BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Penyiapan bahan utama
Simplisia jahe emprit yang digunakan berasal dari pabrik pembuat jamu
tradisional di Yogyakarta yaitu CV. Merapi Farma Herbal di jalan Kaliurang
km 21,5. Madu kelengkeng yang digunakan berasal dari PT. Madu Pramuka.
2. Pembuatan serbuk simplisia
Simplisia kering jahe emprit dibuat menjadi sediaan serbuk
menggunakan mesin grinder kemudian diayak menggunakan pengayak
dengan nomor 40 mesh. Bobot serbuk jahe emprit setelah dilakukan
penyerbukan dan pengayakan ditimbang untuk dihitung persen rendemen
serbuknya.
Penetapan kadar air di dalam serbuk dilakukan untuk memenuhi
persyaratan obat tradisional menurut Keputusan Menteri Kesehatan RI No.
661/Menkes/SK/VII/199. Penetapan kadar air di dalam serbuk dilakukan
dengan metode gravimetri menggunakan alat Hallogen Moisture Balance.
Sebanyak ±5 g serbuk yang sudah diayak dimasukkan ke dalam alat kemudian
diratakan. Timbang bobot serbuk rimpang sebagai bobot sebelum pemanasan
(bobot A). Panaskan serbuk pada suhu 100◦
Timbang serbuk rimpang setelah pemanasan (bobot B). Selisih bobot A dan B
merupakan kadar air dari zat yang diteliti.
Rumus penentuan kadar air : �−�
� � 100%
3. Pembuatan ekstrak etanolik rimpang jahe emprit
Pembuatan ekstrak etanolik rimpang jahe emprit dilakukan dengan
metode maserasi. Sebanyak 50,0 g serbuk rimpang jahe emprit dimasukkan ke
dalam tabung erlenmeyer bertutup, lalu ditambahkan 250,0 ml pelarut etanol
96%. Kemudian dilakukan ekstraksi selama 3x24 jam. Selanjutnya, dilakukan
penyaringan dengan menggunakan corong Buchner. Filtrat yang diperoleh,
dikumpulkan dan diuapkan untuk menghilangkan etanol dengan menggunakan
rotary evaporator. Pelarut yang masih tersisa diuapkan menggunakan oven
pada suhu 40◦
C. Ekstrak kental yang diperoleh digunakan dalam pembuatan
sediaan uji.
4. Tahap praperlakuan senyawa uji
Sebelum penelitian dilaksanakan, semua hewan uji ditimbang berat
badannya, kemudian hewan uji dipelihara selama 1 minggu di Laboratorium
Farmakologi-Toksikologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta untuk
penyesuaian diri terhadap lingkungannya.
5. Pembuatan suspensi sel darah merah domba (SDMD) 1%
Darah domba segar yang telah diberi antikoagulan disentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm untuk memisahkan plasma dari sel darah merah.
bawah yang berupa endapan sel darah merah, ditambahkan larutan PBS pH 7,2
sebanyak 3 kali volume SDMD yang tersisa. Tabung kemudian dibolak-balik
dengan perlahan-lahan sampai SDMD tersuspensi secara homogen, kemudian
disentrifugasi lagi. Pencucian paling sedikit dilakukan tiga kali. Setelah
disentrifugasi, PBS dikeluarkan sehingga yang tertinggal adalah SDMD 100%.
Ambil 0,5 mL suspensi SDMD 100%, tambahkan PBS dengan volume sama
sehingga didapat suspensi SDMD 50%. Untuk mendapatkan suspensi SDMD
1%, maka dari 1 mL suspensi SDMD 50% ditambahkan PBS ad 50 mL.
6. Tahap penentuan dosis campuran madu kelengkeng dan ekstrak etanolik jahe emprit
Penentuan dosis campuran madu kelengkeng dan ekstrak etanolik
rimpang jahe emprit didasarkan pada Suranto (2007) dan penelitian Mellawati
(2008). Suranto menyatakan bahwa dosis madu yang dianjurkan pada manusia
adalah 1-2 kali/hari 1 sendok makan (15 mL). Konversi dosis pada manusia
yang berat badannya 70 kg ke tikus yang berat badannya 200 g adalah 0,018
(Ngatidjan, 1991). Dosis madu untuk tikus 200 g adalah :
Faktor konversi x dosis penggunaan 2 kali/hari = 0,018 x 30 mL
= 0,54 mL ≈ 0,6 mL
Untuk dosis ekstrak etanolik jahe emprit didasarkan pada penelitian
Mellawati (2008). Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Mellawati dosis 25
mg/kgBB volume pemberian 0,2 mL/20 g BB memberikan efek yang optimal
dan sama dengan imunostimulator sintetik (Levamisol hidroklorida) dan
Dosis ekstrak rimpang jahe emprit untuk tikus 200 g adalah :
Volume pemberian x berat badan tikus = 0,2 mL/20 g BB x 200 g
= 2 mL
Untuk dosis campuran madu kelengkeng dan ekstrak etanolik jahe emprit
dibuat menjadi 5 komposisi sebagai berikut dengan dasar perhitungan seperti
pada lampiran 10 :
Komposisi 1 : jahe 100% = 2 mL
Komposisi 2 : jahe 75% ; madu 25% = 1,5 mL ; 0,2 mL
Komposisi 3 : jahe 50% ; madu 50% = 1 mL ; 0,3 mL
Komposisi 4 : jahe 25% ; madu 75% = 0,5 mL ; 0,5 mL
Komposisi 5 : madu 100% = 0,6 mL
7. Tahap orientasi dosis campuran madu kelengkeng dan ekstrak etanolik jahe emprit
Sebanyak 18 hewan uji dibagi dalam enam kelompok, yaitu satu
kelompok kontrol negatif dan lima kelompok perlakuan dimana masing-masing
kelompok terdiri dari tiga ekor tikus. Pembagian kelompok-kelompok tersebut,
yaitu :
a. Kelompok kontrol negatif : kelompok tikus tanpa perlakuan
b. Kelompok perlakuan 1 (Jahe 100%) : kelompok tikus yang diberi
perlakuan ekstrak jahe dengan volume pemberian 2,0 mL.
c. Kelompok perlakuan 2 (Jahe 75% : Madu 25%) : kelompok tikus yang
diberi perlakuan campuran ekstrak jahe dengan volume pemberian 1,5
d. Kelompok perlakuan 3 (Jahe 50% : Madu 50%) : kelompok tikus yang
diberi perlakuan campuran ekstrak jahe dengan volume pemberian 1,0
mL dan madu kelengkeng sebanyak 0,3 mL.
e. Kelompok perlakuan 4 (Jahe 25% : Madu 75%) : kelompok tikus yang
diberi perlakuan campuran ekstrak jahe dengan volume pemberian 0,5
mL dan madu kelengkeng sebanyak 0,5 mL.
f. Kelompok perlakuan 5 (Madu 100%) : kelompok tikus yang diberi
larutan madu kelengkeng dengan volume pemberian 0,6 mL.
Delapan belas hewan uji tersebut akan diambil darahnya untuk diuji jumlah total
dan hitung jenis leukosit.
Pengujian jumlah sel darah putih dilakukan dengan metode yang
dilakukan Gomathi, Prameela, Kumar, dan Rajendra (2012). Semua tikus diinjeksi
SDMD 1% dengan dosis 2,0 mL/200g BB secara intraperitonial pada hari 0
(Kumala, Dewi, Nugroho 2012). Tikus yang terdapat dalam kelompok perlakuan
diberikan campuran madu kelengkeng dan ekstrak jahe secara oral sesuai dengan
komposisi yang telah ditetapkan selama tujuh hari berturut-turut. Sampel darah
diambil dari sinus orbital pada hari ke delapan dan dikumpulkan dalam tabung
EDTA. Sampel darah diukur menggunakan Sysmex XT 1800i automated
hematology analyzer yang dilakukan di Laboratorium Klinik Hi-Lab Yogyakarta.
8. Tahap percobaan dosis campuran madu kelengkeng dan ekstrak etanolik jahe emprit
Pada tahap percobaan ini, sebanyak 30 ekor hewan uji dibagi dalam
perlakuan dimana masing-masing kelompok terdiri atas lima ekor tikus.
Pembagian kelompok-kelompok tersebut sama seperti pada tahap orientasi yaitu :
a. Kelompok kontrol negatif : kelompok tikus tanpa perlakuan
b. Kelompok perlakuan 1 (Jahe 100%) : kelompok tikus yang diberi perlakuan
ekstrak jahe dengan volume pemberian 2,0 mL.
c. Kelompok perlakuan 2 (Jahe 75% : Madu 25%) : kelompok tikus yang
diberi perlakuan campuran ekstrak jahe dengan volume pemberian 1,5 mL
dan madu kelengkeng sebanyak 0,2 mL.
d. Kelompok perlakuan 3 (Jahe 50% : Madu 50%) : kelompok tikus yang diberi
perlakuan campuran ekstrak jahe dengan volume pemberian 1,0 mL dan
madu kelengkeng sebanyak 0,3 mL.
e. Kelompok perlakuan 4 (Jahe 25% : Madu 75%) : kelompok tikus yang
diberi perlakuan campuran ekstrak jahe dengan volume pemberian 0,5 mL
dan madu kelengkeng sebanyak 0,5 mL.
f. Kelompok perlakuan 5 (Madu 100%) : kelompok tikus yang diberi larutan
madu kelengkeng dengan volume pemberian 0,6 mL.
Tiga puluh ekor tikus tersebut akan diambil darahnya untuk diuji jumlah total dan
hitung jenis leukosit sama halnya pada tahap orientasi.
Pengujian jumlah sel darah putih pada tahap percobaan dilakukan
sama dengan pengujian jumlah sel darah putih pada tahap orientasi. Semua
tikus diinjeksi SDMD 1% dengan dosis 2,0 mL/200g BB secara intraperitonial
pada hari 0. Tikus yang terdapat dalam kelompok perlakuan diberikan
komposisi yang telah ditetapkan selama tujuh hari berturut-turut. Sampel darah
diambil dari sinus orbital pada hari ke delapan dan dikumpulkan dalam tabung
EDTA. Sampel darah diukur menggunakan Sysmex XT 1800i automated
hematology analyzer yang dilakukan di Laboratorium Klinik Hi-Lab
Yogyakarta.