DAFTAR LAMPIRAN
C. METODE PENELITIAN
5. Pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas ekstrak
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pH ekstrak terpilih dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji pada konsentrasi ekstrak 5% atau 10% (v/v) dengan menggunakan pelarut buffer fosfat. Pelarut dengan pH awal 7.2 diatur keasamannya menjadi pH 4, 5, 6 dan 7 dengan menggunakan HCl 0.1 M dan NaOH 0.1 M. Prosedur pelaksanaan dapat dilihat pada Gambar 5.
Jumlah setiap bagian komponen uji yang ditambahkan pada berbagai konsentrasi ekstrak dihitung berdasarkan rumus pengenceran. Contoh perhitungan dan pembuatan larutan sampel dapat dilihat pada Lampiran 1. Setelah waktu kontak yang ditentukan, jumlah koloni bakteri dihitung dengan metode tuang. Koloni yang terbentuk dihitung dan data dilaporkan sebagai persentase penghambatan, yaitu penghambatan (%) = 100% – [(Nt/No)x 100%] (Zuraida 2008) .
Stok ekstrak terpilih
Dilarutkan dalam DMSO
Ekstrak konsentrasi 10% (v/v)
Ditambahkan dalam media NB sehingga diperoleh tabung dengan konsentrasi ekstrak 0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 dan 6.0 % v/v
Diinokulasi dengan bakteri uji sehingga jumlah koloni awal @ tabung 105 cfu/ml
Dihomogenkan dengan vorteks
Diamati jumlah koloni per ml dengan metode tuang untuk perlakuan 0 jam kontak
Dihomogenkan dengan vorteks
Shaker selama 24 jam suhu 37oC
Gambar 5. Uji pengaruh pH ekstrak terhadap pertumbuhan bakteri
6.
Pengukuran kapasitas antioksidan
Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode ini berdasarkan pada DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazil) freeradical scavenging activity daun gatel dan daun benalu cengkeh. Selain itu juga dibuat kurva standar menggunakan vitamin C (52.3 mg asam askorbat per 25 ml). Persiapan maupun uji untuk standar, sampel dan blanko sesuai dengan Gambar 6.
Gambar 6. Analisis antioksidan metode DPPH
Aktivitas antioksidan dari sampel ditentukan berdasarkan persamaan garis lurus yang didapatkan dari uji pada standar. Sedangkan kapasitas antioksidan dihitung berdasarkan Persamaan (3).
Kapasitas antioksidan (%) =
[Absorbansi blanko – Absorbansi larutan sampel]
x 100 % (3) Absorbansi larutan sampel
Disiapkan 1 ml larutan uji dalam tabung reaksi
Ditambahkan 7 ml metanol (sebagai blanko 8 ml metanol)
Ditambahkan 2 ml larutan DPPH 1mM dan dikocok dengan vortex
Diinkubasi dalam suhu ruang
Diukur absorbansinya pada 517 nm Ekstrak terpilih
Dilarutkan dalam DMSO
Ekstrak konsentrasi 10% (v/v)
Ditambahkan dalam masing-masing media NB dengan buffer fosfat pH 4, 5, 6 dan 7 sehingga diperoleh konsentrasi 5% atau 10% (v/v)
Diinokulasi dengan bakteri uji sehingga jumlah koloni awal @ tabung 105 cfu/ml
Dihomogenkan dengan vorteks
Diamati jumlah koloni per ml dengan metode tuang untuk perlakuan 0 jam kontak
Dihomogenkan dengan vorteks
Shaker selama 24 jam suhu 37oC
7.
Analisis kadar abu metode pengabuan kering (SNI 01-2891-1992)
Analisis kadar abu dilakukan dengan metode pengabuan kering berdasarkan SNI 01-2891-1992 sebanyak dua kali ulangan. Prosedur pelaksanaannya sebagaimana dapat dilihat pada Gambar 7. Kadar abu dinyatakan dalam basis basah dengan perhitungan menggunakan persamaan 4 :
Kadar abu (g/100 g bahan basah)= W1–W2 x 100 (4) W
W1 merupakan bobot cawan berisi sampel setelah pengabuan, W2 merupakan bobot cawan kosong dan W merupakan bobot sampel sebelum diabukan.
Gambar 7. Prosedur analisis kadar abu metode pengabuan kering
8.
Analisis total serat pangan (AOAC Official methods 985.29)
Analisis total serat pangan dilakukan dengan metode AOAC official methods 985.29 sebagai jumlah dari serat pangan larut dan serat pangan tak larut. Pertama kali disiapkan kertas saring kosong yang telah dioven. Sampel kering rendah lemak sebanyak 0,5 gram ditimbang dan ditempatkan dalam erlenmeyer. Setelah itu bufer fosfat 0,08 M pH 6,0 sebanyak 25 ml dan termamyl sebanyak 50 µl ditambahkan ke dalam erlenmeyer. Campuran dipastikan homogen dan ditutup dengan alumunium foil. Kemudian campuran sampel diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 30 menit dengan diaduk setiap 5 menit. Termomener digunakan untuk memastikan tercapainya suhu internal sebesar 95 oC selama 15 menit. Sampel didinginkan setelah inkubasi selesai dan ditambahkan 5 ml NaOH 0,275 N serta 0,05 ml larutan enzim protease. Campuran kemudian dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 60oC selama 30 menit dalam penangas air bergoyang. Kemudian diatur pHnya menjadi 4,5 dengan 5 ml HCl 0,325 N dan ditambahkan 0,15 ml AMG. Sampel diinkubasi kembali pada suhu 60 oC selama 30 menit. Sebanyak 140 ml etanol 95% yang telah dipanaskan hingga 60oC ditambahkan setelah inkubasi selesai dan dibiarkan selama 60 menit agar terbentuk endapan (presipitat SDF). Sampel disaring menggunakan penyaring yang mengandung Celite 545 0,5 g atau kertang saring Whatman, dibantu dengan Buchner. Sampai pada tahap ini prosedur penentuan serat larut dan larut dilakukan dengan langkah sama. Pada penentuan serat pangan tidak larut residu selanjutnya dicuci dengan 10 ml air untuk melarutkan SDF, 2 x10 ml etil alkohol 95 % dan 2 x10 ml aseton secara berturut-turut. Pada penentuan serat pangan larut filtrat ditepatkan bobotnya hingga 100 gram dengan air destilata dan kemudian ditambahkan 140 ml etanol 95% (yang telah dipanaskan sampai 60oC) serta dibiarkan mengendap pada suhu kamar selama 1 jam.
Cawan porselin kosong dikeringkan dalam oven bersuhu 105oC selama 15 menit
Didinginkan dalam desikator
Ditimbang dengan neraca analitik
Sampel 1-2 gram ditimbang dalam cawan
Dimasukkan pada tanur listrik suhu 550oC sampai pengabuan sempurna
Didinginkan dalam desikator
Pada kedua analisis (serat larut dan tidak lart) kemudian melalui langkah pengeringan yang sama. Kertas saring dikeringkan selama satu malam dalam oven suhu 105 oC dan didinginkan dalam desikator setelah pengeringan selesai. Kertas kemudian ditimbang dan dicatat bobotnya. Kadar serat pangan larut atau kadar serat pangan tidak larut dihitung berdasarkan Persamaan (5). Bobot residu merupakan selisih bobot kertas saring hasil pengeringan dan bobot kertas saring awal. P, A dan B ialah bobot protein, abu dan residu blanko dari masing-masing sampel, sedangkan bobot sampel adalah bobot sampel yang diambil.
Serat pangan (%) = [(bobot residu–P–A–B)/ bobot sampel] x 100 (5)
9.
Analisis kadar air metode oven (SNI 01-2891-1992)
Analisis kadar air dilakukan dengan metode oven berdasarkan SNI 01-2891-1992 dengan dua ulangan. Prosedur pelaksanaannya sebagaimana dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 8. Prosedur analisis kadar air metode oven
Kadar air dihitung dalam basis basah berdasarkan Persamaan (6). Bobot sampel sebelum dikeringkan dinyatakan dengan W, bobot cawan dan sampel setelah pengeringan dinyatakan dengan W2 dan bobot cawan kosong dinyatakan dengan W1.
Kadar air (g/ 100 g bahan basah) = W–(W2 – W1) x 100 (6) W
Cawan dikeringkan dalam oven selama 15 menit
Didinginkan dalam desikator
Ditimbang dengan neraca analitik
Sampel 1-2 gram ditimbang dalam cawan
Cawan berisi sampel dikeringkan pada oven suhu 105oC selama 1 malam
Didinginkan dalam desikator
Cawan berisi sampel ditimbang
Bobot sudah tetap?
Bobot belum tetap Bobot sudah tetap
10.
Analisis kadar lemak metode Soxhlet (SNI 01-2891-1992)
Analisis kadar lemak dilakukan dengan metode soxhlet menggunakan pelarut heksana. Prosedur ekstraksi yang dilakukan seperti pada Gambar 9. Kadar lemak dihitung berdasarkan persamaan 7 dengan Wo merupakan bobot sampel dalam gram, W1 merupakan bobot labu lemak dan lemak hasil ekstraksi dan W2 merupakan bobot labu lemak kosong.
Gambar 9. Prosedur analisis kadar lemak metode soxhlet
11.
Analisis kadar protein metode Kjeldahl (AOAC 960.52 yang dimodifikasi)
Analisis kadar protein dilakukan dengan metode Kjeldahl (AOAC 960.52 yang dimodifikasi) sebagaimana dapat dilihat pada Gambar 10. Analisis dilakukan dengan dua kali ulangan dan penetapan blanko dengan prosedur yang sama.Kadar lemak (g/ 100 g bahan basah) = W1 – W2 x 100 (7) W0
Labu lemak dikeringkandalam oven bersuhu 105oC selama 15 menit
Didinginkan dalam desikator
Ditimbang dengan neraca analitik
Dipasang pada alat soxhlet
Sampel ditimbang 1-2 gram
Dimasukkan ke dalam selongsong kertas saring beralas kapas
Disumbat dengan kapas dan dikeringkan dalam oven suhu 80oC selama 1 jam
Dimasukkan kedalam tabung ekstraksi soxhlet
Ekstraksi lemak dengan heksan selama 6 jam
Heksan disuling dan ekstrak lemak dikeringkan pada oven suhu 105oC
Didinginkan dalam desikator
Gambar 10. Prosedur analisis kadar protein metode Kjeldahl
Kadar protein dihitung dengan persamaan (8) dengan terlebih dahulu dihitung kadar N sampel.
% N = (ml HCl sampel – ml HCl blanko) x N HCl x 14,007 x 100 mg sampel
Kadar protein (g/ 100 g bahan basah) = % N x Faktor konversi (8) Sampel ditimbang seberat 150 – 250 mg dalam labu Kjeldhal
Ditambahkan 1,0 0,1 gram K2SO4, 40 10 mg HgO dan 2 0,1 ml H2SO4
Ditambahkan 2-3 butir batu didih dan dididihkan selama 1–1,5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan jernih
Didinginkan
Ditambahkan air destilata lewat dinding labu dan digoyang sampai kristal melarut
Larutan hasil penghancuran dipindahkan kedalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1–2 ml air destilata
Air pembilasan dipindahkan ke labu destilasi
Ditambahkan 8–10 ml larutan 60% NaOH–5% Na2S2O3
Erlenmeyer 250 ml yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2–4 tetes metilen red-metilen blue di bawah kondensor dengan ujung kondensor terendam larutan H3BO3
Didestilasi sampai diperoleh 15 ml destilat
Destilat diencerkan dalam erlenmeyer hingga 50 ml
Dititrasi dengan HCl 0,02 N terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu
IV.HASIL DAN PEMBAHASAN
A.
ANALISIS KIMIAWI DAUN UJI
1.
Daun Gatel
Analisis kimiawi yang dilakukan terhadap daun gatel yang telah dikeringkan di bawah sinar matahari meliputi kadar serat (larut dan tidak larut), air, abu, protein, dan lemak serta aktivitas antioksidan. Hasil analisis kimiawi daun gatel dapat disimak pada Tabel 4. Kadar serat pangan total, kadar air, abu dan protein daun gatel lebih dari 10%, sedangkan kadar lemaknya hanya berkisar 1.4%.
Tabel 4. Hasil analisis kimiawi daun gatel kering
Variabel pengamatan Jumlah (%) Kadar serat
Serat larut 14.83
Serat tidak larut 2.61 Serat pangan total 17.44
Kadar air 10.61
Kadar abu 13.82
Kadar protein 17.13
Kadar lemak 1.40
Daun gatel memiliki kadar serat pangan total 17.44%. Menurut Widowati et al. (2010) produk makanan dapat dikatakan sebagai sumber serat pangan jika mengandung serat pangan sebesar 3-6 gram/ 100 gram. Dengan demikian daun gatel memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai pangan fungsional kaya serat.
Nilai kadar air daun gatel sebesar 10.61%. Menurut Winarno (2002) mikroorganisme seperti kapang dan bakteri dapat tumbuh pada kondisi kadar air 8% untuk kapang dan 7.5% untuk bakteri. Kadar air yang baik adalah kurang dari 10% agar bahan dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama dan kemungkinan rusak karena jamur sangat kecil. Kadar air yang tinggi dapat meningkatkan peluang kontaminasi oleh kapang dan bakteri apabila sampel disimpan dalam waktu yang lama. Kadar air daun gatel lebih kecil dari pada kadar air daun kedondong kering yang diteliti oleh Inayati (2007) pada pengeringan dengan oven suhu 50oC selama 24 jam yaitu, 76.74%. Pada penelitian ini kadar air tidak beresiko terhadap sampel karena setelah pengeringan selesai sampel langsung digunakan untuk diekstraksi pada hari berikutnya.
Kadar abu daun gatel yang diteliti sebesar 13.82% dan lebih tinggi daripada kadar abu hasil analisis yang dilakukan oleh Tulaeka (1986) yaitu 8.07%. Selain itu pada penelitian Tulaeka (1986) kadar abu 6.53% pada batang dan 7.38% pada akar. Abu merupakan residu anorganik dari proses pembakaran atau oksidasi komponen organik bahan pangan. Kadar abu menunjukkan total mineral yang terkandung dalam bahan pangan tersebut. Kadar abu daun gatal yang besar relevan dengan kadar komponen organiknya (serat pangan dan protein) yang besar juga.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar protein daun gatel sebesar 17.13%. Kandungan protein daun gatel lebih besar dari kandungan bahan pangan sumber karbohidrat seperti sorgum, terigu dan beras. Menurut Widowati et al. (2010) sorgum mengandung protein (8-12%) setara dengan terigu atau lebih tinggi dibandingkan dengan beras (6-10%).
Senyawa antioksidan alami adalah senyawa antioksidan yang diperoleh dari hasil ekstraksi bahan alami, seperti tumbuh-tumbuhan. Antioksidan alami antara lain tokoferol, lesitin, fosfatida, sesamol, gosipol, karoten, dan asam askorbat yang banyak dihasilkan oleh tumbuhan. Antioksidan alami yang paling banyak ditemukan dalam minyak nabati adalah tokoferol yang mempunyai keaktifan vitamin E dan terdapat dalam bentuk α, , , δ-tokoferol (Winarno 2008). Charalampos et al. (2008) menambahkan senyawa kimia lainnya yang tergolong antioksidan dan berasal dari tumbuhan adalah golongan flavonoid dan polifenol.
Tabel 5. Kapasitas antioksidan daun gatel kering
Absorbansi Absorbansi Aktv Antioksidan Blanko Sampel (mg/g) = ppm 0.4862 0.4324 755.6244 0.4862 0.4332 739.3370
Rata-rata 747.48
Kemampuan daun gatel dalam menangkal radikal bebas diteliti berdasarkan kemampuannya menangkal radikal DPPH menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm dengan hasil seperti terlihat pada Tabel 5. Radikal DPPH dalam larutan uji berkurang dengan adanya penambahan sampel dengan ditunjukkan nilai absorbansi sampel yang lebih rendah dari absorbansi blanko. Hasil penelitian menunjukkan daun gatel memiliki kapasitas antioksidan 747.48 mg/g sampel seperti. Kapasitas antioksidan dari sampel terkait dengan kemampuannya mendonorkan hidrogen. Radikal bebas menyebabkan autooksidasi lemak jenuh pada pangan, sedangkan antioksidan dipercaya dapat memutus rantai oksidasi oleh radikal bebas dengan mendonorkan ion hidrogen dari gugus hidroksil penolnya sehingga terbentuk produk akhir yang stabil. Hal ini pada akhirnya menghentikan inisiasi ataupun propagasi oleh radikal bebas (Jayaprakasa et al. 2003). Data kapasitas antioksidan daun gatel menunjukkan bahwa sampel merupakan penghambat aktivitas radikal bebas dalam mengoksidasi dan dapat digunakan sebagai antioksidan untuk menanggulangi radikal bebas.
2.
Daun Benalu Cengkeh
Analisis kimiawi yang dilakukan terhadap daun benalu cengkeh yang telah dikeringkan di bawah sinar matahari meliputi kadar serat, air, abu, protein, dan lemak serta aktivitas antioksidan. Hasil analisis kimiawi daun benalu cengkeh dapat disimak pada Tabel 6. Kadar serat pangan total, kadar air, abu dan daun benalu cengkeh lebih dari 10%, sedangkan kadar lemak dan proteinnya dibawah 5%.
Tabel 6. Hasil analisis kimiawi daun benalu cengkeh
Variabel pengamatan Jumlah (%)
Kadar serat
Serat larut 16.85
Serat tidak larut 1.21 Serat pangan total 18.06
Kadar air 11.27
Kadar abu 11.27
Kadar protein 1.32
Kadar air daun benalu cengkeh adalah 11.27%. Nilai kadar air yang tinggi meningkatkan peluang kontaminasi oleh kapang dan bakteri apabila sampel disimpan dalam waktu yang lama. Namun demikian, kadar air yang tinggi tidak beresiko terhadap sampel karena setelah pengeringan selesai sampel langsung diekstraksi pada hari berikutnya. Selain itu nilai kadar air benalu cengkeh masih berada dibawah kadar air minimal penyimpanan gabah (14%).
Daun benalu cengkeh memiliki kadar serat pangan total (18.06%) lebih besar dari batas produk makanan dapat dikatakan sebagai sumber serat pangan (3-6 gram/ 100 gram). Kandunga serat total sebagian besar merupakan serat larut. Hal ini memiliki keuntungan dari sisi penampakan sehingga terbentuknya endapan selama periode penyimpanan lebih minimal. Dengan demikian daun benalu cengkeh memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai pangan fungsional kaya serat.
Berdasarkan hasil analisis kadar lemak dengan metode Sohxlet diketahui bahwa kadar lemak daun benalu cengkeh adalah 4.27%. Selain itu daun benalu cengkeh juga mengandung mengandung protein sebesar 1.32%.
Pengujian kapasitas antioksidan daun benalu cengkeh kering dilakukan dengan metode DPPH berdasarkan kemampuannya menangkal radikal DPPH menggunakan spektrofometer pada panjang gelombang 517 nm. Data hasil pengujian yang diuraikan dalam tabel 7 di bawah ini menunjukkan bahwa sampel mampu menangkal radikal DPPH dengan menyumbangkan hidrogen sehingga autooksidasi menghasilkan produk akhir yang stabil dan inisiasi maupun propagasi dapat dihambat. Aktivitas antioksidan daun benalu cengkeh adalah 750.07 mg/g sampel. Hal ini menunjukkan daun benalu cengkeh dapat menyumbangkan ion hidrogen dan menghambat reaksi oksidasi berantai sehingga dapat digunakan sebagai sumber antioksidan.
Tabel 7. Kapasitas antioksidan daun benalu cengkeh kering
Absorbansi Absorbansi Aktv Antioksidan Blanko Sampel (mg/g) = ppm
0.4862 0.2831 744.22523
0.4862 0.2814 755.91311
Rata-rata 750.07
B.
EKSTRAKSI KOMPONEN DAUN UJI
1.
Daun Gatel
Ekstraksi minyak atsiri daun gatel menghasilkan ekstrak sangat sedikit dan tidak mungkin untuk diuji antibakterinya, sedangkan rendemen dan sifat fisik ekstrak hasil dari setiap tingkat ekstraksi disajikan pada Tabel 8. Ekstrak polar yang merupakan hasil ekstraksi dengan pelarut metanol memberikan rendemen yang lebih tinggi (49.502.48%) dibandingkan dengan ekstrak semipolar (etilasetat) (5.32 0.59%) dan ekstrak nonpolar (heksana) (2.510.16%). Perbedaan polaritas pelarut menghasilkan kandungan komponen bioaktif yang berbeda di dalam ekstrak heksana (nonpolar), etilasetat (semi polar) dan metanol (polar). Daun gatel lebih banyak mengandung komponen polar dibandingkan komponen lainnya. Hasil penelitian pada daun tembakau oleh Puspita (2011) menunjukkan bahwa ekstrak polar lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak semipolar dan nonpolar.
Penghilangan pelarut dilakukan dengan menggunakan rotavapor pada suhu 45oC dan penghembusan dengan gas N2 hingga terbentuk konsentrat pekat. Penghilangan pelarut pada suhu 45oC diharapkan belum menyebabkan komponen aktif daun benalu cengkeh mengalami perubahan.
Tabel 8. Sifat fisik dan rendemen ekstrak daun gatel
Variabel Ekstrak heksana Ekstrak etil asetat Ekstrak metanol (nonpolar) (semipolar) (polar)
Warna Hijau pekat Hijau tua Hijau
Penampakan Kental pekat (oily) Agak kental Cair Rendemen (%) 2.51 0.16 5.32 0.59 49.50 2.48
Warna ekstrak daun gatel berada pada rentang warna hijau. Gambar 11 menunjukkan bahwa warna filtrat hasil maserasi daun gatel juga berwarna hijau. Gatel merupakan tumbuhan yang dapat memproduksi energi sendiri dengan fotosintesis dan warna hijau menunjukkan kandungan klorofil yang tinggi pada ekstrak.
Gambar 11. Warna hijau pada filtrat hasil maserasi daun gatel yang sedang di evaporasi
Heksana merupakan pelarut nonpolar sehingga lebih cenderung melarutkan komponen- komponen nonpolar dari daun gatel. Berdasarkan skreening senyawa fitokimia pada daun Gymnema montanum yang dilakukan oleh Ramkumar et al. (2007) menunjukkan bahwa ekstrak heksana daun tersebut mengandung alkaloid dan glikosid.
2.
Daun benalu cengkeh
Hasil ekstraksi minyak atsiri daun gatel menghasilkan ekstrak sangat sedikit dan tidak mungkin untuk diuji antibakterinya. Karakteristik dan rendemen ekstrak nonpolar, semipolar dan polar daun benalu cengkeh dapat dilihat pada Tabel 9. Pada tabel dapat dilihat bahwa rendemen ekstraksi dengan pelarut metanol 29.74 0.70% lebih besar dari ekstraksi dengan etil asetat 2.31 0.02% dan heksana 1.83% 0.29.
Tabel 9. Sifat fisik dan rendemen ekstrak daun benalu cengkeh
Variabel Ekstrak heksana Ekstrak etil asetat Ekstrak metanol (nonpolar) (semipolar) (polar)
Warna Coklat tua Coklat Coklat
Penampakan Kental (oily) Agak kental Cair Rendemen (%) 1.83 0.29 2.31 0.02 29.74 0.70
Penampakan ekstrak heksana yang kental dan oily menunjukkan bahwa sebagian komponen yang terkandung adalah lemak dan minyak. Heksana merupakan pelarut nonpolar. Menurut Houghton dan Raman (1998) ekstraksi menggunakan pelarut nonpolar, seperti petroleum eter, heksana dan kloroform dapat digunakan untuk menghilangkan senyawa nonpolar alami, terutama senyawa lilin tanaman, lemak-minyak nabati, minyak atsiri dan alkaloid.
C.
PENGUJIAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumur untuk mengetahui diameter penghambatan ekstrak terhadap bakteri uji yang tergolong bakteri patogen dan perusak pangan. Uji dilakukan pada konsentrasi ekstrak 5% (v/v) dalam pelarut DMSO (dimetil sulfoksida).
Pelarut DMSO dipilih karena memiliki kharakteristik sebagai emulsifier yang mempunyai gugus polar dan non polar, dan diharapkan dapat membawa ekstrak berdifusi dengan baik. Pengaruh DMSO terhadap bakteri uji perlu diteliti, walaupun sebagai kontrol negatif. Penghambatan oleh ekstrak dihitung dengan mengurangkan diameter areal bening dengan diameter sumur dalam satuan milimeter (mm) dan pengaruh DMSO terhadap bakteri uji perlu dikurangkan pada perhitungan diameter penghambatan.
1.
Daun Gatel
Pengamatan aktivitas antibakteri daun gatel menunjukkan bahwa ekstrak heksana tidak memperlihatkan efek penghambatan pada konsentrasi 5% (v/v) terhadap semua bakteri uji. Selain itu
Salmonella enteritica serovar Typhimurium, Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa
tidak terhambat oleh semua jenis ekstrak pada konsentrasi 5% (v/v). Berdasarkan uji B. cereus dan E. coli terhambat oleh ekstrak etil asetat dan metanol.
Ekstrak heksana mengandung komponen nonpolar seperti lemak dan minyak. Minyak dan lemak lainnya yang mempunyai ukuran molekul besar diduga tidak larut dengan baik dalam DMSO sehingga mengganggu proses difusi dan ekstrak tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri.
Tabel 10. Diameter penghambatan bakteri uji terhadap ekstrak daun gatel 5% (v/v)
Bakteri Diameter penghambatan (mm) Heksan Etil asetat Metanol Kontrol
negatif Kontrol positif Salmonella typhimurium 0 0 0 0 15.01 Staphylococcus aureus 0 0 0 0 16.61 Pseudomonas aeruginosa 0 0 0 0 Bacillus cereus 0 1.2 2.1 0 20.61 Escherichia coli 0 3.1 1.6 0 Keterangan : 1
Berdasarkan penelitian Fathia (2011) pada antibiotik kloramfenikol pada konsentrasi 100 mg/ml
Tabel 10 menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol terhadap E. coli berdasarkan ukuran diameter penghambatan. Menurut Kanazawa et al. diacu dalam Nurcahyanti et al. (2011), suatu senyawa yang mempunyai polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antibakteri maksimum, karena interaksi suatu senyawa antibakteri dengan bakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik-lipofilik (HLB : hydrophilic lipophilic balance).
Menurut Nurcahyanti et al. (2011) sifat polaritas senyawa fenolik yang bersifat polar dapat menyebabkan perbedaan kadar total fenolik pada setiap ekstrak yang berbeda tingkat polaritasnya. Senyawa fenolik merupakan substansi yang mempunyai cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil sehingga sifatnya mudah larut dalam pelarut polar. Houghton dan Raman (1998) menyatakan bahwa komponen fenolik umumnya larut dalam pelarut organik yang bersifat polar, sehingga sesuai dengan pernyataan tersebut pelarut metanol yang dapat mengekstrak senyawa fenolik lebih baik.
Polaritas senyawa merupakan sifat fisik senyawa antimikroba yang penting. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa larut dalam fase air yang merupakan tempat hidup mikroba
tetapi senyawa yang bekerja pada membran sel hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik sehingga senyawa antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik-lipofilik untuk mencapai aktivitas yang optimal (Branen dan Davidson, 1993).
Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas penghambatan lebih besar pada E. coli dibandingkan ekstrak metanol. Hal ini sesuai dengan penelitian Nurcahyanti et al. (2011) dan Moshi dan Mbwambo (2005) diacu dalam Nurcahyanti et al. (2011) bahwa ekstrak semipolar (etil asetat) mampu menghambat bakteri E.coli dengan diameter penghambatan lebih besar daripada ekstrak polar (metanol).
2.
Daun benalu cengkeh
Hasil uji aktivitas antibakteri daun benalu cengkeh pada konsentrasi 10% menunjukkan adanya penghambatan pada Bacilluscereus dengan diameter penghambatan sebesar 1.2 mm pada ekstrak etil asetat dan 1.3 mm pada ekstrak methanol (Tabel 11). Bakteri E. coli, P. aeruginosa, S. aureus dan S.
Thypimurium tidak dihambat oleh ekstrak heksana, etil asetat dan metanol dan ekstrak heksana tidak menghambat B. cereus.
Menurut Andriyanto (2001), faktor pengenceran tidak memberikan pengaruh terhadap pembentukan daerah bening disekitar sumur. Selain itu penggunaan konsentrasi ekstrak yang tinggi tidak menjamin terbentuknya daerah bening yang besar dan semakin tinggi tingkat pengenceran belum menjamin terbentunya daerah bening. Hasil pengujian pada ekstrak biji, daging dan kulit buah sotul menunjukkan bahwa sampel uji dengan ekstrak yang diencerkan sebanyak empat kali (1:3) memiliki diameter penghambatan yang lebih besar dibandingkan ekstrak yang diencerkan tiga kali (1:2). Hal tersebut disebabkan oleh kemampuan berdifusi ekstrak yang masih kental lebih rendah dari pada yang lebih encer.
Tabel 11. Diameter penghambatan bakteri uji terhadap ekstrak daun benalu cengkeh 5% (v/v)