BAB III METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Pemilihan bahan
Beras yang dipilih adalah beras yang diambil dari satu jenis merk beras yaitu Rojolele®. Bahan ini diperoleh dari pembelian di supermarket Pamella Yogyakarta.
2. Pembuatan limbah air cucian beras
Beras sebanyak 0,5 kg ditampung di baskom lalu diberi air 500 mL. Beras diaduk-aduk hingga air menjadi keruh. Air yang keruh ini diambil dan digunakan pada tahap selanjutnya.
3. Pembuatan biomaterial selulosa bakteri
Sebanyak 200 mL air limbah air cucian beras hasil penyaringan dimasukkan ke dalam gelas beaker yang telah dilengkapi dengan magnetic stirrer, ditambahkan 20 gram gula pasir dan 1 gram urea, selanjutnya dipanaskan dan diaduk hingga larut. Campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat 2% hingga pH = 4.. Selanjutnya dituangkan dalam keadaan panas kedalam wadah fermentasi yang telah disterilkan dan ditutup. Dibiarkan hingga suhu kamar, lalu ditambahkan 20 mL Acetobacter xylinum.dadah digoyang- goyang untuk meratakan gliserol dan bakteri. Difermentasi selama 7 hari pada suhu kamar. Lapisan pelikel yang terbentuk dicuci dengan aquades panas, sodium hidroksida 3% sebanyak 2 kali selama masing-masing 24 jam lalu
dinetralkan dengan asam klorida 3% selama 10 menit, dan aquadest. Setelah itu hasil pencucian dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC.
4. Pembuatan biomaterial selulosa gliserol
Sebanyak 200 mL air limbah air cucian beras hasil penyaringan dimasukkan ke dalam gelas beaker yang telah dilengkapi dengan magnetic stirrer, ditambahkan 20 gram gula pasir dan 1 gram urea, selanjutnya dipanaskan dan diaduk hingga larut. Campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat 2% hingga pH = 4.. Selanjutnya dituangkan dalam keadaan panas kedalam wadah fermentasi yang telah disterilkan dan ditutup. Dibiarkan hingga suhu kamar, lalu ditambahkan 20 mL Acetobacter xylinum dan 1 gram gliserol.dadah digoyang-goyang untuk meratakan gliserol dan bakteri. Difermentasi selama 7 hari pada suhu kamar. Lapisan pelikel yang terbentuk dicuci dengan aquades panas, sodium hidroksida 3% sebanyak 2 kali selama masing-masing 24 jam lalu dinetralkan dengan asam klorida 3% selama 10 menit, dan aquadest. Setelah itu hasil pencucian dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC.
5. Pembuatan biomaterial selulosa kitosan gliserol
Sebanyak 200 mL air limbah air cucian beras hasil penyaringan dimasukkan ke dalam gelas beaker yang telah dilengkapi dengan magnetic stirrer, ditambahkan 20 gram gula pasir dan 1 gram urea, selanjutnya dipanaskan dan diaduk hingga larut. Campuran diasamkan dengan penambahan
asam asetat 2% hingga pH = 4.. Selanjutnya dituangkan dalam keadaan panas kedalam wadah fermentasi yang telah disterilkan dan ditutup. Dibiarkan hingga suhu kamar, lalu ditambahkan 20 mL Acetobacter xylinum dan 1 gram gliserol.dadah digoyang-goyang untuk meratakan gliserol dan bakteri. Difermentasi selama 7 hari pada suhu kamar. Lapisan pelikel yang terbentuk dicuci dengan aquades panas, sodium hidroksida 3% sebanyak 2 kali selama masing-masing 24 jam lalu dinetralkan dengan asam klorida 3% selama 10 menit, dan aquadest. Hasil pencucian kemudian direndam dalam larutan kitosan 2 gram dalam 100 mL asam asetat 2%. Selulosa bersama larutan kitosan dikeringkan dalam ruangan, kemudian ketika larutan kitosan sudah kering , selulosa dapat dimasukkan oven pada suhu 40oC.
6. Pembuatan biomaterial kitosan sebagai kontrol positif
Sejumlah 2 gram kitosan dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 2%, kemudian ditambahkan 1 gram gliserol. Larutan kemudian disaring menggunakan kain untuk menghilangkan partikel yang tidak terlarut. Pada nampan bersih, larutan dituang dan diletakkan selama 48 jam untuk menjamin penguapan solven secara sempurna. Kemudian membran dicuci dengan sodium hidroksida 1 M, aquadest, dan dilanjutkan dengan pengeringan. Produk membran yang terbentuk transparan dan fleksibel.
7. Analisis karakteristik biomaterial
a. Analisis gugus fungsi dengan alat FT-IR
Material selulosa kitosan bakteri dijepit pada tempat sampel kemudian diletakkan pada alat ke arah sinar Infra Red. Hasilnya akan direkam ke dalam kertas berskala berupa alur kurva transmitan terhadap bilangan gelombang.
b. Foto SEM
Material selulosa dipotong kecil kira-kira panjang 1 cm dan lebar 2 mm, kemudian ditempatkan di atas tempat sampel yang terbuat dari kuningan. Sampel dilapisi dengan emas (coating) dengan alat Fine Coat Ion Sputter selama kurang lebih 5 menit. Selanjutnya sampel dimasukkan ke unit elektron gun melalui bilik pergantian sampel. Kemudian sampel diset sampai mendapatkan fokus yang tepat. Tombol utama pada posisi ON dan sistem optik elektron pada acceleration voltage diset 20 kilo volt.
c. Analisis sifat mekanik berupa tensile strength dan elongasi
Material selulosa dipotong dengan ukuran 11 cm x 2 cm. Potongan tersebut dimasukkan ke dalam dumbbell untuk dilakukan pengepresan dan pencetakan bentuk. Kemudian akan terbentuk pola pada selulosa. Dilakukan pemotongan sesuai pola yang terbentuk pada selulosa. Ketebalan hasil pemotongan dan pengepresan diukur menggunakan mikrometer. Kemudian kedua ujung hasil pemotongan ini masing-masing dikaitkan pada Universal
Posisi ON. Isikan data sampel sesuai ukuran standar. Lakukan pengujian sampai selesai.
d. Analisis kestabilan termal dengan DTA/TGA
Material selulosa dipotong menjadi ukuran 1 x 1 cm, kemudian dimasukkan ke dalam alat TGA/DTA. Suhu alat diatur dari 50-400oC.
Power dalam posisi ON dan biarkan hingga alat selesai mengukur. Data TGA akan muncul pada komputer dalam bentuk grafik massa yang tersisa seiring peningkatan suhu, sedangkan untuk DTA akan muncul grafik ∆T seiring peningkatan suhu.
e. Analisis kristalinitas dengan XRD
Material selulosa dipotong menjadi ukuran kecil 1 x 1 cm. Kemudian material yang telah dipotong dimasukkan ke dalam alat XRD. Pada kondisi tertutup, alat kemudian disinari dengan menggunakan sinar yang dihasilkan dari tumbukan elektron. Sinar akan ditembakkan ke sampel dan menghasilkan difraksi. Hasil difraksi akan terbaca dalam komputer membentuk daerah kristalin.
8. Sterilisasi produk
Produk biomaterial yang sudah dikeringkan dibungkus dengan kertas coklat, lalu diautoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit. Setelah disterilisasi, produk biomaterial ini disimpan di dalam oven pada suhu 30-40oC hingga
9. Pengelompokkan hewan uji
Dua puluh lima hewan uji dikelompokkan secara acak menjadi 5 kelompok besar (yaitu kelompok perlakuan 1 hari, 3 hari, 5 hari, dan 7 hari). Kemudian pada tiap – tiap hewan uji dibuat luka pada bagian punggung untuk pengamatan sehingga pada setiap kelompok besar terdapat 5 replikasi dengan tiga macam perlakuan (kontrol negatif, kontrol positif, dan selulosa kitosan bakteri)
a b c
Gambar 10. Pemberian biomaterial pada tiap-tiap luka (a). Kontrol positif (b). Kontrol negatif (c). Perlakuan selulosa gliserol kitosan
10. Pembuatan luka pada hewan uji
Hewan uji diberi ketamine dan xylazine secara intraperitonial (i.p). Dosis ketamin yang digunakan adalah 0,2 mL/250g BB dan dosis xylazine yang digunakan adalah 0,075mL/250g BB. Dosis yang digunakan adalah dapat menimbulkan efek sedasi pada hewan uji. Setelah hewan uji tertidur, lalu pada bagian bulu bagian belakangnya ini dibersihkan dengan alat cukur steril. Setelah bulunya dibersihkan maka dibuat sedikit sayatan menggunakan seperangakat pisau bedah steril pada lapisan kulit hewan uji yang digunakan hingga sayatan ini membentuk luka goresan yang sedikit agak dalam.
11. Pembuatan kontrol positif, kontrol negatif dan perlakuan
Pada luka hewan uji yang digunakan sebagai kontrol positif, luka tersebut diberi perlakuan dengan menutupnya menggunakan material kitosan yang dibuat sebagai kontrol positif. Pada luka hewan uji yang digunakan sebagai kontrol negatif, luka tersebut diberi perlakuan dengan menutupnya menggunakan kasa steril sebagai kontrol negatif. Pada luka hewan uji yang digunakan sebagai perlakuan lama pemberian, luka hewan uji tersebut ini ditutup dengan biomaterial yang sebelumnya telah disterilisasi dan diberi sedikit selotip untuk menjaga agar biomaterial ini tidak mudah lepas. Penutupan luka pada kontrol positif, kontrol negatif dan perlakuan dilakukan pada 5 tikus sesuai dengan 4 rentang waktu yang telah ditentukan sebelumnya dengan replikasi sebanyak 5 kali.
12. Pengamatan penutupan luka secara makroskopis
Pengamatan ini dilakukan pada 5 tikus dengan 4 rentang waktu yang telah ditentukan. Pada tiap-tiap waktu tersebut diamati perubahan yang terjadi antara sebelum pemberian polimer dan sesudah pemberian polimer, kemudian hasilnya dideskripsikan. Parameter yang diamati adaalah kelembaban, warna dan munculnya keropeng, selain itu dilakukan perhitungan diameter luka dihitung menggunakan rumus:
Keterangan: D1 = Diameter luka sehari setelah luka dibuat D2 = Diameter luka pada hari pengamatan