan akuades sampai volume 50,0 mL. Diambil 0,5 mL larutan sampel, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin Ciocalteu 2N kemudian

diamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na₂CO₃ 1,9 M kemudian ditambahkan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran reaksi diinkubasi pada temperatur ruang hingga mencapai operating time untuk menyempurnakan reaksi

sampai terbentuk warna biru. Campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm dalam waktu singkat (±5 menit) dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang absorbansi maksimal. Dilakukan replikasi pengukuran sebanyak 6 kali.

3. Uji efektivitas sunscreen/penghitungan nilai SPF in vitro.

a. Pembuatan larutan stok polifenol teh hijau. Ditimbang ekstrak kering polifenol teh hijau yang setara dengan 30 mg polifenol kemudian dilarutkan menggunakan etanol 90% sampai volume 100,0 mL. Larutan stok dibuat 3 replikasi.

b. Penentuan Spektra UV polifenol teh hijau. Diambil 1 mL larutan stok polifenol teh hijau kemudian diencerkan menggunakan etanol 90% sampai volume 10,0 mL. Diukur absorbansi larutan pada range panjang gelombang 250 – 400 nm.

c. Penentuan nilai SPF (Sun Protecting Factor). Diambil 2, 4, dan 6 mL

larutan stok polifenol kemudian diencerkan menggunakan etanol 90% sampai volume 10,0 mL. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Pengukuran absorbansi larutan dilakukan setiap interval 5 nm, diawali pada panjang gelombang ( ) 290 nm hingga panjang gelombang diatas 320 nm yang mempunyai absorbansi minimal 0,05.

Data yang diperoleh dimasukkan ke dalam kurva panjang gelombang terhadap absorbansi. Kemudian dihitung luas area di bawah kurva (Area Under the

Curve-AUC) menggunakan metode trapesium. Nilai SPF dihitung dengan rumus:

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

290 log λ λ − = tertinggi AUC SPF ………(6)

yaitu luas daerah di bawah kurva dibagi selisih pengamatan (Petro, A.J., 1981).

4. Optimasi formula krim

Di dalam penelitian ini, formula standar krim sunscreen dalam Young, A.,

(1972) (Tabel III) dimodifikasi menjadi formula krim sunscreen ekstrak kering

polifenol teh hijau.

Tabel III. Formula standar krim sunscreen

formula standar Antiviray 8 g Asam stearat 1,7 g isoprophyl myristat 6 g abracol PGS 3,5 g triethanolamin 0,8 g distilled water 80 g preservative 1 drop perfume 1 drop

Dari formula krim sunscreen ekstrak kering polifenol teh hijau tersebut,

dibuat 4 formula baru untuk analisis desain faktorial dengan perbedaan komposisi pada asam stearat dan minyak wijen. Keseluruhan formula dan bahan ditampilkan dalam tabel IV.

Pembuatan krim sunscreen ekstrak kering polifenol teh hijau adalah sebagai

berikut. Asam stearat dan cethyl alcohol dilelehkan secara terpisah di atas penangas

asam stearat. Dimasukkan secara berturut-turut metil paraben, triethanolamin, dan minyak wijen ke dalam campuran tersebut kemudian diaduk hingga homogen. campuran tersebut dipindahkan ke dalam mangkuk kemudian ditambahkan duapertiga (2/3) bagian akuades sedikit demi sedikit, sambil diaduk dengan mixer berkecepatan 300 rpm, hingga terbentuk massa yang baik. Ditambahkan asam sitrat yang telah dilarutkan dalam seperenam (1/6) bagian akuades sedikit demi sedikit (jangan sampai membuat krim pecah) sambil terus diaduk dengan mixer hingga homogen. Dilakukan cek pH terhadap campuran. Apabila pH campuran sudah mendekati 4, ditambahkan ekstrak kering polifenol yang telah dilarutkan dalam seperenam (1/6) bagian akuades ke dalam campuran sedikit demi sedikit sambil terus diaduk dengan mixer. Cek pH dengan indikator universal. Krim yang terbentuk dimasukkan ke dalam pot untuk uji sifat fisis.

Tabel IV. Formula krim sunscreen ekstrak kering polifenol teh hijau Formula desain faktorial Bahan 1 a b ab Polifenol (mg) Asam Stearat (g) Minyak wijen (g) Setil Alcohol (g) Triethanolamin (g) Aquadest (mL) Asam sitrat (g) Metil paraben (%) Perfume (g) 15,26 1,0 3,0 3,5 0,8 60,0 0,5 0,25 q.s. 16,34 6,0 3,0 3,5 0,8 60,0 0,5 0,25 q.s. 16,80 1,0 10,0 3,5 0,8 60,0 0,5 0,25 q.s. 17,91 6,0 10,0 3,5 0,8 60,0 0,5 0,25 q.s. Ket: konsentrasi polifenol dalam setiap formula adalah 0,022 % b/b

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Uji sifat fisis

a. Uji daya sebar. Pengukuran daya sebar dilakukan 48 jam setelah pembuatan krim. Pengukuran dilakukan dengan mengukur diameter 1 g krim pada kaca berskala yang diberi beban 125 g selama 1 menit (Garg, A., et al., 2002).

b. Uji viskositas.Pengukuran viskositas dilakukan dua kali, yaitu 48 jam setelah pembuatan krim dan setelah 1 bulan masa penyimpanan. Pengukuran viskositas menggunakan viscotester seri VT 04. Cara pengukurannya adalah: krim

dimasukkan ke dalam wadah dan dipasang pada portable viskotester. Viskositas krim

diketahui dengan membaca pergerakan jarum terhadap skala. Rotor yang digunakan dalam analisis disesuaikan dengan nilai viskositas.

c. Uji stabilitas. Pengukuran uji stabilitas dilakukan dengan menghitung pergeseran viskositas setelah penyimpanan selama 1 bulan. Pergeseran viskositas dinyatakan dalam persentase (%). Rumus yang digunakan adalah

% 100 48 48 1 x jam viskositas jam viskositas bulan viskositas − ... (6) 6. Subjective Assesment

Subjective assesment digunakan untuk mengetahui tingkat penerimaan

menggunakan metode questionnair yang disebarkan kepada 20 orang responden.

Hasil yang diperoleh diinterpretasikan sebagai penerimaan konsumen terhadap sifat fisis formula uji dengan rumus:

% 100 " " × = responden total ya meyatakan yang konsumen jumlah konsumen peneriman persen ………(7)

Dalam dokumen Optimasi formula krim sunscreen ekstrak kering polifenol teh hijau [Camellia sinensis L.] dengan asam stearat dan minyak wijen sebagai fase minyak : aplikasi desain faktorial. (Halaman 42-50)