Pengujian dilakukan untuk deteksi DNA L. monocytogenes kultur murni dan sampel pangan spike (SPS). Sensitivitas dari realtime PCR untuk deteksi
L. monocytogenes ditentukan dengan pembuatan kurva standar hubungan nilai
threshold cycle (CT) dan log konsentrasi kultur murni. Kurva standar memberikan persamaan linear yang digunakan untuk mengukur limit deteksi
L. monocytogenes dalam sampel pangan. Persamaan linear kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi bakteri yang belum diketahui dalam suatu kultur. Konsentrasi kultur L. monocytogenes dapat dihitung dengan memasukkan nilai CT hasil amplifikasi sebagai nilai y pada persamaan linear, kemudian nilai x yang diperoleh dicari nilai antilog-nya.
Tahapan pertama persiapan sampel untuk kultur murni diawali dengan membuat serial pengenceran dari pengenceran tertinggi sampai terendah yang
masih dapat dideteksi, dengan konsentrasi bakteri dalam kultur antara 100 - 109 CFU/mL. Langkah selanjutnya dilakukan pengambilan 1 mL untuk
ekstrasi DNA dan 1 mL lainnya untuk dihitung konsentrasi bakterinya dengan metode pencawanan (FDA 2001). DNA y a n g diekstrak dari beberapa tingkat pengenceran tersebut kemudian diamplifikasi dengan rt-PCR. Perpotongan kurva amplifikasi yang dihasilkan dengan basement-threshold
menghasilkan nilai CT. Sampel yang dipakai untuk pembuatan kurva standar L. monocytogenes ditentukan berdasarkan :
a. Sampel yang masih terdeteksi jumlah koloninya pada saat pencawanan b. Sampel yang nilai CT nya di bawah nilai siklus tertinggi yang masih
menunjukkan spesifisitas primer (berdasarkan uji spesifisitas primer)
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemilihan Metode Ekstraksi DNA
Salah satu tahap penting dalam analisis DNA dengan metode PCR yaitu tahap ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA menjadi titik kritis yang sangat mempengaruhi hasil analisis. Jumlah dan mutu DNA hasil ekstraksi akan mempengaruhi analisis lebih lanjut dengan PCR. Hasil ekstraksi DNA menggunakan tiga metode pada penelitian ini dievaluasi melalui tahap elektroforesis menggunakan gel agarose. Hasil visualisasi DNA dengan gel elektroforesis berupa pita DNA genom dari masing-masing metode ekstraksi (Gambar 4).
Hasil elektroforesis terhadap DNA L. monocytogenes (Gambar 4) menunjukkan bahwa metode ekstraksi fenol: kloroform yang dimodifikasi dari Sambrook dan Russel (2001) menghasilkan pita yang paling jelas dibanding dua metode lainnya. Hal ini dimungkinkan karena konsentrasi yang dihasilkan dari ekstraksi fenol:kloroform yang lebih tinggi dibandingkan metode lainnya (Tabel 3). Pita yang dihasilkan dengan metode fenol:kloroform ada 3 pita, yaitu
12
pita yang terdapat di antara marker 500 bp dan 1000 bp, di antara marker 1000 bp dan 1500 bp, serta di atas 10000 bp.
Keterangan : a. Kontrol
b. DNA hasil isolasi metode fenol:kloroform
c. DNA hasil isolasi metode pemanasan
d. DNA hasil isolasi metode kit komersial
e. DNA ladder 1kb
Gambar 4. Hasil elektroforesis pada tahap ekstraksi DNA Tabel 3. Kemurnian dan konsentrasi DNA
Metode Ekstraksi
Kultur murni Sampel pempek spike
A260/A280 Konsentrasi DNA (ng/µ L) A260/A280 Konsentrasi DNA (ng/µ L) Fenol:kloroform 1.24 1857 1.28 1406 Pemanasan 0.40 1027 - - Kit komersial 0.76 915 0.70 656
DNA dikatakan murni jika rasio diantara kedua nilai absorbansi 260 dan 280 berada di kisaran 1.8 (Nolan et al. 2007). Pengukuran kemurnian DNA (Tabel 3) menunjukkan bahwa DNA yang dihasilkan dari metode fenol:kloroform untuk sampel kultur murni dan sampel pempek spike masih terdapat pengotor lain ditunjukkan oleh nilai rasio A260 dan A280 di bawah 1.8. Pengotor yang diduga menyebabkan hal tersebut diduga adalah protein. Hal ini dapat disebabkan karena kurangnya proses pencucian menggunakan isopropanol. Bettelheim et al. (2013) menjelaskan bahwa isopropanol dapat meningkatkan kemurnian DNA dengan mengoptimalkan proses pembuangan residu protein.
Hasil ekstraksi metode pemanasan menghasilkan konsentrasi DNA dari kultur murni yang lebih kecil dibanding metode fenol:kloroform, hal ini dapat disebabkan karena rusaknya sebagian DNA karena pengaruh suhu 95 °C. Menurut Sambrook dan Russel (2001) pendidihan dapat memiliki potensi mendenaturasi DNA menjadi irreversibel. Metode pemanasan tidak dapat diaplikasikan untuk sampel pempek dikarenakan perlakuan pemanasan ternyata menggumpalkan pati dari sampel pempek yang terbuat dari campuran ikan dan tapioka. Coral et al. (2009) menjelaskan bahwa, pati secara umum akan mulai tergelatinisasi ketika mencapai suhu di atas 70 °C.
13
Metode kit komersial QIAmp DNA Blood Mini Kit telah digunakan sebelumnya oleh Dauphin et al. (2009), Nur’utami et al. (2011) dan Dibbern et al. (2015). Metode kit komersial oleh Dauphin et al. (2009) yang digunakan untuk bakteri Brucella menghasilkan DNA yang memiliki kemurnian yang kurang baik dimana nilai rasio A260/A280 lebih kecil dari 1.8, sedangkan penelitian Dibbern et al. (2015) pada bakteri S. aureus justru menunjukkan bahwa metode kit QIAmp DNA Blood Mini Kit justru menghasilkan kemurnian DNA yang lebih baik dari metode lainnya pada rasio A260/A280 sebesar 1.76.
Metode yang dikembangkan oleh Nur’utami et al. (2011) dengan modifikasi penggunaan CTAB untuk pelisisan awal menghasilkan kemurnian DNA
Salmonella Typhimurium yang baik sekitar 2.0. Hal ini berbeda dengan hasil penelitian kali ini yang menghasilkan kemurnian DNA di bawah 1.0. Konsentrasi yang dihasilkan metode kit juga lebih rendah dibanding metode fenol:kloroform baik untuk sampel kultur murni maupun sampel pempek spike. Hal ini dimungkinkan karena CTAB yang digunakan sebagai pengganti tissue lysis buffer (buffer ATL) kurang optimal jika digunakan untuk bakteri Gram positif.
Buffer ATL direkomendasikan oleh produsen sebagai buffer yang digunakan dalam pelisisan jaringan sel. Ekstraksi DNA selanjutnya dilakukan dengan metode fenol:kloroform.
Konfirmasi Spesifisitas Primer
Tahapan awal sebelum penentuan spesifisitas primer yaitu pemilihan primer yang sesuai untuk deteksi L. monocytogenes. Penelitian ini menggunakan dua pasang primer berbeda. Masing-masing pasangan primer diuji menggunakan PCR standar. Masing-masing primer dianalisis dengan menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) dan ditentukan data spesies yang memiliki kecocokan 100% terhadap urutan sekuens primer yang dianalisis (Lampiran 9, 10, 11 dan 12). Untuk mengkonfirmasi bahwa kedua primer tersebut spesifik terhadap L. monocytogenes maka dilakukan pengujian dengan PCR standar dan rt-PCR.
Primer LIM 2/LIMRE digunakan untuk mengamplifikasi gen iap. Gen iap
(invasion associated secreted endopeptidase) merupakan gen yang memegang peranan penting pada viabilitas sel L. monocytogenes. Gen iap memproduksi protein p60 yang mempunyai aktivitas bakteriolitik (Kohler et al. 1991). Gen
iap hanya terdapat pada L. monocytogenes dan tidak terdapat pada bakteri lain yang digunakan sebagai kontrol. Hal ini sesuai dengan hasil BLAST yang menunjukkan bahwa kecocokan 100% dari primer forward (LIM 2) dan reverse
(LIMRE) hanya berasal dari spesies Listeria saja (Lampiran 9 dan 10). Hasil PCR standar dengan primer LIM 2/LIMRE menunjukkan adanya pita (band) yang terbentuk pada hasil elektroforesis produk amplifikasi PCR dengan ukuran di bawah 200 bp pada semua sampel (Gambar 5). Hal ini menunjukkan bahwa kondisi running untuk primer LIM 2/LIMRE belum baik karena masih menghasilkan produk non spesifik.
Primer DG69/DG74 mengamplifikasi gen hlyA yang berperan dalam produksi 58 kDa listeriolysin O yang menjadi penentu virulensi dan banyak digunakan untuk mendeteksi L. monocytogenes (Choi dan Hong 2003). Listeriolysin O ini merupakan toksin penyebab terjadinya hemolisis (kerusakan sel darah merah) yang masuk
14
kategori α-hemolitik. Bakteri lain yang digunakan sebagai kontrol juga mempunyai kemampuan hemolitik, antara lain E. coli ATCC 25922 (Snyder dan Carson 2010),
S. aureus ATCC 25923 (Mak et al. 2008) dan C. sakazakii ATCC 29544 (Fakruddin et al. 2014) yang ketiga-tiganya termasuk kategori β-hemolitik. Sedangkan L. plantarum ATCC 8014 tidak mempunyai sifat hemolitik. Hasil PCR standar dengan primer DG69/DG74 menunjukkan adanya pita 635 bp hanya pada DNA L. monocytogenes (Gambar 5). Hal ini sesuai dengan hasil BLAST yang menunjukkan bahwa kecocokan 100% dari primer forward (DG69) dan reverse (DG74) hanya berasal dari spesies Listeria saja (Lampiran 11 dan 12).
Perbandingan hasil kedua primer (Gambar 5) menunjukkan bahwa primer DG69/DG74 lebih cocok digunakan untuk deteksi L. monocytogenes. Selain itu, primer DG69/DG74 lebih banyak dipakai pada penelitian-penelitian sebelumnya untuk deteksi L. monocytogenes dibanding primer LIM 2/LIMRE. Amplikon primer DG69/DG74 berada pada ukuran 635 bp sehingga lebih mudah dibedakan dari produk non spesifik maupun primer dimer.
Keterangan: a. Ladder 100bp b.Kontrol tanpa DNA c. DNA L. monocytogenes
ATCC 7644
d. DNA S. aureus ATCC 25923
e. DNA C. sakazakii ATCC 29544
(a) (b)
Gambar 5. Hasil elektroforesis produk PCR dengan primer (a) LIM 2/LIMRE dan (b) DG69/DG74
Pengujian spesifisitas primer dilakukan untuk menentukan kemampuan primer dalam membedakan DNA bakteri target dengan bakteri lain. Hasil uji spesifisitas primer DG69/DG74 dengan rt-PCR menunjukkan bahwa kondisi
running yang dipakai dapat mendeteksi DNA L. monocytogenes dengan hasil kurva amplikasi yang baik sampai siklus 27 (Gambar 6). Setelah siklus ke-27, kondisi running tersebut tidak spesifik lagi karena dapat menghasilkan produk non-spesifik pada sampel L. plantarum, S. aureus, C. sakazakii, E. coli, dan kontrol tanpa DNA.
Berdasarkan hasil BLAST, kontrol bakteri lain yang digunakan tidak satupun yang memiliki kecocokan 100 % terhadap sekuens primer yang digunakan. Sehingga, adanya produk hasil amplifikasi pada DNA kontrol bakteri lain setelah siklus ke-27 menunjukkan munculnya produk non spesifik atau primer dimer. Penggunaan SYBR Green secara umum kurang spesifik dibanding metode lain seperti Taqman. Hal ini disebabkan karena SYBR green dapat berikatan dengan DNA rantai ganda non-spesifik ataupun terjadinya primer dimer (Jenie 2013). Primer-dimer merupakan proses saling berikatannya primer
15
yang teramplifikasi dan terkuantifikasi sehingga menghasilkan data false-positive (Pestana et al. 2010). Menurut Altshuler (2006), munculnya primer dimer dan produk non-spesifik dapat dikurangi dengan optimasi kondisi running. Oleh karena itu, metode rt-PCR menggunakan SYBR Green biasanya diikuti dengan analisis kurva melting untuk melihat suhu pelelehan (Tm) dari masing-masing sampel. Keterangan : a. L. monocytogenes ATCC 7644 b. L. monocytogenes ATCC 13932 c. L. plantarum ATCC 8014 d. S. aureus ATCC 25923 e. C. sakazakii ATCC 29544
f. Kontrol tanpa DNA g. E. coli ATCC 25922 Gambar 6. Kurva amplifikasi uji spesifisitas primer DG69/DG74 dengan rt-PCR
Nilai Tm merupakan suhu ketika 50 % DNA untai ganda telah terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal (Esco 2009). Hasil analisis nilai Tm dengan primer DG69/DG74 (Tabel 4) menunjukkan bahwa L. monocytogenes dapat dibedakan dari C. sakazakii dan E. coli; sedangkan L. monocytogenes, L. plantarum, dan S. aureus tidak dapat dibedakan karena memiliki Tm yang sama (79 °C).
Tabel 4. Hasil analisis kurva melting
Kode Sampel DNA Nilai Tm ( °C)
a. L. monocytogenes ATCC 7644 79.0 b. L. monocytogenes ATCC 13932 79.0
c. L. plantarum ATCC 8014 79.0
d. S. aureus ATCC 25923 79.0
e. C. sakazakii ATCC 29544 75.5
f. Kontrol tanpa DNA 76.5
g. E. coli ATCC 25922 73.5
Analisis nilai Tm setelah tahap amplifikasi merupakan metode alternatif dari analisis gel elektroforesis untuk penentuan kemurnian hasil amplikon (Dwight et al. 2011). Oleh karena itu, analisis nilai Tm dapat mendeteksi adanya
mispriming ataupun primer dimer lebih cepat dibanding analisis gel elektroforesis. Manfaat lain dari analisis nilai Tm yaitu penentuan variasi genetik dengan mudah tanpa proses sekuensi (Erali dan Wittwer 2010; Montgomery et al. 2010).
16
Penentuan Limit Deteksi DNA L. monocytogenes
Limit deteksi merupakan nilai pengenceran tertinggi yang masih dapat teramplifikasi yang menunjukkan sensitivitas deteksi suatu metode. Limit deteksi rt-PCR menggunakan primer DG69/DG74 ditentukan dari konsentrasi saat nilai CT = 27 (berdasarkan tahap konfirmasi spesifisitas primer). Hasil analisis limit deteksi pada sampel kultur murni dan sampel pempek spike dengan rt-PCR
menghasilkan data nilai CT dan nilai Tm dari masing-masing konsentrasi
L. monocytogenes (Tabel 5).
Tabel 5. Hasil analisis rt-PCR DNA L. monocytogenes
Kultur murni Sampel pempek spike
Konsentrasi (CFU/mL) CT Tm ( °C) Jumlah koloni (CFU/g) CT Tm ( °C) 4.3 x 109 8.06 78.5 4.1 x 108 9.32 79.0 5.7 x 108 11.59 78.5 4.1 x 107 12.60 79.0 5.6 x 107 12.67 78.5 4.4 x 106 16.04 79.0 5.8 x 106 16.17 78.5 4.4 x 105 20.94 79.0 4.9 x 105 21.07 78.5 4.8 x 104 24.28 79.0 5.3 x 104 23.23 79.0 4.4 x 103 26.93 79.0 4.2 x 103 27.13 79.0 < 1.0 x 103 27.27 79.5 5.8 x 102 33.86 78.5
Hasil nilai CT pada kultur murni dan sampel pempek spike (Tabel 5) menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi L. monocytogenes maka nilai CT akan semakin kecil. Hal ini terjadi karena konsentrasi bakteri yang semakin tinggi akan menghasilkan DNA terekstrak yang lebih banyak, sehingga semakin tinggi DNA yang terekstrak maka semakin cepat mencapai garis basement-threshold
saat proses amplifikasi berjalan (Applied Biosystems 2015). Hasil analisis nilai Tm pada kultur murni dan sampel pempek spike yang berada pada nilai 79 ± 0.5 menunjukkan bahwa bahwa kondisi running yang diterapkan telah spesifik dan tidak terjadi mispriming.
Hasil analisis deteksi L. monocytogenes dengan rt-PCR (Tabel 5) dapat dibuat kurva standar hubungan nilai CT dan konsentrasi L. monocytogenes. Kurva standar yang dihasilkan pada kultur murni (Gambar 7) memiliki persamaan:
CT : Nilai CT
C : Nilai Log Konsentrasi bakteri (CFU/mL)
Sedangkan kurva standar yang dihasilkan pada sampel pempek spike (Gambar 8) memiliki persamaan :
CT : Nilai CT
C : Nilai log konsentrasi bakteri pada SPS
Nilai konstanta persamaan kurva standar kultur murni (37.9) lebih kecil dibanding nilai konstanta SPS (41.03). Sedangkan nilai koefisien persamaan
CT = 37.9 – 3.11 C
17
kurva standar kultur murni (3.11) sedikit lebih rendah dibanding nilai koefisien SPS (3.69). Ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi L. monocytogenes yang rendah, sampel kultur murni lebih dulu teramplifikasi dibanding SPS. Sedangkan pada konsentrasi L. monocytogenes yang semakin tinggi, SPS justru lebih cepat teramplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa matriks pangan pempek mempengaruhi hasil amplifikasi di rt-PCR. Menurut Dadkhah et al. (2012) dan Camma et al. (2012), adanya komponen lain dari pangan dapat menjadi sebab terjadinya perbedaan hasil amplifikasi, baik yang disebabkan karena pengaruh saat ekstraksi maupun pengaruh saat proses amplifikasi rt-PCR.
Gambar 7. Kurva standar hubungan log konsentrasi kultur murni
L. monocytogenes dan nilai CT
Gambar 8. Kurva standar hubungan log konsentrasi
L. monocytogenes padasampel pangan spike dan nilai CT
Hasil penentuan kurva standar (Gambar 7 dan Gambar 8) memiliki nilai korelasi yang baik yaitu untuk kultur murni sebesar -0.990 dan untuk sampel pempek spike sebesar -0.997. Hasil nilai korelasi mendekati ± 1.0 menunjukkan hubungan yang sangat kuat antara konsentrasi L. monocytogenes terhadap nilai CT yang dihasilkan (Taylor 1990). Nilai korelasi yang negatif menunjukkan bahwa semakin besar nilai pada sumbu x (konsentrasi L. monocytogenes) maka semakin kecil nilai pada sumbu y (nilai CT).
Persamaan kurva standar yang telah dihasilkan dapat digunakan untuk kuantifikasi sampel yang belum diketahui konsentrasi L. monocytogenes-nya. Selain itu, penentuan limit deteksi dari sampel kultur murni dan sampel pempek
spike juga dapat ditentukan dengan persamaan kurva standar yang telah didapat. Jika dihubungkan dengan hasil tahap konfirmasi spesifisitas bahwa metode ini spesifik hanya sampai siklus 27, maka limit deteksi didapat dengan memasukkan nilai 27 ke persamaan kurva standar sebagai nilai CT.Sehingga, limit deteksinya
18
didapat dari nilai C dari persamaan kurva standar tersebut. Hasil limit deteksi pada sampel kultur murni dan sampel pempek spike masing-masing adalah 3.2 x 103 CFU/mL dan 6.3 x 103 CFU/g. Hasil limit deteksi ini mendekati hasil dari metode yang digunakan oleh Dadkhah et al. (2012) yang memiliki limit deteksi pada sampel kultur murni sebesar 1.2 x 103 CFU/mL dan limit deteksi pada sampel susu sebesar 2.1 x 103 CFU/mL.
Hasil penentuan limit deteksi untuk kultur murni dan sampel pempek spike
memiliki kepekaan 3 kali lebih rendah dibanding hasil penelitian Dadkhah et al.
(2012). Salah satu penyebabnya yaitu nilai kemurnian DNA hasil ekstraksi yang tidak baik (Siebert 1999). Selain itu, perbedaan kehomogenan sampel pempek
spike yang lebih rendah dibanding sampel susu spike pada penelitian Dadkhah et al. (2012) merupakan penyebab menurunnya sensitivitas deteksi penelitian ini.
Aplikasi penerapan deteksi sampel dengan rt-PCR antara kultur murni dan sampel pempek spike akan berbeda ketika nilai CT berada di atas 27, sedangkan
jika nilai CT di bawah angka 27 dapat dinyatakan bahwa sampel positif terdapat
L. monocytogenes (Tabel 6). Sampel kultur murni yang memiliki nilai CT di atas 27 dapat dinyatakan negatif L. monocytogenes berdasarkan hasil konfirmasi spesifisitas sebelumnya, sedangkan untuk sampel pempek spike yang memiliki nilai CT di atas 27 masih perlu adanya uji rt-PCR lanjut dengan perlakuan
enrichment sampel. Enrichment sampel pempek spike tersebut dimaksudkan untuk meningkatkan jumlah konsentrasi awal L. monocytogenes sehingga memungkinkan pengujian kualitatif dengan rt-PCR pada sampel spike tersebut. Tabel 6. Hubungan nilai CT terhadap sampel yang diuji
Nilai CT Kultur murni Sampel pempek spike
Status Status Langkah lanjut
≤ 27 Positif L. monocytogenes Positif L. monocytogenes Tidak ada
> 27 Negatif Perlu uji lanjut Uji rt-PCR dengan
enrichment sampel
SIMPULAN
Metode ekstraksi yang disarankan untuk analisis L. monocytogenes adalah metode fenol:kloroform dengan hasil DNA genom yang lebih tinggi dibanding metode pemanasan dan metode kit komersial. Primer yang sesuai untuk analisis
L. monocytogenes yaitu primer DG69/DG74 dengan hasil kespesifikan lebih baik dibanding primer LMS 2/LIMRE. Kondisi running yang dipakai mendeteksi DNA L. monocytogenes menghasilkan kurva amplikasi yang baik sampai siklus ke-27. Deteksi DNA kultur murni L. monocytogenes menghasilkan kurva standar CT = 37.9 – 3.11 C dengan sensitivitas 3.2 x 103 CFU/mL, sedangkan pada SPS
menghasilkan kurva standar CT = 41.03 – 3.69 C dengan sensitivitas 6.3 x 103 CFU/g.
19
SARAN
Pengembangan metode ekstraksi perlu dilakukan untuk mendapatkan metode ekstraksi yang memiliki kemurnian dan kualitas DNA yang lebih baik. Hasil pengembangan metode menunjukkan adanya perbedaan kurva standar antara kultur murni dan sampel pangan, sehingga perlu ditentukan kurva standar baru untuk penelitian tentang deteksi L. monocytogenes pada sampel pangan yang berbeda. Selain itu, pengembangan rt-PCR juga perlu dilakukan untuk deteksi
L. monocytogenes pada jajanan pempek dengan metode lain seperti TaqMan®.
DAFTAR PUSTAKA
Acciari VA, Torresi M, Migliorati G, Giannatale ED, Semprini P, Prencipe P. 2011. Characterization of L. monocytogenes strains isolated from soft and semi-soft cheese sampled in a region of Italy. Veterinaria Italiana. 47(1): 15-23 Altshuler ML. 2006. PCR Troubleshooting: The Essential Guide. Caister
Academic Press. Moscow
Applied Biosystems (AB). 2015. Essentials of Real Time PCR. US
Aurora R, Prakash A, Prakash S, Rawool DB, Barbuddhe SB. 2008. Comparison of PI-PLC based assay and PCR along with in vivo pathogenicity test for rapid detection of pathogenic L. monocytogenes. Food Control. 19: 641-647
Bettelheim FA, Brown WH, Campbell MK, Farrell SO, Torres OJ. 2013.
Introduction to General, Organic, and Biochemistry. Brooks/Cole. Australia Brisson M, Tan L, Park R, Hamby K. 2000. Identification of nonspecific products
using melt-curve analysis on the iCycler iQ™ detection system. Bio-Rad Laboratories, Inc
Camma C, Domenico MD, Monaco F. 2012 Development and validation of fast real-time PCR assays for species identification in raw and cooked meat mixtures. Food Control. 23: 400-404
Campos CA, Castro MP, Gliemmo MF, Schelegueda LI. 2011. Use of natural antimicrobials for the control of Listeria monocytogenes in foods. Formatex. 1111-1123
Coral D - P, Rosales-Rivera A, Rodriguez-Garcia ME. 2009. Determination of the gelatinization temperature of starch presented in maize flours. Journal of Physics. 167: 1-5
Choi WS, and Hong CH. 2003. Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in milk using competitive PCR. Int. J. Food Microbiol. 84: 79-85
Dadkhah H, Bassami MR, Hashemi S, Shahraz F, Hosseini H, Karatzas KAG, Khaksar R. 2012. Evaluation and comparison of SYBR Green I real-time PCR dan TaqMan real-time PCR methods for quantitative assay of Listeria monocytogenes in nutrient broth and milk. African Journal of Microbiology Research. 69: 1908-1917
Dharmaraj, S. 2015. RT-PCR: The Basics. http://www.lifetechnologies.com [12 Juni 2015]
Dauphin LA, Hutchins RJ, Bost LA, Bowen MD. 2009. Evaluation of automated and manual commercial DNA extraction methods for recovery of Brucella
DNA from suspensions and spiked swabs. J of Clinical Microbiology 47(12): 3920-3926.
20
Dibbern AG, Botaro BG, Viziack MP, Silva LFP, Santos MV. 2015. Evaluation of methods of DNA extraction from Staphylococcus aureus in milk for use in real-time PCR. Genet. Mol. Res. 14(1): 227-233
Dwight Z, Palais R, Wittwer CT. 2011. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27(7):1019–1020
Esco. 2009. User Manual Swift Spectrum 48 Fluorescence Quantitative PCR Detection System. Esco Healthcare Pte. Ltd.
Erali M, Wittwer CT. 2010. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50: 250-261
Fakruddin M, Rahaman M, Ahmed MM, Hoque MM. 2014. Stress tolerant virulent strains of Cronobacter sakazakii from food. Biological Research. 47(1): 63
Food and Drug Admission (FDA). 2001. Bacteriological Analytical Manual. Food and Drug Administration.
Hein I, Lehner A, Rieck P, Klein K, Brandl E, Wagner M. 2001. Comparison of different approaches to quantify Staphylococcus aureus cells by real-time quantitative pcr and application of this technique for examination of cheese. Applied and Environmental Microbiology. 67(7): 3122–3126.
Jamali H, Chai LC, Thong KL. 2013. Detection and isolation of Listeria monocytogenes in ready to eat foods with various selective culture agar. Food Control. 32: 19-24
Jenie BSL, Kusumaningrum HD, Nurjanah S. 2013. Deteksi bakteri patogen dan fermentatif dari pangan menggunakan real-time polymerase chain reaction. Prosiding Seminar Hasil-Hasil PPM IPB. 1: 292- 308
Kohler S, Bubert A, Vogel M, Goebel W. 1991. Expression of the iap gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes is controlled on the posttranscriptional level. Journal of Bacteriology. 173: 4668-4674
Kramarenko T, Roasto M, Meremae K, Kuningas M, Poltsama P, Elias T. 2013.
Lysteria monocytogenes prevalence and serotype diversity in various foods. Food Control. 30: 24-29
Kunkel D. 2013. Listeria monocytogenes - rod prokaryote (bacterium). http://www.denniskunkel.com/DK/Bacteria/20229A.html [12 November 2013] Mak P, Maszewska A, Rozalska M. 2008. The amino acid sequences and
activities of synergistic hemolysins from Staphylococcus cohnii. FEMS Microbiology Letters. 287: 230-235
Marian MN, Aminah SMS, Zuraini MI, Son R, Maimunah M, Lee YH, Wong WC. Elexson N. 2012. MPN-PCR detection and antimicrobial resistance of
Listeria monocytogenes isolated from raw and ready to eat foods in Malaysia. Food Control. 28: 309-314
Meyer C, Ahomaa MF, Sperner B, Martlbauer E. 2011. Detection of Listeria monocytogenes in pork and beef using the VIDAS LMO2 automated enzyme linked immunoassay method. Meat Science. 88: 594-596
Montgomery JL, Sanford LN, Wittwer CT. 2010. High-resolution DNA melting analysis in clinical research and diagnostics. Expert Rev Mol Diagn. 10: 219-240
Moreno Y, Contreras JS, Montes RM, Hernandez JG, Ballesteros L, Ferrus MA. 2012. Detection and enumeration of viable Listeria monocytogenes cells from
21
ready-to-eat and processed vegetable foods by culture and DVC-FISH. Food Control. 27: 374-379
Nolan T, Mueller R, Bustin S. 2007. QPCR: target preparation. In: Mackay IM (ed.). Real-time PCR in Microbiology From Diagnosis to Characterization. UK: Caister Academik Press
Nur’utami DA, Nurwitri CC, Rahayu WP, Panggabean RIL, Yuliangsih S. 2011.
Metode analisis isolasi dan identifikasi Salmonella Typhimurium pada susu dengan metode real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Ohk SH, Bhunia AK. 2013. Multiplex fiber optic biosensor for detection of
Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enteritica
from ready to eat meat samples. Food Microbiology. 33: 166-171
Pestana EA, Belak S, Diallo A, Crowther JR, Viljoen GJ. 2010. Early, Rapid, and Sensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real-Time PCR Application.