BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi dari tanaman Swietenia mahagoni (L.) Jacq. yang meliputi bagian tanaman seperti daun dan buah dilakukan hingga pada tingkat species dengan cara mencocokkan ciri-ciri tanaman dengan herbarium yang diperoleh dari laboratorium Farmakognosi Fitiokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang dilakukan oleh Yohanes Dwiatmaka, M.Si dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Pengumpulan bahan uji
Pengumpulan bahan uji 11 Oktober 2013. Bahan uji yang digunakan adalah daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. yang masih segar, tidak busuk, dan masih berwarna hijau.
3. Pembuatan serbuk daun Swietenia mahagoni (L). Jacq.
Daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. dicuci dengan bersih dengan air mengalir dan kemudian dikeringkan. Setelah dikeringkan dilakukan pengeringan dengan ditutup menggunakan kain yang berwarna hitam agar pemanasannya merata dibawah sinar matahari dan tidak rusak akibat paparan langsung dari matahari. Kemudian dilakukan pengeringan lanjutan di LPPT (Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu) Universitas Gadjah Mada.
4. Pembuatan ekstrak etanol daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq.
Sebanyak 50 g serbuk kering daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. diekstraksi secara maserasi yang dilarutkan dalam 250 ml pelarut etanol 70% pada suhu kamar selama 24 jam menggunakan kecepatan 140 rpm yang kemudian disaring menggunakan kertas saring dengan corong Buchner, lalu memisahkan cairan penyari dengan menggunakan rotary vacuum evaporator dengan suhu 550C dan putaran no 3. Kemudian ekstraknya dipindahkan kedalam cawan porselen dan dimasukkan dalam oven selama 24 jam menggunakan suhu 500C sampai didapatkan ekstrak dengan bobot tetap atau suhu pengeringan telah mencapai 0,05%.
5. Pembuatan suspensi CMC-Na 1%
Suspesi CMC-Na 1% dibuat dengan mendispersikan lebih kurang 4 gram CMC-Na yang telah ditimbang secara seksama ke dalam aquadest sampai volume 400,0 ml kemudian mendiamkan selama 24 jam dan menggunakannya untuk melarutkan ekstrak daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq.
6. Pembuatan suspensi ekstrak
Melarutkan 0,3 g ekstrak etanol daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. ke dalam 30 ml CMC-Na 1% hingga diperoleh suspensi ekstrak yang dapat dispuitkan kedalam spuit oral.
7. Pembuatan larutan CCl4
Membuat larutan CCl4 dalam larutan olive oil dengan melarutkan 1 bagian CCl4 dalam 1 bagian olive oil sehingga didapatkan dosis 2 ml/Kg BB tikus.
8. Uji pendahuluan
a. Penentuan dosis karbon tetraklorida
Dosis karbon tetraklorida yang digunakan untuk menginduksi kerusakan hati pada tikus jantan galur Wistar adalah 2 ml/kg BB yaitu berdasarkan penelitian Janakat dan Al-Merie (2002). Dosis ini mampu merusak sel-sel hati pada tikus yang ditunjukkan melalui peningkatan kadar ALT-AST namun tidak menimbulkan kematian pada hewan uji. b. Penentuan waktu pencuplikan darah
Penetapan waktu pencuplikan darah diorientasikan dengan empat kelompok perlakuan waktu, yaitu pada jam ke – 0, 24, 48, dan 72 setelah pemejanan karbon tetraklorida. Dalam penentuan waktu pencuplikan darah 5 hewan uji diambil darahnya yang dilakukan melalui pembuluh sinus orbitalis mata.
Menurut Janakat dan Al-Merie (2002) Kadar ALT tikus yang terinduksi karbon tetraklorida dilarutkan dalam olive oil (1:1) dengan menggunakan dosis 2 ml/kg BB hingga mencapai kadar maksimal pada jam ke – 24 setelah pemberian dan mengalami penurunan pada jam ke –
48.
9. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji
Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 35 ekor tikus jantan galur Wistar yang dibagi secara acak dalam 7 kelompok sama banyak, masing-masing sebanyak lima ekor tikus.
a. Kelompok I (kontrol hepatotoksin) diberikan larutan karbon tetraklorida :
olive oil (1:1) dosis 2 ml/kgBB secara i.p.
b. Kelompok II (kontrol negatif hepatotoksin) diberikan olive oil dosis 2 ml/kgBB secara i.p.
c. Kelompok III (kontrol ekstrak) diberikan ekstrak etanol daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. diberikan dosis tertinggi yaitu 180 ml/Kg BB dari perhitungan dosis selama enam hari berturut-turut secara per oral.
d. Kelompok IV (kontrol negatif perlakuan) diberikan suspensi CMC-Na 1% dengan volume tertentu selama 6 hari, pada hari ke 7 diberikan karbon tetraklorida dengan dosis 2 ml/KgBB dan setelah 24 jam pemberian karbon tetraklorida darah diambil dengan diambil di daerah sinus orbitalis mata, kemudian menetapkan aktivitas ALT dan AST.
e. Kelompok V (pemberian selama satu hari) diberikan ekstrak etanol daun
Swietenia mahagoni (L.) Jacq. dengan dosis 180 mg/Kg BB secara per oral sekali sehari selama satu hari berturut-turut.
f. Kelompok VI (pemberian selama tiga hari) diberikan ekstrak etanol daun
Swietenia mahagoni (L.) Jacq. dengan dosis 180 mg/Kg BB secara per oral sekali sehari selama tiga hari berturut-turut.
g. Kelompok VII (pemberian selama enam hari) diberikan ekstrak etanol daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. dengan dosis 180 mg/Kg BB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut-turut.
Setelah melakukan pemberian ekstrak etanol pada hari-hari tertentu kemudian pada hari berikutnya pada kelompok perlakuan V, VI, dan VII
diberikan larutan karbon tetraklorida dosis 2 ml/kgBB secara intraperitonial
dan setelah 24 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata untuk penetapan aktivitas ALT dan AST.
10. Pembuatan serum
Darah diambil melalui sinus orbitalis mata hewan uji kemudian ditampung melalui dinding tabung eppendrof dan didiamkan kurang lebih selama 15 menit, lalu darah disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 8000 rpm, lalu dipisahkan dan diambil bagian supernatannya.
11. Pengukuran aktivitas ALT dan AST
Micro vitalab 200 adalah alat yang digunakan untuk mengukur aktivitas ALT-AST pada serum hewan uji. Sebelum melakukan pengukuran sampel, dilakukan validasi alat terlebih dahulu dengan menggunakan kontrol serum Cobas. Range nilai dari ALT dan AST control serum Cobas sebesar 33,9-48,9 U/L.
Dilakukan pengukuran ALT dengan mencampur sebanyak 100 μl serum dengan 1000 μl reagen I, kemudian divortex selama 5 detik, didiamkan selama 2 menit, lalu dicampur dengan 250 μl reagen II, divortex selama 5 detik dan serapannya dibaca setelah 1 menit.
Pengukuran aktivitas AST dilakukan dengan mencampurkan 100 μl serum dengan 1000 μl reagen I, lalu divortex selama 5 detik, kamudian didiamkan selama 2 menit, campur dengan 250 μl reagen II, kemudian divortex selama 5 detik dan dibaca serapan setelah 1 menit.
Aktivitas dari ALT dan AST dinyatakan dalam U/L. Aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 370C, dengan faktor koreksi -1745. Pengukuran aktivitas ALT dan AST ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
12. Penetapan total dan kadar air flavonoid
Penetapan total dan kadar air flavonoid ini dilakukan di LPPT (Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan langkah kerja seperti berikut.
1. Timbang serbuk sampel dengan seksama sebanyak 50 mg ekstrak etanol daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. kemudian menambahkan 0,3 ml natrium nitrit 5%. Setelah 5 menit ditambahkan 0,6 ml alumuminium chloride 10% kemudian ditunggu 5 menit dan menambahkan 2 ml natrium hidroksida 1 M, mengaddkan aquades hingga 10 ml dengan labu takar lalu dipindahkan kedalam kuvet, tetapan serapan pada panjang gelombang 510 nm.
2. Penetapan kadar air dilakukan menggunakan metode Gravimetri dengan menimbang ekstrak etanol daun Swietenia mahagoni (L.) Jacq. dalam cawan yang telah dipanaskan pada suhu penetapan selama 30 menit. Kemudian memasukkannya ke dalam oven dan mengeringkannya pada suhu 1050C selama 2 jam. Sampel dimasukkan dalam eksikator dan mendinginkannya di dalam eksikator. Ulangi pengeringan hingga memperoleh bobot tetap.
