BAB III. METODE PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Garis besar dari penelitian ini dibagi menjadi uji kesesuaian sistem GC-ECD, preparasi sampel melon, optimasi clean-up, validasi metode analisis residu
azoxystrobin dalam buah melon. Metode dikatakan valid jika dapat memenuhi parameter validitas yang meliputi akurasi, presisi, koefisien korelasi, LOD dan LOQ.
1. Prosedur Pencucian Alat-Alat Gelas
Cuci alat dengan menggunakan aquadest sebanyak tiga kali dan ditunggu hingga kering. Cuci kembali alat menggunakan aceton tiga kali kemudian keringkan. Terakhir cuci alat menggunakan metanol dengan tiga kali pengulangan dan keringkan.
2. Pembuatan Larutan Stok Azoxystrobin dan DCB
a. Pembuatan stok azoxystrobin. Ditimbang sejumlah lebih kurang 11,4 mg baku azoxystrobin dan larutkan dalam 1mL toluen sehingga didapatkan konsentrasi stok induk sebesar 11,4 mg/mL.
b. Pembuatan stok DCB. Timbang 10mg DCB dan larutkan dalam 100 mL pelarut. Ambil 10 uL dan add hingga volume 1000 uL.
3. Pembuatan Larutan Intermediet Azoxystrobin
a. Pembuatan larutan intermediet A. Ambil 40 µL dari stok induk dan larutkan dalam 1000 µL heksan sehingga didapatkan larutan intermediet A dengan konsentrasi 0,456 µg/µL.
b. Pembuatan larutan intermediet B. Ambil 10 µL larutan intermediet A diencerkan hingga volume 1000 µL heksan, sehingga didapatkan konsentrasi 0,456 x 10-2 µg/ µL.
4. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD
Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum metode analisis terpilih dilaksanakan. Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik analisis, maka uji kesesuaian system perlu dilakukan untuk memastikan sistem operasional akhir adalah efektif dan memberikan hasil yang sesuai dengan tujuan analisis. Kelayakan sistem dilihat dari beberapa parameter yaitu presisi, linearitas dan sensitivitas sistem GC-ECD.
a. Optimasi sistem GC-ECD. Optimasi terhadap sistem GC-ECD dilakukan dalam uji kesesuaian sistem. Optimasi instrumen GC-ECD dilakukan sesuai dengan prosedur yang ditetapkan dalam petunjuk operasional alat yang dilakukan oleh Sanjayadi (2014).
b. Kinerja kualitatif GC-ECD. Kinerja GC-ECD meliputi pemisahan standar azoxystrobin pada sistem atau performa GC-ECD, dan keajegan sistem. Dilakukan dengan menginjeksikan larutan intermediet B dengan kadar 0,137 ng pada GC-ECD yang sudah dioptimasi sebanyak enam kali dibawah kondisi sistem yang sama.
c. Kinerja kuantitatif GC-ECD. Dalam analisis kuantitatif GC-ECD meliputi parameter-parameter presisi, linearitas, rentang linearitas, sensitivitas LOD/ IDL dan IQL, akurasi.
1) Presisi sistem GC-ECD. Repeatability sistem dilihat dari nilai % RSD. Nilai % RSD ditetapkan dengan cara menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan intermediet B dengan jumlah volume pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL, 3 µL, 2 µL yang mana masing-masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng, 0,137 ng dan 0,091 ng. Diperoleh respon sistem yang berupa luas puncak azoxystrobin pada tiap kadar, sehingga dapat dihitung nilai rata-rata respon factor (RF) , standar deviasi RF dan % RSD RF.
2) Linearitas hubungan kadar baku azoxystrobin dengan respon sistem GC-ECD. Koefisien korelasi (r) digunakan sebagai penentu linearitas hubungan kadar baku azoxystrobin dengan respon yang berupa luas puncak azoxystrobin/standar internal. Nilai parameter (r) dapat ditetapkan dengan menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan intermediet B dengan volume pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL dan 2 µL yang masing-masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng; 0,137 ng; dan 0,091 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan program statistik
puncak azoxystrobin/luas puncak DCB serta nilai statistik lain seperti
intersep (a) dan slope (b).
3) Sensitivitas sistem GC-ECD. Beberapa parameter sensitivitas adalah nilai LOD/ IDL, IQL dan slope. Parameter ini dapat ditetapkan dengan cara menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan intermediet B dengan volume pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL; 2 µL; 1 µL yang masing-masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,684 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng; 0,137 ng; 0,091 ng; 0,046 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan program statistik powerfit hingga didapatkan hubungan antara kadar
azoxystrobin dengan rasio puncak azoxystrobin/luas puncak DCB serta nilai statistik lain seperti LOD/IDL, IQL dan slope (b).
4) Akurasi. Pengukuran kedekatan antara nilai yang sebenarnya dengan nilai yang terukur dapat ditetapkan dengan menggunakan % D. Semakin kecil % D maka kedekatan semakin baik. Parameter ini dapat ditetapkan dengan cara menginjeksikan larutan intermediet B dengan volume pengambilan 20 µL; 15 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL; 2 µL; 1 µL yang masing-masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,684 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng; 0,137 ng; 0,091 ng;
0,046 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan program statistik
powerfit hingga didapatkan persamaan y=bx+a untuk dapat menghitung % D. 5. Preparasi Sampel Melon
a. Penetapan kadar air dalam buah melon. Homogenisasi kulit, daging dan whole melon secara terpisah tanpa penambahan air. Timbang masing-masing sampel 10 gram. Letakan dalam cawan petri kemudian oven hingga bobot tetap dalam suhu 65°C.
b. Optimasi lama sentrifugasi. Homogenisasi sampel. Timbang sebanyak kurang lebih 5 gram sampel yang telah homogen dan masukan dalam tabung sentrifugasi 15mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 mL asetonitril. Gojog dengan kuat selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000rpm selama 5 menit ; 10 menit dan 15 menit. Bandingkan hasil supernatan yang diperoleh.
6. Optimasi Clean-Up Menggunakan SPE C18
a. Penentuan kapasitas berat SPE. Homogenisasi melon hingga homogen. Timbang 10 gram sampel dan masukan dalam tabung sentrifugasi 50 mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 10 ml asetonitril dan kemudian gojok dengan kuat selama 1 menit. Vortex selama 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Ambil 1 mL supernatan dan masukan dalam flakon. Kemudian oven hingga beratnya tetap. Timbang berat sampel yang telah kering, kemudian hitung kapasitas berat SPE dengan rumus:
Berat sampel = Kapasitas SPE x 5%
b. Optimasi tahap washing saat clean up SPE. Timbang 5 gram sampel yang telah dihomogenkan, tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog dengan kuat selama 1 menit, vortex selama 2 menit dan sentrifugasi 5 menit dengan kecepatan 5000rpm. Ambil 3 mL supernatan kemudian adisi dengan 2 µL standart intermediet A. Keringkan lalu tambahkan 1 mL aquabidest dan ultrasonifikasi selama 5 menit. Loading sampel ke SPE dengan kecepatan alir maksimal 1 ml/menit. Washing dengan berbagai macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL
aquabidest dan 5 mL metanol 5%. Elusikan 3 ml metanol dan tampung dalam flakon. Keringkan hasil elusi dan hasil washing kemudian larutkan dalam 100 µL heksan. Masing-masing hasil eluat metanol setelah diwashing menggunakan 5 % metanol dan 100% aquabidest, diinjeksikan dalam GC-ECD dengan volume injeksi 2 µL.
c. Optimasi tahap elusi untuk dapat menarik analit. Penarikan analit dilakukan dengan memfraksinasi jumlah elusi metanol. Timbang 2 sampel yang telah dihomogenkan dengan berat masing-masing 5 gram dan masukan dalam tabung sentrifugasi 15 mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 mL asetonitril. Gojog dengan kuat selama satu menit dan vortex selama dua menit. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5000rpm selama 5 menit. Ambil 3 mL supernatan dan masukan dalam flakon. Adisi menggunakan larutan intermediet A dengan volume 50 µL. Kemudian keringkan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath. Larutkan hasil
pengeringan dalam 1 mL aquabidest dan lakukan ultrasonifikasi selama 5 menit. Loading sampel pada SPE yang telah di conditioning. Washing dengan 5 mL
aquabidest dan tunggu hingga kering dengan bantuan gas nitrogen. Lakukan 5 kali fraksinasi metanol secara kuantitatif, dimana penggunaan metanol pada tiap fraksi sebanyak 1 mL. Tampung hasil fraksinasi dalam flakon yang berbeda-beda. Kemudian keringkan dengan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath. Larutkan dengan menggunakan heksan 100 µL dan injekan pada GC-ECD yang telah teroptimasi.
d. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Homogenisasi melon hingga homogen, timbang tiga sampel masing-masing sebanyak 5 gram dan masukan dalam tiga tabung sentrifugasi 15mL. Adisi menggunakan 15 µL larutan intermediet B. Tambahkan pada masing-masing tabung 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog dengan kuat selama 1 menit dan vortex selama 2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Ambil 3 ml supernatan dan masukan dalam flakon. Uapkan dengan menggunakan gas nitogen hingga kering. Larutkan hasil pengeringan dalam 500 µL aquabidest dan ultrasonifikasi selama 5 menit. Elusikan ketiga sampel yang diadisi menggunakan 15 µL larutan intermediet B kedalam satu SPE yang sama (SPE A), dengan tiap kali pencucian menggunakan 30 ml metanol dan 10 ml aquabidest. Atur kecepatan alir SPE maksimal adalah 1 ml/menit. Washing dengan menggunakan 5 ml aquabidest. Elusi dengan 3 ml metanol kemudian tampung hasil elusi menggunakan flakon. Uapkan tiga eluat yang dihasilkan hingga kering dalam
flakon yang berbeda-beda, kemudian larutkan dalam 100 µL heksan untuk siap diinjek ke GC.
7. Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah Melon
Parameter validasi yang akan dievaluasi dalam metode ini adalah akurasi, presisi, linearitas, kisaran linearitas dan limit of quantification (LOQ) dengan menggunakan metode adisi.
Proses validasi ini menggunakan 81 sampel dibagi menjadi tiga perlakuan adisi. Adisi standar azoxystrobin yang dilakukan pada awal sebelum ekstraksi (Jalur A), sebelum clean up (Jalur B), dan sebelum determinasi GC (Jalur C). Tiap jalur diadisi dengan 9 tingkat konsentrasi azoxystrobin yang dibuat dari 1 µL, 2 µL, 3 µL, 5 µL, 7 µL, 10 µL, 13 µL, 16 µL,20 µL larutan intermediet B. Tiap konsentrasi pada masing-masing jalur direplikasi 3 kali. dan satu sampel blanko untuk semua keseluruhan proses. Adapun yang dimaksud proses ekstraksi,
clean up dan determinasi adalah sebagai berikut:
a. Ekstraksi QuEChERS. Timbang sampel sebanyak 81 sampel melon yang telah dihomogenkan dengan berat masing masing sampel 5 gram, masukan dalam tabung sentrifugasi 15mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog selama satu menit dengan kuat lalu vortex selama 2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Ambil semua supernatan dan lakukan kembali reekstraksi dengan menambahkan 5 ml asetonitril. Campurkan kedua hasil
supernatan yang diperoleh ±10 ml kemudian masukan dalam flakon dan keringkan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath.
b. Clean-up menggunakan SPE. Conditioning SPE dengan mengaliri 5ml metanol dan 5 ml aquabidest secara berurutan. Larutkan supernatan hasil ekstraksi yang telah dikeringkan ke dalam 500 µL aquabidest dan ultrasonifikasi selama 5 menit. Masukan hasil ultrasonifikasi ke dalam SPE yang telah diconditioning. Washing dengan mengaliri 5 ml aquabidest dan tunggu hingga kering. Elusi dengan 3 ml metanol dan tampung hasil menggunakan flakon kemudian keringkan. Tambahkan 2 µL DCB dan larutkan dalam 200 µL hexan kemudian injek ke GC dengan volume 2 µL.
c. Determinasi GC-ECD. Tambahkan 2 µL DCB pada hasil pengeringan
clean-up dan larutkan dalam 200 µL hexan kemudian injek ke GC dengan volume 2 µL.Akurasi dapat didapatkan dari hasil perolehan kembali pada tiap seri kadar kurva baku adisi. Presisi ditentukan dari hasil perhitungan simpangan baku (standard deviation). Linearitas dan limit of detection (LOD) diperoleh melalui kurva baku solven. Limit of quantification (LOQ) didapatkan dengan menggunakan kurva baku adisi.
G. Analisis Hasil Penulisan