Bidang Teknik Invensi :
Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa
1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on tunggal dan kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel kanker payudara.
Latar Belakang Invensi
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker penyebab kematian di dunia setelah kanker paru-paru, perut, hepar, dan kolon dengan insidensi sebesar 502.000 kasus (WHO, 2006). Di Indonesia, pravalensi kanker payudara menduduki peringkat ke-2 setelah kanker leher rahim dan merupakan penyebab kematian utama pada wanita. Dari semua kasus kanker pada wanita Indonesia, pada tahun 1991 kasus kanker payudara mencapai 17,77% (Tjindarbumi and Mangunkusumo, 2002).
Beberapa metode untuk pengobatan kanker telah dilakukan, diantaranya pembedahan, kemoterapi dan
penyinaran (radiasi). Namun, masing-masing metode
mempunyai kelemahan, sehingga tingkat keberhasilannya masih rendah (King, 2000). Kegagalan yang sering terjadi pada pengobatan melalui kemoterapi disebabkan karena rendahnya selektivitas obat anti kanker dan adanya fenomena resistensi sel kanker terhadap agen
kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Oleh
karena itu, pengembangan dan penemuan pengobatan
kanker,khususnya kanker payudara perlu terus
75
Diantara agen kemoterapi kanker yang telah menimbulkan resistensi adalah doksorubisin. Senyawa golongan antrasiklin ini diberikan pada berbagai jenis kanker. Selain menimbulkan resistensi, doksorubisin dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan jangka panjang (Ferreira et al., 2008). Salah satu alternatif untuk mengatasi resistensi adalah kombinasi agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sehingga dapat meningkatkan keberhasilan terapi.
Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) adalah jenis keton
dengan ikatan tidak jenuh yang telah banyak di
teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya sebagai
obat antitumor. Oleh karena aktivitasnya sebagai ”high
therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new era of medicines” dalam kapasitasnya sebagai antitumor,
antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal et al.,
2008). Disebutkan pula bahwa sebagian besar target utama dari senyawa-senyawa kalkon adalah mempengaruhi
daur sel (Boumendjel et al., 2009). Shen et al, 2007
telah membuktikan bahwa struktur dasar kalkon
(1,3-difenilpropen-1-on) mampu menghambat aktivasi nuclear
factor kappa (NF-B). Penghambatan aktivasi NF-B
tersebut menyebabkan adanya induksi apoptosis,
penghambatan siklus sel, dan menurunkan ekspresi Bcl-XL
sebagai downstream target dari NF-B pada kultur sel
kanker kandung kemih T24 dan HT-1376, serta sel
payudara MCF-7 dan MDA-MB-231 (Hsu et al., 2006).
Beberapa senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus
hidroksi pada posisi para seperti broussochalcone A;
xanthoangelol D; butein; isoliquiritigenin;
licochalcone A; isoliquiritigenin 2’-metil eter, dan
76 et al., 2011).
Penelusuran terhadap beberapa paten menunjukkan bahwa beberapa derivat kalkon telah digunakan dalam pengobatan kanker, seperti pada United States Patent US
6,498,195 B2 “Use of 1
-Propanone-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-hydroxyphenyl as
anticarcinogenic agent”, United States Patent US 7,872,029 B2 “Chalcone and its analogs as agent for the inhibition of angiogenesis and related disease states”.
Arty et al., (2013), telah mensintesis senyawa
derivat kalkon bersubtituen bromo, yaitu 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (Gambar 1). Senyawa ini terbukti memiliki aktivitas
antioksidan yang tinggi dan berpotensi sebagai
antikanker pada sel kanker leher rahim.
Invensi ini menggunakan senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on baik tunggal maupun kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel kanker payudara T47D. Pengujian sebagai antikanker dilakukan dengan uji sitotoksik menggunakan MTT
{3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium
bromida}. Perhitungan sitotoksisitas kombinasi
digunakan Combination Index (CI) (Reynols and
Maurer,2005).
Ringkasan Invensi
Penggunaan senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai
antikanker baik secara tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin ini dilakukan untuk menghasilkan dosis yang efektif dalam mematikan sel kanker payudara.
77
Penggunaan senyawa ini dalam treatment meliputi tahapan
berikut:
a. Preparasi senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan
doksorubisin (produk Kalbe Farma) untuk uji aktivitas sitotoksik dimana senyawa tersebut dilarutkan dalam DMSO (Dimetilsulfoksida).
b. Pengujian aktivitas sitotoksik senyawa baik
tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel T47D (ATCC) menggunakan metode MTT
dan perhitungan kombinasi dosis efektif
menggunakan Combination Index (CI) (Reynols and
Maurer,2005).
Uraian Singkat Gambar
Gambar 1 memperlihatkan struktur senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
atau 3-(4’-hidroksi-3’
-metoksifenil)-1-fenil-2-propen-1-on).
Gambar 2 memperlihatkan hubungan konsentrasi senyawa
1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan % viabilitas sel T47D
Gambar 3 memperlihatkan hubungan konsentrasi doksorubisin dengan % viabilitas sel T47D
Uraian Lengkap Invensi
a.Preparasi senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dilarutkan dalam pelarut
DMSO hingga konsentrasi 100.000 mikromolar sebagai larutan induk. Selanjutnya dibuat variasi konsentrasi
78
5; 10; 20; 40; 60; dan 80 mikromolar dengan menggunakan media kultur (MK). Media kultur yang digunakan dibuat dari: (1) Penisilin-streptomisin (Penstrep) 2%. (2) Fetal Bovine Serum (FBS) 10%, dan (3) Fungizon 0,5%
dilarutkan hingga 100 ml dengan medium Rosewell Park
Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL) yang dibuat
dengan melarutkan 10,4 g RPMI ditambah NaHCO3 2,2 g;
Hepes 2 g dilarutkan dengan akuabides steril dan
dikondisikan pada pH 7,2 – 7,4, ditambahkan akuades
hingga volume akhir 1 liter. Selanjutnya disterilisasi dengan filter 0,2 mikron.
Senyawa doksorubisin dilarutkan dengan media kultur yang sama dengan variasi konsentrasi 50; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 225 dan 250 nanomolar. Variasi
konsentrasi senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan untuk
kombinasi sebesar : 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar.
b.Uji aktivitas sebagai antikanker pada sel kanker
payudara
Sel dengan konsentrasi 1 x 104 sel/sumuran
didistribusikan ke dalam plate 96 sumuran dan
diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di sumuran. Keesokannya media diambil kemudian
ditambahkan 100 μl media kultur yang
mengandung DMSO 0,1% (kontrol) atau sampel, inkubasi selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 mikroliter PBS (Phospate Buffer Saline). Kemudian ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 mikroliter media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam
79
pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, kemudian ditambahkan larutan SDS untuk melarutkan kristal
formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit
kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang
gelombang 595 nm.
Data yang diperoleh pembacaan ELISA reader berupa
absorbansi masing-masing sumuran dikonversi ke dalam persen viabilitas sel. Persentase viabilitas sel dihitung menggunakan rumus:
Absorbansi sel dengan perlakuan-absorbansi kontrol media X 100%
Absorbansi kontrol sel – absorbansi kontrol media
Data yang berupa viabilitas sel kemudian dianalisis dengan membuat grafik log konsentrasi versus viabilitas
sel. Nilai IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan
penghambatan pertumbuhan 50% dari populasi sel sehingga
dapat diketahui potensi sitotoksisitasnya (Doyle and
Griffiths, 2000).
Sitotoksik kombinasi ditetapkan dengan menghitung indeks interaksi antara doksorubisin dengan senyawa
1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on menggunakan persamaan :
Combination Index/CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2
D1 dan D2 adalah konsentrasi sampel yang digunakan dalam perlakuan kombinasi. (Dx)1 dan (Dx)2 adalah konsentrasi tunggal yang dapat menghasilkan efek
sebesar yang ditimbulkan perlakuan kombinasi (Reynols and Maurer,2005). Angka CI yang diperoleh
diinterpretasikan sebagaimana Tabel 1.
Potensi ketoksikan senyawa 1-(4’
80
T47D disajikan pada Gambar 3, yaitu memiliki nilai IC50 sebesar 45 mikromolar yang berarti sangat aktif. Sedangkan potensi ketoksikan doksorubisin disajikan
pada Gambar 4, memiliki nilai IC50 sebesar 185
nanomolar.
Tabel 1. Interpretasi Nilai Indeks Kombinasi (CI)
Nilai CI Interpretasi
< 0,1 sinergi sangat kuat
0,1 - 0,3 sinergis kuat 0,3 - 0,7 sinergis 0,7 - 0,9 sinergis ringan-sedang 0,9 - 1,1 mendekati aditif 1,1 - 1,45 antagonis ringan-sedang 1,45 - 3,3 antagonis
> 3,3 antagonis kuat-sangat kuat
(Reynols and Maurer,2005)
Uji sitotoksik kombinasi doksorubisin dan
senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel T47D pada
konsentrasi senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 2,8125; 5,625;
11,25; dan 22,5 mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar. Kombinasi kedua senyawa ini mampu menurunkan viabilitas sel lebih rendah daripada penggunaan senyawa
1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on maupun doksorubisin secara tunggal
81
Tabel 2. Persen viabilitas sel perlakuan kombinasi
senyawa 1-4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin
pada berbagai variasi konsentrasi.
Viabilitas sel (%) pada variasi konsentrasi: 1-4’ - bromofenil)-3- (4-hidroksi-3- metoksifenil)-2-propen-1-on (M) Doksorubisin (nM) 0 11,5625 23,125 46,25 92,65 0 100 99,34 96,01 70,67 49,12 2,8125 96,62 98,38 87,18 67,95 33,87 5,625 93,34 84,25 85,31 63,15 28,37 11,25 81,07 71,33 61,33 36,65 5,50 22,5 49,67 46,74 26,35 9,39 5,15
Berdasarkan perhitungan nilai CI (Tabel 3),
terlihat bahwa pada kombinasi senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan konsentrasi sebesar 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 mikromolar, dan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar memberikan
interprestasi antara mendekati aditif (0,9 – 1,1) pada
konsentrasi kombinasi rendah dan sinergi (0,3-0,7).
Dari hasil ini membuktikan bahwa senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi doksorubisin pada pengobatan kanker payudara. Kombinasi yang efektif dalam mematikan sel T47D adalah pada
penggunaan senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25 mikromolar
82
Tabel 3. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan
kombinasi senyawa 1-(4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksi-fenil)-2-propen-1-on dan
doksorubisin pada berbagai variasi
konsentrasi.
Nilai CI pada perlakuan kombinasi:
1-4’ -bromofenil)-3- (4-hidroksi-3- metoksifenil)-2-propen-1-on (M) Doksorubisin (nanomolar) 11,5625 23,125 46,25 92,65 2,8125 1,0 1,0 0,5 0,4 5,625 0,7 1,0 0,5 0,4 11,25 0,6 0,5 0,4 0,4 22,5 0,5 0,4 0,4 0,5
83
Klaim
1. Penggunaan senyawa 1-4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai antikanker
pada sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar 45 mikromolar.
2. Penggunaan kombinasi senyawa 1-4’
-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar
11,25 mikromolar dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar sebagai antikanker pada sel payudara.
84
Abstrak
PENGGUNAAN KOMBINASI DERIVAT KALKON BERSUBSTSITUEN