BAB III. METODE PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
1. Verifikasi Ekstrak Kulit Manggis (Garcinia mangostana L.)
Bentuk, warna serta bau dari ekstrak kulit manggis (Garcinia mangostana L.) yang digunakan dalam penelitian ini diamati dan dibandingkan dengan Certificate of Analysis (CoA) ekstrak kulit buah manggis. Ekstrak kulit buah manggis diperoleh dari PT. Borobudur Semarang yang telah teridentifikasi jenis dan kandungannya melalui Certificate of Analysis (CoA) yang diberikan oleh PT. Borobudur Semarang.
2. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Manggis a. Pembuatan Ekstrak Kental
Ekstrak kulit buah manggis kering sebanyak 10,0 gram dilarutkan dalam etanol 96% sebanyak 50,0 mL. Ekstrak yang telah dilarutkan menggunakan etanol 96% ini kemudian disaring untuk memisahkan dari endapan maltodekstrin yang terdapat dalam ekstrak kering, sehingga didapatkan ekstrak cair kulit buah manggis dalam etanol 96%. Ekstrak cair kulit buah manggis ini selanjutnya diuapkan dengan suhu <600C sehingga
didapatkan ekstrak kental dengan bobot 85% dari ekstrak kering kulit buah manggis yang ditimbang.
b. Penyiapan Ekstrak Uji
Ekstrak kulit buah manggis sebanyak 100,0 mg dilarutkan menggunakan etanol 96% dalam beaker glass dengan dibantu pengadukan, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan di ad hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi 1000,0 ppm. Dibuat lima larutan seri dengan cara mengambil sebanyak 0,3; 0,4; 0,5; 0,75 dan 1,5 mL larutan stok dan ad dengan etanol 96% hingga batas tanda pada labu ukur 25 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan intermediet sebesar 12,0; 16,0; 20,0; 30,0 dan 60,0 ppm.
c. Pembuatan Larutan DPPH
DPPH sebanyak 2,0 mg dilarutkan dengan menggunakan etanol 96% dalam labu ukur 100,0 mL yang telah ditutup dengan alumunium foil (larutan dilindungi dari cahaya), sehingga diperoleh konsentrasi 20,0 ppm. d. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Larutan DPPH 20,0 ppm diambil sebanyak 4,0 mL dan ditambah etanol 96% sebanyak 2,0 mL. Diamati absorbansinya pada panjang gelombang 400-800 nm. Etanol 96% sebanyak 6 mL digunakan sebagai blanko. Panjang gelombang yang memberikan absorbansi dengan nilai yang paling tinggi digunakan sebagai panjang gelombang maksimum.
e. Penetapan Operating Time
Larutan DPPH 20,0 ppm diambil sebanyak 4,0 ml dan ditambah dengan ekstrak uji dengan konsentrasi 20,0 ppm sebanyak 2,0 mL, kemudian diamati absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh dalam interval waktu 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 menit. Blangko yang digunakan dalam penetapan OT (operating time) berupa larutan DPPH dengan konsentrasi 20,0 ppm sebanyak 4,0 mL dan etanol 96% sebanyak 2,0 ml.
f. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Manggis Larutan uji pada masing-masing konsentrasi seri sebanyak 2,0 ml diambil dan ditambah dengan larutan DPPH 20,0 ppm sebanyak 4,0 ml, kemudian didiamkan selama OT (operating time) yang diperoleh dan diamati absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Blangko yang digunakan berupa larutan DPPH dengan konsentrasi 20,0 ppm sebanyak 4,0 mL, yang telah dicampur dengan etanol 96% sebanyak 2,0 mL. Dari absorbansi diperoleh persamaan regresi yang kemudian digunakan untuk menghitung nilai IC50.
3. Formulasi Krim Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) a. Formula
Formula yang digunakan dalam formulasi krim ekstrak kulit manggis (Garcinia mangostana L.) mengacu pada Vanishing cream dengan formula sebagai berikut:
Tabel III. Formula Krim Ekstrak Kulit Buah Manggis Bahan Formula I A B AB Asam stearat (g) 15,000 15,000 15,000 15,000 Setil alkohol (g) 2,000 2,000 2,000 2,000 Parafin cair (g) 7,500 14,500 7,500 14,500 Ekstrak (g) 0,015 0,015 0,015 0,015 Gliserol (g) 4,625 4,625 11,875 11,875 Metil paraben (g) 0,200 0,200 0,200 0,200 TEA (g) 0,327 0,327 0,327 0,327 Aquadest (mL) 60,000 60,000 60,000 60,000
b. Pembuatan Sediaan Krim Ekstrak Kulit Manggis (Garcinia mangostana L.)
Asam stearat dicampur dengan cetyl alcohol dan parafin cair dalam suatu cawan porselen (cawan porselen 1) kemudian dipanaskan di atas waterbath dengan suhu 600C hingga asam stearat dan cetyl alcohol meleleh. Gliserol, metil paraben dan 10 ml aquadest dengan menggunakan cawan porselen yang berbeda (cawan porselen 2) dipanaskan diatas waterbath. Setelah campuran dalam cawan porselen 1 dan 2 telah tercampur hingga homogen kemudian campuran dalam cawan porselen 1 dipindahkan dalam mortir panas sambil diaduk dengan menggunakan stamper yang juga telah dipanaskan, setelah itu ditambahkan campuran dalam cawan porselen 2, ekstrak kental dan TEA sambil diaduk hingga mulai terbentuk masa krim. Setelah mulai terbentuk masa krim, ditambahkan aquadest panas sebanyak 50 ml sedikit demi sedikit sambil diaduk secara konstan hingga masa krim terbentuk (sekitar 2 menit). Setah masa krim terbentuk, pH sediaan
kemudian dicek dengan menggunakan stik indikator pH universal (pH sediaan yang diinginkan dalam rentang antara 4,8 hingga 6,5).
4. Uji Sifat Fisika Kimia Sediaan Krim Antioksidan Ekstrak Kulit Manggis (Garcinia mangostana L.)
a. Uji organoleptis dan pH
Dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, dan bau sediaan krim yang dihasilkan. Untuk uji pH, dilakukan dengan mengukur pH sediaan krim menggunakan indikator pH universal stick, nilai pH dilihat dengan membandingkan warna yang dihasilkan dengan warna pada standar. Kriteria pH yang diinginkan adalah 4,5-6,5 yang merupakan pH kulit manusia.
b. Uji daya sebar
Sebanyak 1 g sediaan krim diletakkan di atas bagian tengah suatu kaca bulat. Kemudian diberikan beban pemberat sebesar 125 gram (kaca bulat penutup dan beban tambahan) diatas sediaan krim dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian diukur diameternya dari empat sisi yang berbeda. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali untuk tiap-tiap formula (formula A, B, AB dan I).
c. Uji viskositas
Uji viskositas dilakukan setelah 48 jam pembuatan sediaan krim dan dilakukan 3 kali replikasi untuk formula A, B, AB dan I. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan viscometer Rion seri VT 04. Pengukuran viskositas dilakukan dengan cara memasukkan sediaan krim ke
dalam cup viscometer dan dipasang pada rotor viscometer. Nilai viskositas ditunjukkan oleh jarum penunjuk saat viscometer dinyalakan, skala rotor yang digunakan yaitu dua.
d. Uji sifat alir
Uji sifat alir dilakukan dengan menggunakan Rheosys Merlyn dengan menggunakan cone and plate pada suhu 250C. Parameter kecepatan awal 0,1 rpm dan kecepatan akhir 100 rpm. Kecepatan meningkat 10 tahap dengan peningkatan kecepatan berturut-turut yaitu 1,0 rpm; 12,0 rpm; 23,0 rpm; 34,0 rpm; 45,0 rpm; 56,0 rpm; 67,0 rpm; 78,0 rpm; 89,0 rpm dan 100,0 rpm. Sediaan krim antioksidan diletakkan ditengah plate, kemudian cone diatur sedemikian rupa hingga menempel sediaan krim. Selanjutnya, Rheosys Merlyn dijalankan dengan menggunakan bantuan software Rheosys Micra, sehingga didapatkan tipe sifat alir dari sediaan krim antioksidan yang diuji. Sifat alir sediaan krim mengikuti model Non-Newtonian pseudoplastis.
5. Uji Stabilitas Krim Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) a. Freeze-Thaw Cycle
Uji Freeze-Thaw dilakukan dengan cara menyimpan masing-masing formula pada suhu -40C selama 24 jam pada freezer, kemudian disimpan kembali pada suhu 450C selama 24 jam pada oven (1 siklus freeze-thaw). Penyimpanan dilakukan hingga 6 siklus dan pada akhir tiap siklus dilakukan uji sifat fisik sediaan krim yang meliputi pH, organoleptis, daya sebar dan viskositas.
b. Uji daya sebar
Dilakukan uji daya sebar pada akhir siklus freeze thaw, dengan 3 kali replikasi untuk tiap-tiap formula (formula A, B, AB dan I). Sebanyak 1 g sediaan krim diletakkan di atas bagian tengah suatu kaca bulat. Kemudian diberikan beban pemberat sebesar 125 gram (kaca bulat penutup dan beban tambahan) diatas sediaan krim dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian diukur diameternya dari empat sisi yang berbeda.
c. Uji Viskositas
Uji viskositas dilakukan pada akhir siklus freeze thaw dan dilakukan 3 kali replikasi untuk formula A, B, AB dan I. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan viscometer Rion seri VT 04. Pengukuran viskositas dilakukan dengan cara memasukkan sediaan krim ke dalam cup viscometer dan dipasang pada rotor viscometer. Nilai viskositas ditunjukkan oleh jarum penunjuk saat viscometer dinyalakan, skala rotor yang digunakan yaitu dua.
d. Uji PH
Uji pH dilakukan pada formula A, B, AB, dan I dengan menggunakan indikator pH universal stick pada setiap akhir siklus freeze thaw. Pengujian dilakukan dengan cara mengoleskan sedikit sediaan krim menggunakan spatula atau batang pengaduk pada indikator warna pH stik, kemudian dicocokan warna indikator pH stik dengan warna pH yang tertera
pada kemasan pH universal. Nilai pH yang diinginkan antara 4,5 hingga 6,5 yang merupakan pH kulit.
e. Uji sentrifugasi
Uji sentriugasi dilakukan pada masing-masing formula (formula A, B, AB dan 1) sebanyak 3 kali replikasi. Pengujian sentrifugasi dilakukan dengan cara memasukkan sediaan krim yang sudah didiamkan terlebih dahulu selama 48 jam dari hari pembuatan ke dalam tabung sentrifugasi kemudian tabung sentrifugasi yang telah terisi dengan sediaan krim dimasukkan ke dalam sentrifuge. Kecepatan mesin sentrifugasi diatur hingga kecepatan 3750 rpm selama 5 jam, kemudian diamati pemisahan yang terjadi pada sediaan krim setelah di sentrifugasi.
6. Uji Aktivitas Sediaan Krim Ekstrak Kulit Manggis (Garcinia mangostana L.) dengan Metode DPPH
Sediaan krim sebanyak 100,0 mg dilarutkan dalam etanol 96% dalam beaker glass dan dibantu pengadukan menggunakan batang pengaduk agar cepat larut. Larutan tersebut kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100,0 mL dan di ad menggunakan etanol 96% hingga batas tanda labu ukur. Larutan kemudian digojog agar homogen sehingga didapatkan larutan stok dengan konsentrasi sebesar 1000,0 ppm. Dari larutan stok kemudian dibuat 5 larutan seri uji dengan konsentrasi 12,0; 16,0; 20,0; 30,0 dan 60,0 ppm, dengan cara mengambil larutan stok sebanyak 0,3; 0,4; 0,5; 0,75 dan 1,5 mL.
Masing-masing konsentrasi larutan seri uji pada tiap formula diambil sebanyak 2,0 mL kemudian ditambah dengan larutan DPPH 20,0 ppm sebanyak 4,0 mL. Campuran larutan ini kemudian didiamkan selama OT (Operating Time) dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dengan menggunakan spektrofotometer. Blangko yang digunakan marupakan campuran 4,0 mL DPPH 20,0 ppm dan etanol 96% sebanyak 2 mL.
