METODOLOGI PENELITIAN
D. Alat Penelitian
1. Alat pengeringan, penyerbukan dan penyarian : oven, blender, ayakan, kertas saring, alat-alat gelas (pipet tetes, gelas ukur, Beaker glass, corong, pengaduk). 2. Alat kromatografi dan spektroskopi Ultraviolet : seperangkat alat spektroskopi
UV-Vis (Genesys 6), vakum, pipa kapiler, lampu 365 nm, seperangkat alat kromatografi kolom, alat-alat gelas (corong pisah, Beaker glass, gelas ukur, pipet), kertas saring.
E. Jalannya Penelitian 1. Determinasi tanaman pegagan embun
Determinasi dilakukan terhadap tanaman pegagan embun di laboratorium Farmakognosi Fitokimia menurut Backer dan Backhuizen van de Brink (1963).
27
2. Pengumpulan bahan
Herba segar dari pegagan embun dikumpulkan pada bulan januari 2006 pada musim penghujan dari daerah Paingan, Yogyakarta. Pencucian dilakukan terlebih dahulu untuk menghilangkan kotoran yang menempel seperti debu dan serangga. Bagian herba juga dipisahkan dari bagian tanaman lain yang terikut saat pengumpulan.
3. Pengeringan herba pegagan embun
Herba pegagan embun dikeringkan tanpa dirajang terlebih dahulu karena herba yang tipis.Pengeringan dilakukan dalam oven pada suhu 40ºC selama 5 jam. Dikatakan kering jika herba pegagan embun sudah dapat hancur ketika diremas dengan tangan.
4. Penyerbukan herba pegagan embun
Herba pegagan embun yang telah dikeringkan kemudian diserbuk menggunakan blender, lalu diayak.
5. Ekstraksi herba pegagan embun
Penyarian dilakukan dengan memaserasi terlebih dahulu simplisia yang telah digiling menjadi serbuk dengan campuran pelarut pertama yaitu metanol : air (9 :1) secukupnya hingga terbentuk bubur cair. Campuran dibiarkan selama 6 – 12 jam, di tempat yang terlindung cahaya pada suhu kamar. Untuk pemisahan serbuk dan cairan hasil penyarian, dilakukan penyarian menggunakan corong dengan kapas. Bagian serbuk disari lagi dengan
pelarut metanol : air (1:1), dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas. Kedua hasil penyarian dicampur, diuapkan hingga tinggal sepertiga atau pelarutnya hampir menguap semua (Mursyidi, 1990).
6. Fraksinasi flavonoida dengan kromatografi kolom vakum
Kolom yang digunakan mempunyai diameter 4 cm dan mempunyai tinggi 20 cm.
a. Cara membuat fase diam
Sejumlah selulosa dimasukkan ke dalam Beaker glass kemudian diaduk hingga berbentuk bubur (slurry) menggunakan aquadest.
Bubur selulosa dimasukkan ke dalam kolom setinggi 5 cm dengan bantuan corong dan batang pengaduk.
b. Penempatan sampel
Sebanyak 1,0 gram ekstrak kering diletakkan di atas fase diam. c. Pemisahan fraksi
Sebanyak 25 ml fase gerak dituang di atas sampel, kemudian divakum sampai semua fase gerak tersedot keluar. Hal tersebut dilakukan 15 kali sampai fraksi yang dihasilkan berwarna bening. Masing-masing fraksi lalu dipekatkan. 7. Identifikasi flavonoida dengan KLT
Kandungan flavonoida fraksi dari hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom vakum diperiksa dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi ditotolkan pada lempeng selulosa, kemudian dikembangkan dengan jarak pengembangan 8 cm dari totolan menggunakan pelarut BAW (n-butanol:asam asetat:air = 4:1:5 v/v,
29
fase atas) hingga batas yang ditetapkan. Bercak dideteksi menggunakan uap amonia, dan lampu UV 365 nm.
8. Isolasi flavonoida dengan KLT preparatif
Dilakukan isolasi KLT preparatif dalam fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas). Isolat ditotolkan berupa garis yang selanjutnya dikembangkan, dan didapatkan pemisahan bercak. Hasil kerokan diekstraksi dengan metanol kemudian disaring dengan kertas saring. Maka diperoleh isolat flavonoida untuk diuji kemurnian, reaksi warna, dan spektroskopi ultraviolet.
9. Pemeriksaan kemurnian isolat senyawa flavonoida
Kemurnian isolat flavonoida dapat diketahui menggunakan lempeng kromatrografi dengan menotolkan pada dua lempeng yang masing-masing dikembangkan menggunakan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas) dan asam asetat 15 %.
10. Reaksi warna flavonoida
Isolat senyawa flavonoida dianalisis reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi warna :
a. Natrium hidroksida 4% (larutan ini dibuat dengan melarutkan 4 g NaOH dalam air bebas CO2 hingga 100 ml), 3 tetes larutan isolat flavonoida pada
droping plate ditambah dengan 1 tetes larutan natrium hidroksida, warna yang terjadi dicatat.
b. Logam magnesium dan asam klorida, 3 tetes larutan isolat flavonoida pada droping plate ditambah sedikit serbuk magnesium dan asam klorida, warna yang terjadi dicatat.
c. Asam sulfat pekat 98%, 3 tetes larutan isolat flavonoida pada droping plate ditambah dengan 1 tetes larutan asam sulfat pekat 98%, warna yang terjadi dicatat.
11. Identifikasi spektra senyawa flavonoida dengan spektroskopi ultra violet Tiap isolat senyawa flavonoida yang telah diperiksa kemurniannya, diencerkan dengan metanol sampai konsentrasi 0,2% dan kemudian dilakukan pembacaan absorbansi melalui tahapan sebagai berikut :
a. isolat flavonoida dimasukkan dalam kuvet sampel dan ke dalam kuvet pembanding diisikan metanol. Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 200 – 500 nm.
b. Penambahan pereaksi geser NaOH, pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan segera setelah penambahan 3 tetes NaOH 2 N. Untuk memeriksa apakah ada penguraian pergeseran panjang gelombang diperiksa lagi setelah 5 menit, kemudian cuplikan dibuang dan kuvet yang telah dicuci diisi dengan larutan isolat persediaan.
c. Penambahan pereaksi geser AlCl3, pembacaan absorbansi pada panjang
gelombang 200 – 500 nm dilakukan setelah penambahan larutan AlCl3
pada isolat flavonoida. Selanjutnya dibaca lagi absorbansi setelah penambahan 3 tetes HCl.
31
d. Penambahan pereaksi geser natrium asetat, pembacaan pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan dengan cara serbuk natrium asetat dimasukkan dalam kuvet berisi 2 -3 ml isolat flavonoida lalu digojog, sedemikian rupa sehingga terdapat kira-kira 2 mm lapisan natrium asetat pada dasar kuvet. Pembacaan dilakukan setelah 2 menit penambahan natrium asetat.
e. Penambahan pereaksi geser natrium asetat / H3BO3, pembacaan absorbansi
pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan dengan cara serbuk H3BO3 dimasukkan ke kuvet berisi 2 ml isolat flavonoida, larutan
dijenuhkan secepatnya dengan serbuk kasar natrium asetat lalu dibaca absorbansinya. Pembacaan absorbansi dilakukan pada kecepatan 50 nm per menit.
12. Pembuatan pereaksi geser (Markham, 1988) a. Natrium hidroksida (NaOH)
Pereaksi NaOH menggunakan larutan NaOH 2 M dalam air. b. Natrium asetat (NaOAc)
Digunakan serbuk NaOAc anhidrat. c. Alumunium klorida (AlCl3)
Sebanyak 5 g AlCl3 ditambahkan ke dalam 100 ml metanol.
d. Asam hidroklorida (HCl)
Sejumlah 50 ml HCl pekat ditambahkan ke dalam 100 ml aquadest. e. Asam borat (H3BO3)
