Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silica adalah polar dan sedikit asam karena adanya gugus silanol (Si-OH) Oktadesil silica (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
Solut yang polar terutama yang bersifat basa, akan memberikan puncak yang mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorpsi antara solut dengan residu silanol dan pengotor logam yang terdapat pada silika. Masalah ini dapat diatasi dengan end-capping yakni proses menutup residu silanol dengan gugus trimetilsilil dan menggunakan silika dengan kemurnian tinggi (kandungan logam < 1 ppm) (Gandjar & Rohman, 2012).
3) Pompa
Pompa yang digunakan untuk KCKT syaratnya harus inert terhadap fase gerak dimana bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam dan sebaiknya mampu memberikan tekanan 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/ menit. Untuk tujuan
16
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/ menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan (Gandjar & Rohman, 2012).
4) Injektor
Injektor berfungsi untuk memasukan sampel, ada 3 tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a) Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum : Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam
17
loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Putra, 2004).
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan melalui injektor secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom.
Injektor terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal dan eksternal. Kelebihan pengisian sampel ini akan dikeluarkan ke pembuang (Gandjar & Rohman, 2012).
5) Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a) Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm.
b) Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. (Putra,2004)
Panjang kolom bervariasi dari 15-150 cm. Pengisi kolom biasanya adalah silica gel, alumina, dan elit. Pengisi kolom seperti partikel pellicular, yaitu butiran gelas yang dilapisi dengan materi berpori (Khopkar, 2010).
18
6) Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a) Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
b) Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
c) Stabil dalam pengoperasiannya.
d) Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
e) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu : a) Detektor Universal
Detektor yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa.
19
b) Detektor Spesifik
Detektor yang spesifik hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor fluorescensi, dan elektrokimia (Gandjar & Rohman, 2012).
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Karena variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang luas (Putra, 2004).
2.4.3 Pemakaian Kromatografi
1) Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawanya tertentu dalam cuplikan.
2) Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen campuran.
3) Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadan murni (Gritter dkk, 1991)
2.4.4 Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi
Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati.Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi (Gandjar & Rohman, 2012).
20
2.5 Analisis Kualitatif dan Kuantitatif 1) Analisis Kualitatif