C.4 Analisis ekspresi gen Oshox4 in silico
1.5 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4
RNAi dilakukan dengan mengintroduksi sense-intron-anti-sense Oshox4 pada tanaman padi kultivar Nipponbare. Hasil analisis Northern menunjukkan bahwa ekspresi pada tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi Oshox4 memperlihatkan penurunan transkripsi Oshox4 (Gambar 34B). Fakta ini diambil setelah membandingkan ketebalan pita transkripsi Oshox4 pada tanaman padi yang mengandung gen Oshox4 dengan pita transkripsi RNAi Oshox4 (Gambar
34A). Tanaman transgenik yang mengandung konstruksi RNAi menunjukkan pita yang lebih tipis, yang berarti ada penurunan pada level transkripsi.
Gambar 33 Pengujian ketahanan kekeringan ArabidopsisA. thaliana mengandung 35S-Oshox4. Tanaman dibiarkan tanpa air selama 21
hari. A. Kondisi tanaman pada 19 hari tanpa pemberian air (+). B. Survival tanaman tanpa pemberian air selama 21 hari. C. Presentasi kemampuan bertahan transgenik ArabidopsisA. thaliana mengandung 35S-Oshox4 (AT4-1 sampai AT4--10) dibanding
kontrol (K1 sampai K4-).
Tingkat ketahanan tanaman tahan kekeringan yang mengandung Oshox4 diuji pada tanaman model Arabidopsis A. thaliana. Transgenik Arabidopsis A. thaliana mengandung 35S-Oshox4 mampu bertahan dari kekeringan selama 21 hari (Gambar 33). Tanaman ArabidopsisA. thaliana transgenik Oshox4 pada satuan percobaan satu sekitar 90% tanaman yang masih dapat bertahan dan pada satuan percobaan delapan hanya sekitar 10% yang dapat hidup. Sementara itu pada blok pertama percobaan tanaman kontrol sekitar hampir 20% tanaman yang bertahan hidup (Gambar 33C). Kondisi kekeringan lebih dari 21 hari mengakibatkan tanaman A. rabidopsisthaliana transgenik Oshox4 tidak bisa bertahan hidup lebih lama. Setelah 30 hari dalam kondisi kekeringan tidak satupun tanaman transgenik A.rabidopsis thaliana mengandung 35S-Oshox4 yang dapat hidup.
Fenotipe transgenik A.rabidopsis thaliana 35S-Oshox4 menunjukkan penurunan tinggi yang tidak begitu nyata dibanding transgenik Arabidopsis 35S- hph (kontrol). Belum diketahui apakah pPenurunan tinggi pada tanaman A. thaliana berhubungan dengan penurunan jumlah dan elongasi sel seperti pada transgenik padi 35S-Oshox4 belum diketahui.
1.5 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4
RNAi dilakukan dengan mengintroduksi sense-intron-anti-sense Oshox4 pada tanaman padi kultivar Nipponbare. Hasil analisis Northern menunjukkan bahwa ekspresi pada tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi Oshox4 memperlihatkan penurunan transkripsi Oshox4 (Gambar 34B). Fakta ini diambil setelah membandingkan ketebalan pita transkripsi Oshox4 pada tanaman padi yang mengandung gen Oshox4 dengan pita transkripsi RNAi Oshox4 (Gambar
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Justified
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Font: I talic, Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Font: I talic, Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Font: I talic, Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Spanish (Mexico)
Formatted: Font: I talic, Spanish (Mexico)
Formatted: Spanish (Mexico)
Formatted: Font: I talic, Spanish (Mexico)
Formatted: Spanish (Mexico)
Formatted: Font: I talic
Formatted: Font: I talic
Formatted: Font: I talic
Formatted: Font: I talic
Formatted: Font: Not Bold
34A). Tanaman transgenik yang mengandung konstruksi RNAi menunjukkan pita yang lebih tipis, yang berarti ada penurunan pada level transkripsi.
Tanaman padi transgenik yang mengandung konstruksi RNAi memperlihatkan fenotipe yang tidak berbeda dengan fenotipe tanaman PO4 yang mengekspresikan gen Oshox4 pada kondisi alami. Namun fenotipe tanaman
transgenik RNAi berbeda dengan tanaman transgenik T1 35S-Oshox4
yangg mengeksperikan Oshox4 secara terus menerus. Fakta ini menyiratkan
bahwa penurunan level ekspresi Oshox4 pada tanaman padi tidak mengakibatkan
perubahan fenotipe padi.
Gambar 34 Analisis Northern tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi menggunakan konstruksi Hannibal. A. Analisis Northern tanaman mengandung konstruksi PO4 dan T1 tanaman 35S-Oshox4.
B. Analisis Northern tanaman transgenik Nipponbare mengandung konstruksi RNAi-Oshox4. Angka atau kode menunjukkan asal
kalus.
Tidak dijumpainya perubahan fenotipe yang nyata padi transgenik yang mengandung konstruksi RNAi Oshox4 menunjukkan bahwa mungkin Oshox4
tidak memiliki pengaruh pada fenotipe apabila transkripsinya levelnya diturunkan. Tanaman padi memiliki basal ekspresi Oshox4 yang berbeda-beda. Level ekspresi
dibawah basal mungkin tidak memberi pengaruh pada tanaman akan tetapi membawa pengaruh pada penurunan tingkat ketahanan terhadap cekaman kekeringan.
1.6 Analisis pola ekspresi gen Oshox4
Daerah promoter gen Oshox4 yang berukuran kira-kira 2.5 kb difusikan
dengan gen penanda GUS selanjutnya disebut dengan PO4. Gen GUS diekspresikan pada jaringan pada daerah daun, akar, lema dan palea, serta embrio. (Gambar 35A, D, G, dan I), dibuktikan dengan adanya warna biru pada daerah tersebut. Pada daun, akar, lema dan palea, gen GUS diekspresikan pada bagian jaringan pembuluh. Pada jaringan pembuluh daun, gen GUS terekspresi khusus pada jaringan pembuluh ayak (Gambar 35F). Ekspresi GUS juga tampak pada jaringan pembuluh di skutelum (Gambar 35H). Ekspresi GUS tidak muncul pada ujung akar melainkan hanya pada bagian akar yang telah berdeferensiasi (Gambar 35C). Pada embrio memperlihatkan Oshox4 terekspresi sejak dini.
Formatted: Swedish (Sweden)
Formatted: Swedish (Sweden)
Gambar 35 Lokasi ekspresi gen GUS yang dikendalikan oleh promoter Oshox4
pada jaringan tanaman padi kultivar Nipponbare. A. Jaringan daun. B. Jaringan daun setelah diberikan perlakuan cekaman kekeringan 24jam. C. Kecambah padi. D. Akar dengan potongan longitudinal. E. Akar dengan potongan transversal. F. Jaringan pembuluh pada daun. G. Lemma dan palea. H. Potongan longitudinal benih padi. I. Embrio padi. V: jaringan pembuluh. SC: skutelum. PH: pembuluh floemayak.
Tanaman yang mengandung PO4 menunjukkan penurunan ekspresi gen GUS pada saat tanaman terpapar kekeringan (Tabel 9). Gen GUS masih terdeteksi pada saat 8 jam setelah tanaman mendapat cekaman kekeringan. Setelah 24 jam cekaman kekeringan gen GUS tidak berhasil dideteksi lagi, sementara tanaman yang tidak diberi cekaman kekeringan masih mengekspresikan gen GUS.
Formatted: Dutch (Netherlands)
Formatted: Dutch (Netherlands)
Formatted: Spanish (Mexico)
Formatted: Spanish (Mexico)
Tanaman yang mengandung PO4 menunjukkan penurunan ekspresi gen GUS pada saat tanaman terpapar kekeringan (Tabel 9). Gen GUS masih terdeteksi pada saat 8 jam setelah tanaman mendapat cekaman kekeringan. Setelah 24 jam cekaman kekeringan gen GUS tidak berhasil dideteksi lagi, sementara tanaman yang tidak diberi cekaman kekeringan masih mengekspresikan gen GUS.
Tabel 9 Ekspresi GUS pada tanaman transgenik pOshox4-GUS saat terpapar
cekaman kekeringan
Lama Cekaman 1 2 1 2 Kontrol Perlakuan
0 jam + + + +
4 jam + + + +
8 jam + + + +
24 jam + + - -
48 jam + + - -
+: ada ekspresi gen GUS -: tidak ada ekspresi gen GUS
2 Hasil penelitian introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat