PREBIOTIK DAN BAKTERI ASAM LAKTAT SEBAGAI
PROBIOTIK
PENDAHULUAN
Prebiotik merupakan substansi dari makanan yang tidak dicerna, dan secara selektif meningkatkan pembiakan dan aktivitas bakteri yang menguntungkan dalam usus. Zat ini mengalami proses peragian di dalam usus besar, dalam proses tersebut dihasilkan makanan bagi bakteri yang menguntungkan (probiotik). Makanan tersebut sangat berguna bagi perkembangbiakan bakteri probiotik. Manning dan Gibson (2004) menyebutkan substrat yang berasal dari makanan atau yang diproduksi oleh inang yang tersedia untuk difermentasi oleh mikroflora kolon, yaitu melalui makanan, resistant starch,
polisakarida non pati (seperti pektin, selulosa, guar dan xylan), dan oligosakarida seperti laktosa, laktulosa, rafinosa, stakhiosa dan frukto-oligosakarida. Senyawa prebiotik yang tidak dapat dicerna oleh usus halus dan akan mencapai usus besar, selanjutnya akan didegradasi atau difermentasi oleh bakteri usus dan dapat menstimulir pertumbuhan bakteri asam laktat (BAL).
Fermentasi oligosakarida oleh bakteri usus akan menghasilkan energi metabolisme dan asam lemak rantai pendek (terutama asam asetat dan asam laktat), sehingga komposisi mikroflora usus berubah. Selain asam, bakteri usus juga akan menghasilkan zat yang bersifat antimikroba. Hampir semua zat yang diproduksi oleh bakteri bersifat asam merupakan hasil fermentasi karbohidrat oligosakarida (Tomomatsu 1994 dan Bird 1999). Adanya produksi asam tersebut akan menurunkan pH usus sehingga persentase bakteri yang menguntungkan seperti Bifidobacterium dan Lactobacillus meningkat, sedangkan persentase bakteri patogen seperti E.coli dan Streptococcus faecalis akan menurun. Pertumbuhan bakteri patogen akan terhambat dengan adanya asam dan zat-zat antibakteri. Dengan demikian oligosakarida merupakan media yang baik untuk pertumbuhan bakteri Biftdobacterium dan Lactobacillus di dalam kolon (usus besar), sehingga dapat digolongkan sebagai prebiotik (Wageha et al.
Berangkat dari fenomena ini, dapat dilakukan manajemen mikroflora usus yaitu proporsi bakteri baik (probiotik) ditingkatkan, dan bakteri patogen ditekan jumlahnya, dengan cara menyediakan nutrisi yang sesuai untuk bakteri probiotik agar dalam usus berkembang lebih pesat. Oligosakarida merupakan salah satu sumber prebiotik yang dapat dijadikan sebagai nutrisi untuk pertumbuhan bakteri probiotik. Oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia berpotensi digunakan sebagai prebiotik, namun informasi penggunaannya masih sangat terbatas. Melihat potensi tersebut menarik dilakukan kajian lebih lanjut tentang penggunaan oligosakarida ekstrak tepung buah rumbia sebagai salah satu sumber prebiotik melalui uji fermentasi dan uji pertumbuhan bakteri
Bifidobacterium dan Lactobacillus serta uji penempelan bakteri asam laktat pada lempeng stainless steel sebagai pendekatan terhadap kemampuan menempel isolat pada substrat padat (usus) sebagai kandidat probiotik.
Penelitian ini dilakukan guna mengetahui kemampuan bakteri asam laktat dalam memfermentasi oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia dan sebagai sumber prebiotik dalam menstimulir pertumbuhan bakteri probiotik, serta kemampuan bakteri probiotik membentuk biofilm secara in vitro.
MATERI DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia dan Mikrobiologi Seafast Center, Institut Pertanian Bogor. Waktu penelitian berlangsung selama 7 bulan dari bulan Februari - September 2009.
Uji Fermentasi Oligosakarida
Uji fermentasi ini bertujuan untuk mengetahui apakah gula oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia mampu difermentasi oleh bakteri asam laktat (Lactobacillus dan Bifidobacterium). Uji fermentasi oligosakarida dilakukan dengan memodifikasi media pertumbuhan bakteri asam laktat (BAL) menurut metode Kaplan dan Hutkins (2000). Pengamatan pertumbuhan bakteri asam laktat pada media dilakukan dengan membuat media pertumbuhan dasar tanpa sumber karbon (Tabel 8).
Tabel 8. Media pengujian fermentasi oligosakarida (g/100 ml) Bahan Komposisi L-sistein Bacto agar Bromcresol purple Aquadest 0,05 1,5 3 mg 100 ml
Media dasar tersebut selanjutnya diautoklaf, sedangkan gula oligosakarida yang diuji difilter steril kemudian ditambahkan dalam media agar. Masing-masing strain bakteri uji yang sebelumnya ditumbuhkan pada media MRS broth selanjutnya ditumbuhkan pada media agar yang mengandung gula oligosakarida dengan jumlah koloni berkisar antara 25-250 koloni. Cawan agar kemudian diinkubasi pada kondisi aerob untuk bakteri Lactobacillus dan kondisi anaerob untuk bakteri
Bifodobacterium selama 24 jam. Strain bakteri yang dapat memfermentasi oligosakarida yang diuji akan memproduksi asam sebagai produk akhirnya tumbuh sebagai koloni yang dikelilingi oleh zona warna kuning (> 3 mm) dengan latar belakang berwarna abu-abu. Sedangkan koloni yang tidak mampu memfermentasi oligosakarida akan menghasilkan koloni berwarna putih kecil tanpa zona berwarna kuning. Uji fermentasi oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia juga dilakukan pada bakteri patogen (E.coli dan Salmonella) guna mengetahui apakah oligosakarida tersebut dapat difermentasi oleh bakteri patogen.
Pengujian Oligosakaridaterhadap Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat
Oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia dilakukan pengujian terhadap pertumbuhan bakteri asam laktat (BAL). Jenis BAL yang digunakan adalah B. bifidum, B. animalis, L. casei Rhamnosus,dan L. bulgaricus.
Media yang digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri asam laktat adalah media cair MRS basis tetapi glukosa media diganti dengan gula oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia (Tabel 9 dan 10). Sebagai pembanding (kontrol) digunakan media MRS basis tanpa komponen gula.
Kultur masing-masing BAL ditumbuhkan pada media gula oligosakarida. Untuk menghindari kontaminasi masing-masing dibuat secara duplo pada setiap
pengamatan (0 jam, 12 jam, 24 jam, 36 jam dan 48 jam) . Inkubasi dilakukan secara
aerob untuk bakteri Lactobacillus dan secara anaerob untuk bakteri
Bifidobacterium dalam inkubator 37 oC. Untuk membuat kondisi anaerob
digunakan alat ANOXOMAT (Gambar 7). Perhitungan jumlah BAL dilakukan setelah diinkubasi selama 24 jam. Kontrol dikerjakan melalui tahapan yang sama dengan pengerjaan perlakuan media oligosakarida, tetapi pada media tidak ditambahkan gula oligosakarida.
Tabel 9. Media pengujian pertumbuhan bakteri Lactobacillus (g/100 ml) Bahan Media oligosakarida Media kontrol Peptone Yeast ekstrak Tween 80 K2HPO4 MgSO4 7H2O MnSO4 4H2O Tri-ammonium citrate L-sistein Bacto agar Oligosakarida 0,1 0,01 1 ml 0,60 0,2 0,05 2,0 0,05 1,5 2,0 0,1 0,01 1 ml 0,60 0,2 0,05 2,0 0,05 1,5 0,0
Tabel 10. Media pengujian pertumbuhan bakteri Bifidobacterium (g/100 ml) Bahan Media oligosakarida Media kontrol Trypticase Pytone Yeast ekstrak Tween 80 Cystein hydroclorid K2HPO4 MgCl4 6H2O Zn SO4 7H2O CaCl2 Bacto agar Oligosakarida 1,0 0,1 0,01 1 ml 0,025 0,60 0,05 0,25 0,15 1,5 2,0 1,0 0,1 0,01 1 ml 0,025 0,60 0,05 0,25 0,15 1,5 0,0
Pengujian Oligosakaridaterhadap Pertumbuhan Bakteri Patogen
Oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia juga dilakukan pengujian terhadap pertumbuhan bakteri patogen. Jenis bakteri patogen yang digunakan adalah enteropathogen Escherichia coli (EPEC) dan Salmonella typhimurium. Media yang digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri E.coli
adalah media cair NA basis dan bakteri Salmonellatyphimurium adalah media cair BSA basis tetapi sumber gula diganti dengan gula oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia (Tabel 11 & 12). Sebagai pembanding (kontrol) digunakan media NA dan BSA tetapi tidak ditambahkan oligosakarida.
Tabel 11. Media pengujian bakteri E. coli (g/100 ml)
Bahan Media oligosakarida Media kontrol Lab lemco powder
Yeast extract Peptone Sodium chlorida Agar Oligosakarida 0,1 0,2 0,5 0,5 1,5 1,0 0,1 0,2 0,5 0,5 1,5 0,0
Tabel 12. Media pengujian bakteri Salmonella (g/100 ml)
Bahan Media oligosakarida Media kontrol Beef extract
Peptone
Disodium phosphate Ferrous sulfate
Bismuth Sulfite indicator Brilian green Agar Oligosakarida 0,5 0,1 0,4 0,3 0,25 0,025 2,0 1,0 0,5 0,1 0,4 0,3 0,25 0,025 2,0 0,0
Kultur masing-masing bakteri patogen ditumbuhkan pada media yang mengandung gula oligosakarida dan kontrol. Untuk menghindari kontaminasi, masing-masing dibuat secara duplo pada setiap pengamatan yaitu pada 0 jam, 12 jam, 24 jam, 36 jam, dan 48 jam. Inkubasi dilakukan secara aerob dalam inkubator 37 oC. Perhitungan jumlah pertumbuhan bakteri patogen dilakukan setelah diinkubasi selama 24 jam. Kontrol dikerjakan melalui tahapan yang sama dengan pengerjaan media perlakuan, tetapi pada media tidak ditambahkan sumber gula.
1. Penyiapan Kultur Bakteri
Kultur bakteri L. casei Rhamnosus dan L. bulgaricus diawetkan dengan dimobilisasi dalam manik-manik sedangkan kultur Bifidobacterium diawetkan dengan agar semisolid. Pengawetan dalam manik-manik dengan cara sebagai berikut: kultur Lactobacillus yang telah diinokulasikan dalam MRS Broth
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Kemudian terhadap kultur segar ditambahkan gliserol steril dengan perbandingan 4:1 (kultur : gliserol) dan dikocok rata. Suspensi bakteri yang telah berisi gliserol dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi manik-manik steril sampai manik-manik tersebut terendam. Campuran tersebut kemudian dikocok dan sisa cairan dibuang. Kultur yang telah terimobilisasi disimpan pada suhu -20 oC.
Pengawetan B.bifidum dan B.animalis dilakukan dengan cara menginokulasikan 1(satu) ose kultur murni ke dalam agar semisolid yang dibuat dengan cara mencampurkan MRS Broth dengan bacto agar sebanyak 0,5%
kemudian diinkubasi selarna 24 jam pada suhu 37 oC. Untuk membuat kondisi
anaerob digunakan alat ANOXOMAT. Kultur yang telah termobilisasi disimpan pada suhu -20 oC.
2. Penyegaran Kultur Bakteri
Media yang digunakan untuk penyegaran kultur bakteri asam laktat (BAL) adalah MRS Broth. Kultur BAL disegarkan dengan menginokulasikan 1 (satu) ose kultur ke dalam 10 ml MRS Broth kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Inkubasi bakteri Lactobacillus dilakukansecara aerob, sedangkan bakteri Bifidobacterium secara anaerob. BAL yang telah disegarkan dapat langsung dipakai. Penyegaran hanya dilakukan pada saat pengujian akan dilakukan. Hal yang sama dilakukan untuk penyegaran bakteri patogen (E.coli
dan Salmonella), media yang digunakan untuk penyegaran kultur E.coli dan
Salmonella adalah TSB Broth.
3. Penyiapan Media Pengujian
Media pengujian yang digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri asam laktat adalah media cair MRS basis tetapi glukosa diganti dengan gula oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia. Media pengujian bakteri Lactobacillus yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas bahan berikut: Peptone, Yeast ekstrak, Tween 80, K2HPO4, MgSO4 7H2O, MnSO4 4H2O, Tri-
ammonium citrate, L-sistein, Bacto agar, dan gula oligosakarida (Tabel 9). Media pertumbuhan bakteri Bifidobacterium terdiri atas: Trypticase, Pytone, Yeast ekstrak, Tween 80, Cystein hydroclorid, K2HPO4, MgCl4 6H2O, Zn SO4 7H2O, CaCl2, Bacto
agar, dan gula oligosakarida (Tabel 10).
Bahan tersebut diatur pH-nya hingga 6,4-6,6 dengan cara menambahkan HCl 1% atau NaOH 1%. Kemudian ditempatkan dalam tabung reaksi masing- masing 9 ml dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Mineral K2HPO4 dibuat terpisah, dengan tujuan untuk menghindari terbentuknya
endapan dan kekeruhan. K2HPO4 dibuat dengan konsentrasi 100 kali konsentrasi
awal media, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Sebanyak 0,1 ml larutan mineral K2HPO4 ditambahkan secara aseptis ke
dilakukan pada saat akan melakukan uji pertumbuhan bakteri asam laktat (Lactobacillus dan Bifidobacterium) secara in vitro. Gula oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia yang digunakan dalam penelitian ini sebelumnya disterilisasi dengan membran filter steril 0,45 µm kemudian disaring dengan membran steril 0,2 µm. Sebanyak 2% gula oligosakarida steril ditambahkan ke dalam MRS basis steril secara aseptis.
Hal yang sama dilakukan untuk media pertumbuhan bakteri patogen (E.coli
dan Salmonella). Media pertumbuhan bakteri E.coli terdiri atas: Lab lemco powder, Yeast extract, Peptone, Sodium chloride, Agar, dan gula oligosakarida. Media pertumbuhan bakteri Salmonella terdiri atas: Beef extract, Peptone, Disodium phosphate, Ferrous sulfate, Bismuth Sulfite indicator, Brilian green, Agar, dan gula oligosakarida.
4. Perhitungan Jumlah Bakteri Asam Laktat (AOAC 1995)
Suspensi sampel dalam larutan fisiologis NaCL 0,85% (pengenceran 10-1) dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan fisiologis NaCL 0,85% sehingga diperoleh pengenceran 10-2, kemudian dengan cara yang sama dibuat pengenceran 10-3, 10-4 dan seterusnya sampai tingkat pengenceran yang diinginkan (diharapkan hasil plating diperoleh antara 25-250 koloni). Perhitungan jumlah BAL dilakukan dengan metode tuang, suspensi sampel dari tingkat pengenceran yang sesuai (10-5, 10-6, 10-7 dan 10-8) dipipet 1 ml dan dipupukkan ke dalam cawan petri steril kemudian dituangi media MRSA, digoyang supaya rata dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh dihitung sebagai jumlah bakteri asam laktat (BAL).
5. Perhitungan Jumlah Escherichia coli (AOAC 1995)
Suspensi sampel dalam larutan fisiologis NaCL 0,85% (pengenceran 10-1) dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan fisiologis NaCL 0,85% sehingga diperoleh pengenceran 10-2, kemudian dengan cara yang sama dibuat pengenceran 10-3, 10-4 dan seterusnya sampai tingkat pengenceran yang diinginkan (diharapkan hasil plating didapat antara 25-250 koloni). Suspensi sampel dari tingkat pengenceran yang sesuai dipipet 1 ml dan dipupukkan ke dalam cawan petri steril (duplo), kemudian dituangi Nutrient
Agar dan digoyang sampai rata, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan cara menghitung jumlah koloni fekal dan non fekal. Koloni tipikal E.coli adalah koloni berwarna hijau metalik.
6. Perhitungan Jumlah Salmonella (AOAC 1995)
Suspensi sampel dalam larutan fisiologis NaCL 0,85% (pengenceran 10-1) dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan fisiologis NaCL 0,85% sehingga diperoleh pengenceran 10-2, kemudian dengan cara yang sama dibuat pengenceran 10-3, 10-4 dan seterusnya sampai tingkat pengenceran yang diinginkan (diharapkan hasil plating didapat antara 25-250 koloni). Pada tingkat pengenceran yang sesuai, suspensi sampel dipipet 1 ml secara aseptik dan dipupukkan ke dalam cawan steril (duplo) kemudian dituangi BSA, digoyangkan supaya rata dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Pengamatan jumlah koloni yang tumbuh dihitung sebagai Salmonella. Ciri koloni tipikal Salmonella adalah warna biru kehijauan, dengan atau tanpa warna hitam di bagian tengah koloni, beberapa tampak sebagai koloni yang besar, berwarna hitam di tengahnya atau tampak sebagai koloni yang hampir semuanya berwarna hitam.
Uji Penempelan Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik
Uji penempelan atau adhesi dilakukan dengan metode menurut Dewanti dan Wong (1995), yaitu menggunakan lempeng stainless steel. Sebelum digunakan lempeng stainless steel terlebih dahulu dibersihkan dari kotoran yang menempel pada permukaannya dengan cara merendam dalam larutan detergen panas (40-45 oC) selama 24 jam. Lempeng tersebut kemudian dibilas dengan air panas (40-45 oC) hingga tidak berbusa dan licin lalu dikering anginkan. Setelah pencucian selesai pada salah satu bagian sisi lempeng diberi tanda dan selanjutnya disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 20 menit.
Pengujian dilakukan dengan cara meletakkan lempeng di dalam 250 ml media pertumbuhan yang diinokulasi dengan 1 ml kultur bakteri kedalam erlemenyer 1 liter. Kemudian diinkubasi pada suhu 29 oC selama 24 jam. Densitas biofilm dianalisa dengan cara membilas lempeng dengan larutan buffer fosfat (BF). Kemudian dengan menggunakan swab permukaan lempeng diseka secara
merata. Swab dimasukkan kedalam tabung yang berisi 10 ml BF dan tabung divortex selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan mikroskop dan uji pertumbuhan bakteri. Jumlah bakteri yang tumbuh dihitung dengan metode hitungan cawan dan dinyatakan dalam cfu/cm2, setelah diinkubasi pada suhu 29 oC selama 24 jam.
Uji penempelan atau adhesi isolat mikrob didasarkan pada kemampuan mikrob membentuk biofilm, mikrob yang mampu membentuk biofilm dengan baik akan memiliki kemampuan menempel dengan baik pula. Hal ini diujikan sebagai pendekatan terhadap kemampuan menempel isolat pada substrat padat (usus) yang akan digunakan sebagai probiotik pada tahapan penelitian selanjutnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Fermentasi Oligosakarida oleh Bakteri Asam Laktat
Pengujian bakteri asam laktat dalam memfermentasioligosakarida dilakukan guna mengetahui apakah oligosakarida tersebut dapat difermentasi oleh bakteri asam laktat (Lactobacillus dan Bifidobacterium), yaitu pengujian dengan memodifikasi media pertumbuhan mikroba tersebut, dimana media komersial yang mengandung glukosa diganti dengan gula oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia. Hasil pengujian dengan menggunakan gula oligosakarida sebagai pengganti glukosa pada media uji menunjukkan hasil yang positif. Oligosakarida tersebut dapat difermentasi oleh mikroba uji yaitu L. casei
Rhamnosus untuk mikroba aerob dan B. bifidum untuk anaerob. Hal ini ditunjukkan dengan tumbuhnya koloni yang dikelilingi zona kuning (Gambar 8).
Komponen oligosakarida yang dijadikan sebagai sumber prebiotik pada penelitian ini adalah sukrosa, stakhiosa dan rafinosa. Rafinosa merupakan trisakarida yang terdiri dari monomer fruktosa, galaktosa dan glukosa. Rafinosa tersebut dapat difermentasi oleh L.casei Rhamnosus dan B. bifidum. Smiricky- Tjardes et al. (2003) secara in vitro menunjukkan bahwa rafinosa/stakhiosa lebih cepat difermentasi menghasilkan asam lemak rantai pendek dibandingkan dengan FOS. Pada kultur murni yang ditambahkan rafinosa dan stakhiosa hasilnya menunjukkan bahwa rafinosa dan stakhiosa dapat dimetabolisme dengan baik
oleh Bifidobacterium dan Lactobacillus. Selain itu juga dapat dimetabolisme oleh bakteri enterik lainnya, kecuali E. coli (Rastal 2000). Menurut Tortuero et al.
(1997) di dalam Matteuzzi et al. (2004) rafinosa adalah substrat yang sangat efektif untuk fermentasi di dalam usus besar dan makanan yang mengandung rafinosa dapat menurunkan pH fecal, meningkatkan total asam lemak volatile dan konsentrasi Lactobacillus.
Delphine et al. (2007) menyebutkan bahwa L. casei Rhamnosus hanya dapat memfermentasi FOS oligomer trisakarida dan tetrasakarida, dan tidak dapat memfermentasi pentasakarida. Sementara B. bifidum dapat memfermentasi fruktosa, galakatosa, sukrosa dan melibiosa, namun tidak dapat memfermentasi maltosa dan inulin (Ballongue 2004). Martinez-Villaluenga et al. (2005) melaporkan bahwa L. casei Rhamnosus mampu memfermentasi gula-gula seperti glukosa, galaktosa, laktosa, mannosa, selobiosa, trehalosa dan rhamnosa, kadang- kadang juga mampu memfermentasi maltosa. Beberapa hasil penelitian lain menunjukkan bahwa bakteri asam laktat (BAL) mampu menghasilkan asam-asam organik sebagai hasil fermentasi gula seperti asam asetat dan laktat (Scheinbach 1998; Makinen dan Bigret 2004), asam propionat, diasetil, reuterin (Ouwehand dan Vesterlund 2004).
Asam laktat dan asetat dapat menghambat bakteri lain (patogen) sedangkan asam propionat lebih baik dalam menghambat yeast dan kapang. Senyawa penghambat lainnya yang dihasilkan BAL dalam jumlah kecil adalah hidrogen peroksida (Scheinbach 1998; Ouwehand dan Vesterlund 2004), diasetil dan reuterin (Ouwehand dan Vesterlund 2004), bakteriosin (Ouwehand dan Vesterlund 2004; Scheinbach 1998; Makinen dan Bigret 2004). Smiricky-Tjardes et al. (2003) menjelaskan bahwa komponen oligosakarida akan difermentasi oleh mikroflora saluran pencernaan menjadi asam lemak rantai pendek (SCFA) dan akan menurunkan pH (in vitro). Penelitian in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa prebiotik tidak dicerna oleh enzim saluran pencernaan, tetapi difermentasikan oleh bakteri anaerob di dalam usus besar. Melalui fermentasi prebiotik dihasilkan asam lemak rantai pendek (short chain fatty acid/SCFA) dan menstimulasi pertumbuhan berbagai bakteri termasuk Bifidobacteria dan Lactobacillus
Gambar 8. Bakteri L. casei Rhamnosus dan B. bifidum yang memfermentasi gula oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia dapat difermentasi oleh bakteri asam laktat (L. casei Rhamnosus dan B. bifidum), sehingga oligosakarida tersebut dapat berperan sebagai prebiotik. Meskipun demikian perlu pengujian lebih lanjut, untuk mengetahui seberapa besar oligosakarida tersebut dapat menstimulasi pertumbuhan bakteri asam laktat.
Fermentasi Oligosakarida oleh Bakteri Patogen
Pengujian fermentasi oligosakarida pada bakteri patogen (E.coli dan
Salmonella) dalam memfermentasi gula oligosakarida dilakukan guna mengetahui apakah oligosakarida tersebut dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh bakteri patogen. Hasil pengujian menunjukkan bahwa oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia tersebut tidak mampu difermentasi oleh bakteri patogen (E.coli dan Salmonella) yang ditunjukkan dengan tidak tumbuhnya koloni pada media uji (Gambar 9).
L. casei Rhamnosus yang memfermentasi oligosakarida B. bifidum yang memfermentasi oligosakarida
Gambar 9. Bakteri E. coli dan Salmonella yang tidak mampu memfermentasi oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia Tidak tumbuhnya koloni tersebut mengindikasikan bahwa bakteri E.coli
dan Salmonella tidak mampu menggunakan oligosakarida ekstrak tepung buah rumbia sebagai sumber nutrien untuk pertumbuhannya. Hal ini menunjukkan bahwa gula oligosakarida yang terdapat pada ekstrak tepung buah rumbia tidak dapat difermentasikan oleh mikroba uji, yang berarti oligosakarida hasil purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia memiliki potensi sebagai prebiotik. Prebiotik adalah bahan makanan yang dapat memperbaiki flora usus dengan memacu pertumbuhan bakteri yang menguntungkan seperti Lactobacillus dan
Bifidobacteria (Cao et al. 2005) dan menekan pertumbuhan bakteri patogen seperti Salmonella, E.coli, clostridia dan enterobacter (Fukata et al. 1999; Yusrizal dan Chen 2003). Prebiotik disebut juga sebagai nutrisi yang sesuai bagi bakteri baik, tetapi tidak cocok bagi bakteri jahat (Lorenzo et al. 2003).
Pertumbuhan Koloni Bakteri Asam Laktat
Pertumbuhan bakteri asam laktat (B. bifidum, B. animalis, L. casei
Rhamnosus, dan L. bulgaricus) pada media yang mengandung oligosakarida hasil
Bakteri E. coli yang tidak mampu memfermentasi oligosakarida
Bakteri Salmonella yang tidak mampu memfermentasi oligosakarida
purifikasi dari ekstrak tepung buah rumbia dan media kontrol (MRS basis tanpa gula) ditampilkan pada Gambar 10. Hasil pengujian keempat bakteri asam laktat (BAL) menunjukkan bahwa B. bifidum, B. animalis, L. casei Rhamnosus, dan L.
bulgaricus dapat menggunakan gula oligosakarida sebagai media
pertumbuhannya. Pertumbuhan BAL pada media oligosakarida ekstrak tepung buah rumbia disebabkan karena pada media tersebut mengandung beberapa komponen oligosakarida seperti sukrosa, rafinosa dan stakhiosa. Keberadaan gula-gula tersebut menyebabkan BAL dapat tumbuh dengan baik, yang ditandai dengan bertambahnya populasi bakteri sesuai dengan interval waktu inkubasi yaitu pertumbuhan BAL pada media oligosakarida dimulai pada 0 jam hingga jam ke-24 waktu inkubasi mencapai pertumbuhan eksponensial atau fase logaritma (fase log) dan selanjutnya terjadi pertumbuhan mendatar (fase statis) dan akhirnya terjadi penurunan populasi BAL (fase kematian atau penurunan) pada jam ke-36 dan jam ke-48 waktu inkubasi.
Pertumbuhan BAL berbeda yang terjadi pada media kontrol (MRS basis
tanpa gula) pertumbuhan dimulai pada jam ke-0 inkubasi dan langsung terjadi penurunan populasi BAL (fase kematian atau penurunan) pada jam ke-12 dan jam ke-24 hingga jam ke-48 waktu inkubasi. Hal ini disebabkan sokongan nutrisi pada jam ke-12 hingga jam ke-48 pada media kontrol sudah tidak tersedia lagi sehingga populasi bakteri mengalami penurunan atau bahkan terjadi kematian. Hasil lengkap jumlah pertumbuhan BAL pada media oligosakarida dan media kontrol (MRS basis tanpa gula) ditampilkan pada Lampiran 3.
Istilah pertumbuhan untuk mikroorganisme mengacu pada perubahan di dalam hasil panen sel (pertambahan total masa sel), dan bukan perubahan individu organisme. Pertumbuhan bakteri umumnya meliputi empat fase yaitu fase lamban (fase lag), fase logaritma/eksponensial, fase stasioner dan fase kematian sel (Pelczar dan Chan 1986). Cara khas reproduksi bakteri adalah pembelahan biner melintang, satu sel membelah diri menghasilkan dua sel, dan populasi akan bertambah secara geometrik. Pertumbuhan populasi sel pada umumnya terjadi pada fase logaritma atau eksponensial (sel membelah diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat, keadaan pertumbuhan seimbang). Selang waktu yang dibutuhkan sel untuk membelah diri disebut dengan waktu generasi.
Tiap spesies bakteri memiliki waktu generasi yang berbeda-beda. Apabila satu bakteri tunggal diinokulasikan pada suatu medium dan memperbanyak diri