BAB III METODE PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Penelitian ini merupakan analisis tingkat kelumit sehingga untuk
mencapai akurasi dan presisi yang baik diperlukan suatu metode analisis dengan
sensitivitas yang cukup tinggi. Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan
bahwa Sistem yang akan digunakan untuk analisis sesuai dengan tujuannya.
Optimasi terhadap sistem GC-ECD di lakukan dalam uji kesesuaian sistem.
Optimasi instrumen GC-ECD dilakukan sesuai dengan prosedur yang ditetapkan
2. Preparasi sampel dengan metode QuEChERS
a. Pengecekan kadar air dalam buah melon. Buah melon dibelah menjadi 4
bagian, diambil salah satu bagian tersebut secara acak. Dipotong sekecil
mungkin menggunakan pisau dan telenan yang sudah dicuci. Kemudian
diblender hingga halus. Ditimbang 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu
60°C. Replikasi sebanyak 3 kali. Hasil pengeringan ditimbang dan
dihitung berat rata-ratanya sebagai % kandungan air buah melon.
b. Penentuan waktu dan kecepatan sentrifugasi. Ditimbang dalam tabung
sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan
blender. Kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS. Gojog
larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan
disentrifugasi selama ( 5 menit, 10 menit dan 15 menit dalam 5000
rpm). Amati dan bandingkan jumlah supernatan yang terbentuk.
3. Pembuatan seri larutan baku Difenokonazol
a. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok induk). Sejumlah lebih
kurang 52.6 mg baku difenokonazol ditimbang dengan seksama lalu
dilarutkan ke dalam 1 mL toluen hingga didapat larutan stok induk 52,6
mg/mL.
b. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok A). Sebanyak 40 µL stok
konsentrasi sebesar 0.526 µg/µ L yang kemudian disebut dengan stok
A.
c. Pembuatan larutan intermediet. Sejumlah 10 µL stok A diambil dengan
Syringe add dalam 1000 µL heksan sehingga diperoleh larutan
intermediet dengan konsentrasi 0.526 x 10-2 µg/µL.
d. Pembuatan larutan kurva baku solven. Diambil sebanyak 20µL ; 15µL
; 10µL; 7 µL ;5µ L ; 4 µL; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok
B kemudian ditambahkan 2 µL DCB add hingga 200 µL dengan pelarut
heksan kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2
µL.
e. Pembuatan larutan kurva baku adisi .Diambil sebanyak 20µL ; 15µL ;
13 µL ; 10µL; 5µL ; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok B
kemudian ditambahkan 2 µL DCB ke dalam flakon berisi ekstrak
matriks yang telah kering add hingga 200 µL dengan pelarut heksan
kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2 µL.
f. Pencucian flakon wadah sampel supernatan. Flakon dicuci
menggunakan akuades kemudian aseton dilanjutkan dengan metanol
dan dikeringkan dalam oven.
g. Pencucian syringe. Syringe dicuci menggunakan aseton kemudian
metanol dan dilanjutkan dengan 5 µL standar difenokonazol. Diulangi
4. Optimasi Clean-Up SPE C18
a. Penentuan Kapasitas Solid Phase Extraction (SPE) C18. Ditimbang dalam tabung sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS.
Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan
disentrifugasi selama 5 menit dalam 5000 rpm. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil sebanyak 1 mL dimasukan
dalam flakon dan dikeringkan dalam oven 60°C hingga tercapai bobot
tetap. Replikasi 3 kali. Kemudian ditimbang dan dihitung rata-rata
berat setelah dikeringkan.
b. Optimasi Washing SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,
kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian
vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya
dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan
menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi
yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1
menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan
yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan
ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dalam 0,5 mL akuabides selanjutnya di-degassing dengan
ultrasonifikator selama 5 menit. Aplikasikan sampel yang telah
di-degassing ke dalam kolom SPE. Washing SPE C18 dengan berbagai macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL akuabides tanpa fraksinasi
; 5 mL metanol 5% dengan 5 fraksinasi ; 5 mL UPW 100% dengan 5
fraksinasi. Selanjutnya cuci ekstrak dalam flakon dengan 3 mL
metanol dan elusikan dalam kolom SPE kemudian ditampung dalam
flakon baru untuk dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas
nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan
dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke
dalam sistem GC-ECD.
c. Optimasi Elusi SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,
kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian
vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya
dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan
menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi
menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan
yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan
digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian
ditambahkan 2µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dengan 1 mL akuabides kemudian di-degassing dengan
ultrasonifikator selama 5 menit selanjutnya aplikasikan sampel ke
dalam kolom SPE C18. Washing dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL kemudian keringkan kolom dengan bantuan gas
nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan (1
mL ; 2 mL ; 3 mL ; 4 mL ; 5 mL) metanol. Masukan metanol ke dalam
flakon untuk mencuci ekstrak, kemudian aplikasikan ke dalam kolom
SPE. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon. Sampel
dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel
yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan
DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem
GC-ECD.
5. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung
sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama
Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon.
Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam
tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan
selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam
flakon supernatan sebelumnya lalu ditambahkan (7 µL ; 10 µL) Standar stok C
dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah
kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian diultrasonifikasi selama 5
menit. Sampel yang telah di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan
pipet Pasteur untuk dimasukan ke dalam SPE. Washing sampel dalam flakon
berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL dan diaplikasikan
dalam kolom SPE C18 lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol
digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak
tercuci bersih, aplikasikan ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas
nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan
ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem
GC-ECD.
Validasi metode analisis merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk
membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,
yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Perbedaaan langkah kerja validasi metode
dengan uji kesesuaian sistem adalah kurva baku yang digunakan. Kurva baku yang
digunakan dalam validasi metode analisis adalah kurva baku metode adisi dengan
menggunakan matriks ekstrak buah melon sedangkan pada uji kesesuaian sistem
kurva baku yang digunakan adalah kurva baku solven. Di bawah ini merupakan
langkah kerja secara umum untuk mendapatkan ekstrak buah melon yang siap diadisi:
Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender
ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam
QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit
kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan
5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam
flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke
dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan
selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon
supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan
di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dengan 0,5 mL akuabides kemudian didegassing selama 5 menit. Sampel yang telah
diaplikasikan ke dalam kolom SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak
dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL lalu keringkan kolom dengan
bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan
metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga
semua ekstrak tercuci bersih, lalu sedikit demi sedikit ekstrak tersebut diaplikasikan
ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.
Ekstrak yang didapatkan digunakan sebagai matriks untuk melakukan validasi
metode analisis. Parameter validasi metode yang dinilai adalah sebagai berikut :
a. Presisi (keterulangan) sistem GC-ECD. Presisi dapat ditentukan dari nilai
CV. Parameter presisi dapat diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL
larutan ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol stok B
1ul, 3ul, 5ul, 7ul, 10ul, 13ul, 15ul, 20ul, ke dalam sistem GC-ECD
sebanyak 3 kali. Respon yang berupa luas puncak difenokonazol dari
masing-masing konsentrasi larutan baku yang diperoleh dihitung nilai
rata-rata, SD dan %CV.
b. Linearitas hubungan konsentrasi baku difenokonazol dengan respon
sistem GC-ECD. Koefisien korelasi (r) merupakan parameter yang
diperlukan untuk menentukan linearitas hubungan massa baku
difenokonazol terhadap respon sistem GC-ECD yang telah optimal.
ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol 0,053 ; 0,0789 ;
0,105 ; 0,132 ; 0,184 ; 0,263 ; 0,395 ;0.526 ng/µL ke dalam sistem
GC-ECD. Linearitas hubungan antara massa difenokonazol yang diinjeksikan
terhadap respon alat, diplotkan dalam bentuk kurva baku dan dihitung
parameter statistiknya seperti intersep (a), slope (b), dan koefisien korelasi
(r) dengan menggunakan program powerfit.
c. Sensitivitas sistem GC-ECD. Sensitivitas sistem GC-ECD yang telah
optimal dapat diketahui dengan menghitung nilai IDL dan slope. Kedua
parameter sensitivitas tersebut dapat ditetapkan dengan menginjeksikan 2
µL larutan baku difenokonazol dengan konsentrasi kurva baku adisi ke
dalam sistem GC-ECD. Nilai IDL dan slope dapat dihitung dari
persamaan kurva baku hasil injeksi.
G. Analisis Hasil