BAB III METODE PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang dibuat adalah fase gerak yang telah didapat dari hasil optimasi pada penelitian sebelumnya yaitu toluena:n-heksana:metanol:dietilamin (19,75:3,75:5:1,5). Volume masing-masing pelarut diukur menggunakan buret dan ditampung ke dalam labu takar 50 mL lalu digojog agar homogen.
2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol
Baku kloramfenikol ditimbang seksama lebih kurang 10 mg, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dan dilarutkan dengan etanol sampai batas tanda, sehingga diperoleh larutan stok kloramfenikol 1000 ppm. Larutan stok diambil 1,5 menggunakan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL, dan diencerkan dengan etanol hingga batas tanda. Larutan digojog, sehingga diperoleh larutan baku kloramfenikol 300 ppm. Larutan ini siap untuk ditotolkan.
3. Pembuatan larutan baku lidokain HCl
Baku lidokain HCl ditimbang seksama lebih kurang 15 mg, dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml, dan dilarutkan dengan etanol sampai batas tanda. Larutan digojog, sehingga diperoleh larutan baku lidokain HCl 3000 ppm. Larutan ini siap untuk ditotolkan.
4. Pembuatan larutan baku campuran kloramfenikol:lidokain HCl (1:10)
Baku lidokain HCl ditimbang seksama lebih kurang 15 mg dan dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Baku kloramfenikol ditimbang seksama lebih kurang 10 mg, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dan dilarutkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
dengan etanol sampai batas tanda (larutan stok kloramfenikol). Larutan stok kloramfenikol diambil 1,5 menggunakan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL yang berisi 15 mg lidokain HCl, diencerkan dengan etanol sampai tanda batas, dan digojog, sehingga diperoleh larutan baku campuran kloramfenikol:lidokain HCl 300:3000 ppm (1:10).
5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan
lidokain HCl
Larutan baku kloramfenikol 300 ppm dan lidokain HCl 3000 ppm masing-masing ditotolkan sebanyak 1, 2 dan 3 µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering, pelat dikembangkan di dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase gerak. Setelah mencapai jarak pengembangan 10 cm, pelat dikeluarkan, dan dikeringkan. Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan merekam pola spektra absorbsi masing-masing seri jumlah pada daerah panjang gelombang 200-400 nm menggunakan densitometer. Overlapping spektra kloramfenikol dan lidokain HCl ditentukan secara berturut-turut pada seri jumlah kloramfenikol 300, 600, 900 ng dan lidokain HCl 3000, 6000, 9000 ng.
6. Pembuatan kurva baku
Larutan baku tunggal kloramfenikol 300 ppm dan lidokain HCl 3000 ppm masing-masing ditotolkan dengan volume penotolan 1; 1,5; 2; 2,5; dan 3 µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering, pelat dikembangkan di dalam bejana kromatografi yang telah jenuh oleh fase gerak. Pelat dikeluarkan dari bejana setelah mencapai jarak pengembangan 10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
cm, dikeringkan, dan diukur AUC-nya dengan densitometer pada panjang gelombang pengamatan. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Dibuat kurva baku hubungan antara jumlah analit (ng) dan AUC, sehingga didapatkan persamaan kurva baku masing-masing senyawa. Dipilih persamaan kurva baku yang memiliki nilai r > 0,999 untuk kloramfenikol dan lidokain HCl.
7. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) baku tunggal
Larutan baku tunggal kloramfenikol 300 ppm dan lidokain HCl 3000 ppm masing-masing ditotolkan sebanyak 1, 2 dan 3 µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering, pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Setelah mencapai jarak pengembangan 10 cm, pelat dikeluarkan, dikeringkan, dan discanning menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin 5, sehingga didapatkan jumlah kloramfenikol dan lidokain HCl. Berdasarkan data yang diperoleh maka recovery dan KV-nya dapat dihitung. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
8. Penentuan recovery dan KV baku campuran kloramfenikol:lidokain
HCl 300:3000 ng, 600:6000 ng, dan 900:9000 ng
Larutan baku campuran kloramfenikol:lidokain HCl 1:10 ditotolkan sebanyak 1, 2, dan 3 µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering, pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Setelah mencapai jarak pengembangan 10 cm, pelat dikeluarkan, dikeringkan, dan discanning menggunakan densitometer pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin 5, sehingga didapatkan jumlah kloramfenikol dan lidokain HCl. Berdasarkan data yang diperoleh maka recovery dan KV-nya dapat dihitung. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
9. Penentuan recovery dan KV adisi baku dalam sampel
a. Penyiapan larutan stok sampel. Dua sampel obat tetes telinga Colme® dikeluarkan isinya dan dihomogenkan. Sebanyak 1 ml larutan sampel diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dilarutkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen (LSA). Sebanyak 2 mL larutan sampel diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dilarutkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen (LSB). Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
b. Penyiapan larutan sampel tanpa penambahan baku kloramfenikol (LSK). Sebanyak 0,4 mL LSA diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen. Larutan ini siap untuk ditotolkan. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
c. Penyiapan larutan sampel tanpa penambahan baku lidokain HCl. (LSL). Sebanyak 2,5 mL LSB diambil dengam mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL, diencerkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen. Larutan ini siap untuk ditotolkan. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
d. Penyiapan larutan sampel dengan penambahan baku kloramfenikol (LSAK). Sebanyak 0,4 mL LSA dan 2 mL larutan baku kloramfenikol 1000 ppm dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen. Larutan ini siap untuk ditotolkan. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
e. Penyiapan larutan sampel dengan penambahan baku lidokain HCl (LSAL). Sebanyak 5 mL LSB diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang berisi 20 mg lidokain HCl, diencerkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen. Larutan ini siap untuk ditotolkan. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
f. Pengembangan dan pengukuran. LSK, LSL, LSAK, dan LSAL ditotolkan sebanyak 1 µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering, pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Setelah mencapai jarak pengembangan 10 cm, pelat dikeluarkan, dikeringkan, dan discanning menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin 5, sehingga didapatkan jumlah kloramfenikol dan lidokain HCl yang ditambahkan. Berdasarkan data yang diperoleh maka recovery dan KV-nya dapat dihitung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30