HASIL DAN PEMBAHASAN A.HASIL PENELITIAN
3. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax dengan Imunokimia Protein Bcl-2 dan protein Bax merupakan protein yang berperan dalam
mekanisme terjadinya apaptosis. Sel yang mengalami apoptosis memiliki beberapa karakteristik antara lain terjadi peningkatan ekspresi protein proapoptosis diantaranya Bax, dan penekanan ekspresi protein antiapoptosis, diantarnya Bcl-2.
45
a. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax pada sel HeLa
Hasil uji pengamatan ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa (Gambar 21) menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dapat menurunkan ekspresi Bcl-2 yang terlihat dari menurunnya sel yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa ini, baik pada pemakaian tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin.
Gambar 21. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) .
Hasil uji pengamatan ekspresi Bax (Gambar 22) pada sel HeLa menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dapat meningkatkan ekspresi Bax yang terlihat dari meningkatnya sel yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa ini, baik pada pemakaian tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin.
c
a b
e d
46
Gambar 22. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel HeLa. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah penuh , negatif panah putus-putus --->
b. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax pada sel T47D
Hasil uji ICC ekspresi Bcl-2 pada sel T47D (Gambar 23) menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya dapat menurunkan ekspresi Bcl-2. Hal ini nampak dari menurunnya jumlah sel yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa-senyawa tersebut. Pemakaian kombinasi lebih menurunkan ekspresi Bcl-2 dibandingkan dengan pemakaian tunggal.
Perlakuan dengan senyawa baik tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin ini juga mampu meningkatkan ekspresi Bax pada sel T47D (Gambar 24). Pemakaian kombinasi 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan Doksorubisin lebih meningkatkan ekspresi Bax dibandingkan dengan pemakaiannya secara tunggal.
e d
c
b a
47
Gambar 23. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel T47D. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) .
B. PEMBAHASAN
Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (BHM) merupakan senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus bromo pada cincin nomor 4’; gugus hidroksil pada cincin nomor 4 atau posisi para; gugus metoksi pada cincin nomor 3 (meta); serta memiliki gugus karbonil dengan ikatan tidak jenuh Senyawa dengan rumus molekul C16H13O3Br ini memiliki titik lebur 103-106oC (Arty dkk., 2012). Senyawa dasar kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) telah banyak diteliti aktivitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal et al., 2008). Penelitian tentang sifat sitotoksik dari senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on secara in vitro masih terbatas pada kultur sel kanker HeLa. Hasil uji sitotoksik pada sel HeLa menunjukkan senyawa ini bersifat toksis dengan nilai IC50 sebesar 9,6 g/mL Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on juga memiliki sifat antioksidan yang sangat kuat, yaitu 10,14 g/mL. Bila ditinjau dari
a b
48
struktur senyawanya, aktivitas antioksidan dan antikanker ini kemungkinan besar berasal dari adanya kontribusi gugus hidroksil dan bromide yang bersifat elektronegatif. (Arty dkk, 2012).
Gambar 24. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel T47D. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) .
Hasil penelitian ini menunjukkan senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker leher rahim HeLa dan sel payudara T47D. Perlakuan senyawa ini memberikan efek sitotoksik cukup tinggi yaitu IC50 = 50 M ( 16,65 g/mL) pada sel HeLa dan IC50 = 45 M (14,98 g/mL pada sel T47D. Ueda (2002) menyatakan bahwa senyawa dapat dinyatakan poten jika memiliki nilai IC50 kurang dari 100 g/mL. Dengan demikian penelitian ini menunjukkan bahwa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan senyawa yang poten sebagai antikanker.
a
e c
b
49
Adanya gugus OH pada posisi para dari senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on diperkirakan memberikan kontribusi pada sifat toksisitas senyawa terhadap sel HeLa dan T47D. Pada beberapa hasil penelitian tentang aktivitas senyawa derivat kalkon, adanya substitusi gugus metoksi pada cincin A dan substitusi fluoro, kloro, bromo dan cincin B mampu meningkatkan penghambatan aktivitas NF-B, suatu faktor transkripsi yang berperan dalam pengembangan dan progresi kanker (Folmer, et.al., 2006, dan Kim, et. al., 2007). Selain itu adanya gugus karbonil tak jenuh -unsaturated carbonylyang terdapat pada kalkon juga memberikan kontribusi pada aktivitas sitotoksik pada sel HeLa dan T47D. Menurut Srinivasan, et al, (2009) adanya ikatan tak jenuh yang bersifat sangat elektrofilik dapat menimbulkan radikal thiyl yang mengarah ke pengurangan alkena melalui adisi Michaelis kovalen dari nukleofil, seperti SH dari cystin dari DNA, yang mengikat NF-B.
Perlakuan senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on juga menunjukkan perubahan morfologi sel yang signifikan seiring meningkatnya konsentrasi senyawa yang diberikan. Perubahan morfologi sel tersebut menyebabkan menurunnya viabilitas sel HeLa dan T47D.
Hasil uji doubling time menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on bersifat antiproliferasi, baik pada sel HeLa maupun sel T47D. Perlakuan senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 12,5 M pada sel HeLa mampu menghambat laju pertumbuhan sel tersebut, namun sel masih dapat berkembang hingga 72 jam. Perlakuan di atas konsentrasi tersebut, yaitu 25, 50 dan 75 M menyebabkan sel tidak dapat berkembang. Pada sel T47D, perlakuan senyawa dengan konsentrasi 11,25 dan 22,5 M menghambat laju pertumbuhan sel, dimana sel masih dapat berkembang hingga jam ke 48, kemudian mengalami penurunan jumlah sel dan akhirnya mati. Pada konsentrasi senyawa 45 dan 67,5 M menyebabkan sel tidak dapat berkembang.
Bila dibandingkan dengan nilai IC50 doksorubisin, senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on memiliki aktivitas lebih rendah. Doksorubisin merupakan agen kemoterapi yang banyak digunakan dalam
50
terapi berbagai kanker epitel. Doksorubisin dapat berinterkelasi dengan DNA sehingga fungsi DNA sebagai template dan pertukaran sister chromatid terganggu pada pita DNA terputus. Obat ini juga dapat bereaksi dengan sitokrom P450 reduktase dengan adanya NADPH membentuk zat perantara yang akan bereaksi dengan oksigen menghasilkan radikal bebas yang dapat menghancurkan sel. Pada penelitian ini diperoleh nilai IC50 doksorubisin terhadap sel HeLa sebesar 6 M dan 185 nM pada sel T47D.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan doksorubisin mampu meningkatkan aktivitas sitotoksik baik pada sel HeLa maupun sel T47D, dibandingkan dengan perlakuan tunggal. Perlakuan kombinasi pada sel HeLa dibawah konsentrasi IC50 menghasilkan efek dari sinergi (saling menguatkan) hingga sinergi kuat. Viabilitas sel terendah terjadi pada kombinasi senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 25 M dan dokso-rubisin 3 M. Pada sel T47D perlakuan kombinasi dibawah konsentrasi IC50 menghasilkan efek mendekati aditif pada konsentrasi terendah, dan efek sinergi pada konsentrasi yang lebih tinggi. Viabilitas sel terendah pada sel T47D terjadi pada kombinasi senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on konsentrasi 22,5 M dan doksorubisin 92,65 nM. Hasil ini membuktikan bahwa senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi doksorubisin.
Hasil pengamatan apoptosis menggunakan flowcytometer menunjukkan bahwa perlakuan senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 12,5 M (1/4 IC50) dengan waktu inkubasi 24 jam menyebabkan 11,07% sel HeLa mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dibandingkan dengan sel HeLa tanpa perlakuan (3,4%). Pada perlakuan senyawa dengan konsentrasi lebih tinggi, yaitu 25 M (1/2IC50) dan 50 M (IC50) menyebabkan lebih banyak sel yang mengalami apoptosis, yaitu berturut-turut sebesar 39,81% dan 72,42%. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu menginduksi terjadinya apoptosis pada sel HeLa. Perlakuan kombinasi 12, 5 M senyawa ini
51
dengan 1,5 M doksorubisn menyebabkan 23,34% sel HeLa mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dari perlakuan tunggal senyawa (11,07%), namun lebih rendah dari perlakuan tunggal doksorubisin (31,13%). Perlakuan kombinasi mengarahkan sel HeLa ke arah nekrosis. Hal ini dapat dipahami karena penelitian ini dilakukan secara invitro, sehingga sangat dimungkinkan sel yang mengalami apoptosis selanjutnya akan mengalami nekrosis, karena tidak ada mekanisme keterlibatan makrofag.
Demikian juga pada sel T47D, perlakuan senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25 M (1/4 IC50) dengan waktu inkubasi 24 jam menyebabkan 6,17% sel T47D mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dibandingkan dengan sel T47D tanpa perlakuan (2,18%). Pada perlakuan senyawa dengan konsentrasi lebih tinggi, yaitu 22,5 M (1/2IC50) dan 45 M (IC50) menyebabkan lebih banyak sel yang mengalami apoptosis, yaitu berturut-turut sebesar 11,44% dan 67,93%. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu menginduksi terjadinya apoptosis pada sel T47D. Perlakuan kombinasi senyawa ini pada konsentrasi 11,25 M dan doksorubisn 46,25 nM menyebabkan 11,4% sel T47D mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dari perlakuan tunggal senyawa (6,17%), dan perlakuan tunggal doksorubisin (7,17%). Data ini menunjukkan bahwa kombinasi senyawa ini dengan doksorubisin meningkatkan kemampuan doksorubisin dalam memacu terjadinya apoptosis. Kemampuan senyawa ini dalam memacu apoptosis menyebabkan viabilitas sel HeLa dan T47D menurun. Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Hsu et al., (2006) yang menunjukkan bahwa struktur inti dari kalkon mampu menghambat proliferasi sel pada sel kanker payudara dengan menginduksi apoptosis.
Hasil pengamatan ekspresi protein Bcl-2 baik pada sel HeLa maupun sel T47D menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on baik tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin mampu menurunkan level ekspresi Bcl-2. Dalam kaitannya dengan proses apoptosis, hal ini menunjukkan bahwa senyawa ini mampu memacu terjadinya apoptosis dengan menurunkan ekspresi Bcl-2.
52
Senyawa ini, baik pemakaian tunggal maupun kombinasi dengan doksorubisin juga mampu meningkatkan level ekspresi Bax pada sel HeLa dan T47D. Bcl-2 dan Bax merupakan Bcl-2-family, yaitu gen yang sangat berperan dalam jalur pengaturan apoptosis. Protein-protein yang termasuk Bcl-2 family pada umumnya mengatur apoptosis melalui regulasi permeabilitas membrane luar mitokondria. Penelitian Shen et al, 2007 menunjukkan bahwa kalkon dapat menghambat proliferasi sel dengan menginduksi apoptosis pada sel kanker kandung kemih manusia, yaitu sel T24 dan HT-1376. Pada kedua sel ini kalkon secara signifikan meningkatkan ekspresi protein p21 dan p27, serta menurunkan level cyclin B1, cyclin A, dan Cdc2, sehingga menyebabkan cell cycle arrest. Selain itu kalkon meningkatkan ekspresi Bax dan Bak, tetapi menurunkan level Bcl-2 dan Bcl-XL, sehingga memacu apoptosis melalui jalur mitokondria dengan melepaskan sitokrom dan mengaktivasi caspase-9 dan caspase-3. Induksi jalur mitokondria dan penghambatan aktivasi NF-B berperan penting dalam mempengaruhi aktivitas antiproliferasi kalkon pada sel T24 dan HT-1376.
Pada penelitin ini, senyawa 1-(4’ -bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan kalkon dengan substitusi gugus hidroksil, metoksi, dan Bromo ternyata juga mampu menghambat proliferasi sel dan memacu apoptosis. Adanya kemampuan senyawa ini dalam menurunkan level ekspresi Bcl-2 dan meningkatkan level ekspresi Bax, menunjukkan bahwa senyawa ini mampu memacu apoptosis dengan induksi jalur mitokondria.
53 BAB 6