BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.4 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif di empat lokasi yaitu, Pasar Tavip (PG1 danPM1), Pasar Pagi (PG2 dan PM2), Pasar Lincun (PG3 dan PM2),
dan Pasar Modern (PG4 dan PM4). (Untuk ikan gurami diberi kode PG dan ikan mas diberi kode PM).
3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1 Penyiapan Bahan 3.5.1.1 Pembuatan Pelarut
Pelarut terdiri dari campuran metanol HPLC grade dan air dengan
perbandingan 55 : 45 (perbandingan fase gerak hasil optimasi). 3.5.1.2 Pembuatan Fase Gerak Metanol - Air
Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan penyaring PTFE 0,5 µm dan diawaudarakan selama 30 menit.
Air 500 ml disaring dengan menggunakan penyaring nitrat selulosa 0,45 µ m dan diawaudarakan selama 30 menit.
3.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Sejumlah 50 mg bahan baku kloramfenikol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan 5 ml metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan air dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 µg/ml, larutan induk baku I (LIB I). Dipipet sebanyak 1,5 ml LIB I, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan sampai garis tanda dengan air dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 15 µg/ml. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200 - 400 nm.
3.5.3 Prosedur Analisis
Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-VIS pada panjang gelombang analisis yang diperoleh. Pompa menggunakan mode aliran tetap dengan sistem elusi isokratik.
Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.
3.5.3.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kloramfenikol
Sejumlah 50 mg Baku Pembanding kloramfenikol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu tentukur 250 ml, dilarutkan dengan 5 ml metanol kemudian dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 µg/ml, Larutan Induk Baku (LIB I).
3.5.3.3 Penentuan Perbandingan Komposisi Fase Gerak yang Optimum untuk Analisa
Larutan Induk Baku kloramfenikol dipipet5 ml dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda dan dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 10 µg/ml, disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µm, diawaudarakan selama 10 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µ l, menggunakan fase gerak metanol - air, dengan
perbandingan (40 : 60), (50 : 50), (55 : 45), (60 : 40), (65 : 35), (70 : 30), dan (75 : 25), dengan laju alir 1 ml/menit, dan dideteksi pada panjang gelombang 278 nm. 3.5.3.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku
Larutan Induk Baku (LIB I) dipipet sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok
hingga homogen sehingga diperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 10 µg/ml, Larutan Induk Baku II (LIB II). Larutan Induk Baku II dipipet 0,3 ; 0,7 ; 1 ; 3 ; 5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh konsentrasi 0,03 ; 0,07 ; 0,1 ; 0,3 ; 0,5 µg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µ l dideteksi pada panjang gelombang maksimum
yang dipilih 278 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya. 3.5.3.5 Preparasi Sampel
Ikan gurami dan ikan mas dengan berat 500 g, dicuci bersih, sisiknya dibersihkan, dipisahkan seluruh bagian daging dari tulangnya, dikumpulkan seluruh dagingnya, dihaluskan dengan blender, diaduk agar homogen, ditimbang kurang lebih sebanyak 5 g.
3.5.3.6 Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel
Sampel yang telah homogen dan ditimbang sebanyak 5 g, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus bertutup, ditambahkan 10 ml asetonitril dikocok dengan vortex selama 30 detik, dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10
menit. Supernatan dipisahkan dari endapan. Kemudian ditambahkan Asetonitril 10 ml ke dalam endapan, dikocok dengan vortex selama 30 detik, dan disentrifus
dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan dan digabungkan dengan supernatan pertama. Gabungan supernatan ditambahkan 1,5 g NaCl, dikocok dengan vortex selama 1 menit, dan disentrifus dengan
Supernatan ditambahkan 5 ml n-heksana, dikocok dengan vortex selama 30 detik,
dan didiamkan sampai terpisah sempurna hingga terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan n-heksan di bagian atas dan lapisan asetonitril di bagian bawah. Lapisan n-heksan dibuang dengan menggunakan pipet secara hati-hati. Perlakuan n-heksan diulangi sekali lagi. Lapisan asetonitril dikeringkan dengan alat penguap. Ekstrak dilarutkan hingga 5 ml dengan pelarut kemudian disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µ m, dan diawaudarakan selama 10 menit, kemudian diinjeksikan sebanyak 10 µ l ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler dan dideteksi
pada panjang gelombang maksimum yang dipilih 278 nm dengan perbandingan fase gerak metanol : air (55:45) dan laju alir 1 ml/menit. Dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan untuk setiap sampel. Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi : Y = aX + b. Bagan penetapan kadar residu kloramfenikol dalam sampel dapat dilihat pada gambar 1.
Berdasarkan metode SNI 7541.1:09, bagan penetapan kadar residu kloramfenikol dalam ikan adalah sebagai berikut:
5 gram ikan yang telah dihomogenkan
ditambah 10 ml asetonitril
disentrifus 10 menit
dikocok 30 detik dengan vortex
supernatan I endapan
ditambah 10 ml asetonitril dikocok 30 detik dengan vortex
disentrifus 10 menit
supernatan II endapan
kumpulan supernatan I dan II
ditambah 1,5 g NaCl
dikocok 60 detik dengan vortex
disentrifus 5 menit
endapan supernatan
ditambah 5 ml n-heksan dikocok 30 detik dengan vortex dua lapisan
(Lanjutan)
Gambar 5. Bagan Prosedur Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel.
3.5.3.7 Analisis Data Secara Statistik
Menurut Usman dan Purnomo (2006) data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t.
Rumus yang digunakan untuk menghitung simpangan baku adalah:
1 ) ( 2 − − =
∑
n X X SDSedangkan untuk mendapatkan thitung digunakan rumus:
t hitung n SD X X / − = Dua lapisan lapisan atas (n-heksan) lapisan bawah (asetonitril)
diuapkan hingga hampir kering dilarutkan dengan fase gerak sampai 5ml
larutan uji
Diulangi perlakuan n-heksan dengan cara yang sama
Hasil
dianalisis secara KCKT dengan fase gerak metanol – air (55:45), laju alir 1 ml/menit, pada panjang gelombang 278 nm.
Data diterima jika -t tabel < t hitung < t tabel pada interval kepercayaan 95% dengan derajat kebebasan dk= n-1 dan nilai α = 0,05
Keterangan :
SD = Standard deviation/simpangan baku X = Kadar dalam satu perlakuan
X = Kadar rata-rata dalam satu sampel n = Jumlah perlakuan
Untuk menghitung kadar kloramfenikol dalam sampel secara statistik dapat digunakan rumus:
Kadar Kloramfenikol (μ)= X n SD x t(1−1/2α).dk ± Keterangan: μ = Kadar sebenarnya X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan
t = Harga ttabel sesuai dengan derajat kepercayaan dk= Derajad kebebasan.
3.5.4 Metode Validasi 3.5.4.1 Akurasi
Menurut Harmita (2004), Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan dengan persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.
Dalam hal ini persen perolehan kembali ditentukan dengan menggunakan metode penambahan baku (The Method of Standard Additives) yakni kadar kloramfenikol
dalam sampel ikan ditentukan terlebih dahulu, selanjutnya dilakukan penentuan kadar kloramfenikol dalam sampel setelah penambahan larutan standar 50%,
100% dan 150%. Masing-masing dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
% Perolehan Kembali= x 100% Keterangan :
CF = Konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran CA = Konsentrasi sampel sebenarnya
C*A = Konsentrasi analit yang ditambahkan 3.5.4.2 Presisi
Menurut Rohman (2007), presisi merupakan ukuran keterangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik.
Standar deviasi relatif (relative standard deviation, RSD) yang juga
dikenal dengan koefisien variansi merupakan ukuran ketepatan relatif dan umumnya dinyatakan dalam persen. RSD dirumuskan dengan persamaan:
% 100 x X SD RSD= Keterangan :
RSD= Relatif Standar Deviasi SD = Standar Deviasi
X = Rata-rata
Sementara itu, SD dihitung dengan :
SD =
(
)
(
)
2 1 − −∑
n X XKeterangan :
X = Nilai dari masing-masing pengukuran
X = Rata-rata (mean) dari pengukuran N = Frekuensi penetapan
N-1 = Derajat kebebasan
3.5.4.3 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)
Menurut Harmita (2004), Batas Deteksi (Limit Of Detection /LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit Of Quantitation/LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Sl SB x LOD=3 Sl SB x LOQ=10
(Hasil perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dapat dilihat pada lampiran 4. Hal. 54