BAB III METODE PENELITIAN
3.6 Pengumpulan Data
Metode pengumpulan data merupakan cara yang digunakan untuk mendapatkan data yang dibutuhkan untuk menjawab permasalahan dalam penelitian.
3.6.1 Pemeliharaan dan Perbanyakan Monascus purpureus
Medium yang digunakan untuk menumbuhkan M.purpureus adalah PDA (Potato Dekstrose Agar). Medium dibuat dengan mencampurkan serbuk PDA dengan aquades dengan takaran tertentu. Standar pembuatannya yaitu untuk 1L medium PDA, dibutuhkan 39g serbuk PDA. Setelah dicampurkan dengan aquades dan diaduk hingga homogen, medium dipanaskan di hot plate dan magnetic
stirrer hingga mendidih. disterilkan di autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah disterilkan, media didinginkan sampai suhu ruangan.
Dimasukkan media PDA ke dalam tabung reaksi untuk membuat media miring, tunggu sampai membeku. Isolat kapang Monascus purpureus diinokulasikan menggunakan kawat ose. Diinkubasi selama 6 hari pada suhu 30-31oC (Nufus, 2013).
3.6.2 Perhitungan jumlah spora Monascus purpureus
Perhitungan jumlah spora yang diproduksi oleh Monascus purpureus dilakukan menggunakan alat haemocytometer dengan cara diambil koloni
M.purpureus yang sudah diinokulasikan pada agar miring. Pengamatan jumlah
spora dilakukan dengan cara manambahkan 9ml aquades steril pada setiap tabung yang berisi kultur M. purpureus. Hifa yang menempel pada medium dikeruk perlahan menggunakan jarum ose hingga didapatkan suspensi sporanya, setelah itu suspensi spora dipindahkan kedalam tabung kosong dan dihomogenkan dengan cara divortex, lalu dipipet dan diteteskan satu tetes kedalam bidang hitung haemocytometer dan ditutup dengan gelas penutup.
Gambar 3.1 Penutupan Alat Haemocytometer Dengan Gelas Penutup
Kemudian dengan menggunakan perbesaran 400x, spora M.purpureus dapat terhitung dibawah mikroskop. Spora yang dihitung hanya pada daerah dengan nomor 3 dengan bidang hitung (1+2+3+4+5) seperti yang tersaji pada Gambar 3.2
Gambar 3.2 Haemocytometer yang Diamati dengan Menggunakan
Mikroskop (Sumber : (Yuliani, 2013)
Pada daerah dengan nomor tiga terdapat 25 kotak. Dari 25 kotak tersebut dipilih lima kotak saja yang dijadikan tempat perhitungan spora M. purpureus, yaitu kotak A, B, C, D dan E. Seperti yang tersaji dalam Gambar 3.3
Gambar 3.3 Titik Perhitungan Spora
Setiap kotak A, B. C, D memiliki enambelas kotak kecil. Perhitungan spora seperti yang terdapat pada Gambar 3.5
Gambar 3.4 Alur Perhitungan Spora
(Sumber : (Yuliani, 2013)
Setelah didapat jumlah spora, lalu dihitung jumlah spora/ml pada bidang hitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
𝑆 = 𝑅 𝑥 𝐾 𝑥 𝐹
Keterangan :
S : Jumlah spora/ml
R : Jumlah rata-rata spora pada 5 bidang pandang haemocytometer K : Konstanta koefisien alat (2,5 x 105)
F : Faktor Pengenceran yang dilakukan (Yuliani, 2013)
3.6.3 Persiapan Suspensi Kapang Monascus purpureus
Suspensi spora M.purpureus dibuat dengan cara ditambah 9ml aquades steril. Suspensi yang didapat kemudian divorteks hingga homogen dan dihitung
jumlah sporanya menggunakan haemocytometer. Untuk mendapatkan banyaknya suspensi spora yang diinokulasikan maka digunakan rumus sebagai berikut :
𝑥 = 𝑛
100 𝑥 10 Keterangan :
x : Banyaknya suspensi spora yang digunakan n : Konsentrasi yang digunakan
10 : 10g substrat yang digunakan
Penentuan konsentrasi dibuat berdasarkan perbandingan konsentrasi dengan banyak substrat yang digunakan. Pada 5% (v/b), 10g substrat diinokulasikan dengan 0,5ml suspensi spora M.purpureus. Konsentrasi 10% (v/b), 10g substrat diinokulasikan dengan 1ml suspensi spora M.purpureus. Konsentrasi 15% (v/b), 10g substrat diinokulasikan dengan 1,5ml suspensi spora
M.purpureus(Yuliani, 2013). Penambahan inokulum yang dianjurkan untuk
fermentasi padat adalah sebanyak 2 x 106 hingga 2 x 108 cfu/ml(Zubaidah & Sari, 2015)
3.6.4 Pembuatan Tepung Biji Alpukat
Metode perlakuan awal yang dilakukan adalah pemilihan biji alpukat yang baik, pencucian biji alpukat, pengelupasan kulit biji, dan teknik pemotongan biji alpukat. Pengelupasan kulit biji alpukat dapat dilakukan dengan menggunakan pisau karena kulit biji alpukat tipis dan mudah dikelupas. Pemotongan biji alpukat dilakukan secara irisan (slicing) dengan tebal kira-kira 0,5 mm .
Untuk pembuatan larutan: padatan sebanyak 1 gram kemudian dimasukkan ke dalam gelas kimia dan ditambahkan dengan aquades hingga volume yang
ditentukan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk hingga padatan larut dalam aquades.
Biji alpukat direndam dengan larutan natrium metabisulfit, perendaman selama 24 jam, rasio biji alpukat dan larutan perendam (F/S) 1:5 (gr/mL). Biji alpukat yang sudah direndam kemudian dicuci menggunakan aquades kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 50oC sampai kering (Chandra & Inggrid, 2013).
3.6.5 Persiapan Medium Fermentasi
Tepung biji alpukat ditimbang dengan menggunakan timbangan digital dengan berat 10g untuk setiap cawan petri. Setiap cawan petri kemudian ditambahkan 4ml larutan nutrisi yang mengandung : 0,25% (b/v) KH2PO4, 0,15% (b/v) NH4NO3, dan 0,1% (b/v) MgSO4.7H2O dalam 12,5ml akuades (Tedjautama & Zubaidah, 2014). Selain itu, pH substrat diatur hingga mencapai pH 6.0 dengan 0,1M NaOH atau 0,1M HCl. Kemudian cawan petri ditutup menggunakan kertas coklat dan disterilisasi dengan autoklaf 1210C selama 15 menit dengan tekanan 15 psi (Ahmad et al, 2009).
3.6.6 Fermentasi Monascus purpureus pada Substrat Tepung Biji Alpukat
Substrat yang telah disterilkan didinginkan sampai suhu ± 300C. Kemudian diinokulasikan dengan suspensi spora kapang M.purpureus dengan konsentrasi inokulum yang terdiri atas 5%, 10%, 15% (v/b). Cawan petri ditutup dengan kertas coklat steril agar tidak terjadi kontaminasi. Fermentasi akan dilakukan pada suhu ± 300C selama 14 hari(Zubaidah & Sari, 2015) .
3.6.7 Sampling Pengambilan Substrat
Sampling pengambilan substrat tepung biji alpukat yang telah difermentasi oleh Monascus purpureus selama 14 hari dikeringkan dengan oven kering suhu 700C selama 24 jam dan dihancurkan menggunakan blender kering hingga diperoleh serbuk (Zubaidah & Sari, 2015).
3.6.8 Analisis Intensitas Pigmen
Serbuk hasil fermentasi ditimbang 0,05g yang sudah dikeringkan terlebih dahulu. Diekstrak menggunakan 10mL methanol 96%. Larutan kemudian dishaker dengan kecepatan 200 rpm selama 1 jam. Larutan selanjutnya dipisahkan dari residu dengan menggunakan kertas saring dan dibiarkan mengendap. Filtrat yang diperoleh dimasukkan dalam kuvet dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada λ 500nm. Sebelumnya spektrofotometer dikalibrasi dengan menggunakan methanol 96% sebagai blankonya(Zubaidah & Sari, 2015).
3.6.9 Analisis Warna
Serbuk angkak dimasukkan dalam plastik transparan kemudian target pembacaan a* (derajat kemerahan) dan L* (kecerahan) ditentukan, hasil pembacaan yang tertera dalam color reader dicatat(Zubaidah & Sari, 2015). 3.6.10 Uji Kelarutan Pigmen dalam Air
Dalam 4 tabung reaksi diisi dengan air masing-masing 10mL bersuhu 25ºC, 60ºC, 80ºC dan 100ºC. Masing-masing tabung tersebut ditambahkan serbuk angkak sebanyak 60mg dan divortex selama 30 detik. Larutan selanjutnya disaring menggunakan kertas saring dan filtrat yang diperoleh kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada λ 500nm (Zubaidah & Sari, 2015).
3.6.11 Uji Kestabilan Pigmen terhadap Suhu
Sebanyak 600mg serbuk angkak dilarutkan dalam 100mL air dan selanjutnya disaring. Larutan dipindahkan ke dalam 4 tabung reaksi yang masing-masing berisi 10mL larutan filtrat. Masing-masing-masing tabung selanjutnya dipanaskan dalam oven dengan suhu 25ºC, 70ºC dan 121ºC selama 1 jam dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada λ 500nm(Zubaidah & Sari, 2015).