3. METODOLOGI PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penentuan kadar proksimat dan asam amino Kablang
Analisis proksimat yang dilakukan meliputi penentuan kadar air, abu, protein, lemak, serat kasar dan karbohidrat.
Analisis proksimat : - Air - Abu - Protein - Lemak - Serat kasar - Karbohidrat
Siput laut Nerita sp kering
Analisis komposisi asam amino
Uji Inhibitor Topoisomerase
Isolasi senyawa ekstrak aktif
Isolat senyawa aktif Ekstraksi dengan pelarut non polar, semipolar dan polar
Ekstrak aktif Ekstrak kasar Karakterisasi ekstrak aktif : - Uji Ninhidrin - Uji Molish - Uji L Burchard - Uji Bradford
Uji Fitokimia ekstrak aktif :
- Alkaloid - Flavonoid
- Steroid/triterpenoid - Saponin
22
Analisis kadar air (AOAC 1995)
Cawan kosong yang digunakan dikeringkan dalam oven selama 15 menit atau sampai diperoleh berat tetap, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang. Sampel sebanyak 2 g ditimbang dan diletakkan dalam cawan kemudian dipanaskan dalam oven sampai berat tetap pada suhu 105 – 110 o
C. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator dan setelah dingin ditimbang kembali. Persentase kadar air dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Keterangan :
B = berat sampel (g)
B1 = berat (sampel + cawan) sebelum dikeringkan (g) B2 = berat (sampel + cawan) setelah dikeringkan (g)
Analisis kadar abu (AOAC 1995)
Pengukuran kadar abu ditentukan dengan gravimetri. Cawan porselin dipanaskan dalam oven kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 3 – 5 g sampel dimasukkan dalam cawan porselin lalu dibakar sampai tidak berasap lagi lalu diabukan pada suhu 600 oC sampai berwarna putih (semua contoh menjadi abu) dan berat konstan. Setelah itu didinginkan dalam desikator dan ditimbang.
Perhitungan kadar abu adalah sebagai berikut :
Analisis kadar protein (AOAC 1995)
Ditimbang sejumlah kecil contoh (1 - 2 g) lalu dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. Setelah itu ditambahkan 1,9 g K2SO4: 40 mg HgO dan 2,0 ± 0,1 ml H2SO4 dan kemudian contoh dididihkan sampai cairan jernih. Larutan jernih ini lalu dipindahkan ke dalam alat destilasi. Labu Kjeldahl dicuci dengan air (1 – 2) ml kemudian air cucian dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan 8 – 10 ml larutan NaOH-Na2S2O3. Di bawah kondensor diletakkan erlenmeyer yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2 - 4 tetes indikator (campuran 2 bagian metil merah 0,2 % dan
% 100 x B B B (%) air Kadar = 1− 2 100% x (g) sampel berat (g) abu berat (%) abu Kadar =
1 bagian metilen biru 0,2 % dalam alkohol). Ujung tabung kondensor harus terendam dalam larutan H3BO3. Setelah itu isi erlenmeyer diencerkan sampai 50 ml dan dititrasi dengan HCl 0,02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Proses yang sama dilakukan terhadap blanko. Kadar nitrogen ditentukan sebagai berikut :
% Protein = % N x 6,25 Keterangan:
14,007 = berat atom Nitrogen
6,25 = faktor konversi protein-nitrogen untuk ikan dan produk sampingannya
Analisis kadar lemak (AOAC 1995)
Metode yang digunakan dalam analisis lemak adalah metode ekstraksi soxhlet. Pertama kali labu lemak yang akan digunakan dikeringkan di dalam oven, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang beratnya. Contoh sebanyak 5 g dibungkus dengan kertas saring, setelah itu kertas saring yang berisi contoh tersebut dimasukkan dalam alat ekstraksi soxhlet. Alat kondensor diletakkan di atasnya dan labu lemak diletakkan di bawahnya. Pelarut heksana dimasukkan ke dalam labu lemak secukupnya. Selanjutnya dilakukan refluks selama minimal 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih.
Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi, dan pelarut ditampung kembali. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 oC hingga mencapai berat tetap dan setelah itu didinginkan dalam desikator. Selanjutnya labu beserta lemak didalamnya ditimbang dan berat lemak dapat diketahui. Kadar lemak ditentukan sebagai berikut : 100% x (g) sampel berat (g) lemak berat (%) lemak Kadar =
Analisis serat kasar (AOAC 1995)
Sebanyak 1 g sampel kering dilarutkan dengan 100 ml H2SO4 1,25%, dipanaskan hingga mendidih lalu didestruksi selam 30 menit. Selanjutnya larutan disaring menggunakan kertas saring dengan bantuan corong Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20-30 ml air mendidih dan dengan 25 ml air
mg) ( sampel berat 100% x 14,007 x HCl N x blanko) HCl ml sampel ml ( (%) N = −
24
sebanyak 3 kali. Residu didestruksi kembali dengan 100 ml NaOH 1,25% selama 30 menit. Larutan disaring dengan cara seperti di atas dan dibilas berturut-turut dengan 25 ml H2SO4 1,25% mendidih, 2,5 ml air sebanyak tiga kali dan 25 ml alkohol. Residu beserta kertas saring dipindahkan ke cawan porselin dan dikeringkan dalam oven 130 °C selama 2 jam. Setelah dingin residu beserta cawan porselin ditimbang (A), lalu dimasukkan dalam tanur 600 °C selama 30 menit, didinginkan dan ditimbang kembali (B). Kadar serat kasar ditentukan sebagai berikut: 100% x W2 W1 - W3 (%) kasar serat Kadar = Keterangan :
W1 = bobot residu setelah dibakar dalam tanur = B – (bobot cawan) ; B : bobot residu + cawan W2 = berat contoh (gram)
W3 = bobot residu sebelum dibakar dalam tanur
= A – (bobot kertas saring+cawan); A: bobot residu+kertas saring+cawan.
Analisis kadar karbohidrat (Apriyantono et al. 1989)
Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan menggunakan metode by difference, yaitu pengurangan 100 % dengan jumlah dari hasil analisis kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan serat kasar). Perhitungannya adalah sebagai berikut:
3.3.1.2 Analisis asam amino (AOAC 1995)
Komposisi asam amino ditentukan dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Sebelum dipakai, perangkat HPLC harus dibilas dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan harus dibilas dengan akuades. Analisis asam amino dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu: (1) tahap pembuatan hidrolisat protein; (2) tahap pengeringan; (3) tahap derivatisasi; (4) tahap injeksi serta analisis asam amino.
Kadar karbohidrat (%) = 100% - % kadar (air + abu + protein + lemak + serat kasar)
(1) Tahap pembuatan hidrolisat protein
Untuk preparasi sampel yaitu tahap pembuatan hidrolisat protein, sampel ditimbang sebanyak 0,1 g dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur ditambah dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 ml yang kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100 oC selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan. Setelah pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring dengan menggunakan milipore berukuran 45 mikron.
(2) Tahap pengeringan
Hasil saringan diambil sebanyak 10 µl dan ditambah dengan 30 µl larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamin dengan perbandingan 2:2:1. Setelah ditambahkan larutan pengering, dilakukan pengeringan dengan pompa vakum untuk mempercepat proses dan mencegah oksidasi.
(3) Tahap derivatisasi
Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan. Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiodotiosianat, dan trimetilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 10 ml asetonitril 60% dan natrium asetat 1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali dengan menggunakan milipore berukuran 0,45 µm.
(4) Injeksi ke HPLC
Hasil saringan diambil sebanyak 20 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Untuk perhitungan konsentrasi asam amino pada bahan, dilakukan pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino standar yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.
Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino: Temperatur Kolom : 38 oC
Jenis kolom : Pico tag 3.9 x 150 nm column Kecepatan alir eluen : 1 ml/menit
Program : Gradien
26
Fase gerak : Asetonitril 60 % dan Natrium asetat 1 M 40 % Detektor : UV/ 254 nm
Merk : Waters
Kandungan asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus yaitu presentase asam amino dalam 100 g sampel :
luas area sampel x 2,5 mol/ml x 5 ml x BMA x 100 luas area standar
Asam amino (%) =
Bobot sampel (0,25 g)
Keterangan :
BMA = berat molekul asam amino