HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penyiapan Struktur Molekul Reseptor (PPAR-γ)
Pada tahap ini, struktur makromolekul yang digunakan diunduh
dari Protein Data Bank dengan situs http://www.rcsb.org/. Identitas protein yang dipilih adalah 2PRG yang merupakan struktur Peroxisome Proliferator-Activeted Receptor-Gamma (PPAR-γ) pada manusia (Homo sapiens) yang diperoleh dari difraksi sinar-X dengan resolusi 2,3 Å. Struktur ini diunduh dengan memilih tipe file yaitu PDB File (text) dengan format .pdb.
Struktur makromolekul PPAR-γ yang diperoleh tersebut telah terikat dengan ligan Rosiglitazon dan molekul air. Bentuk ini merupakan sisa hasil pengkristalan sebelumnya. Ligan dan molekul air dapat mengganggu proses penambatan. Pada dasarnya dengan adanya molekul air akan memediasi interaksi ligan dengan reseptor, sehingga hasil docking yang didapat semakin baik. Tetapi proses penambatan akan berlangsung lebih kompleks karena variabel persamaan-persamaan matematika docking yang perlu diselesaikan menjadi lebih banyak yang menyebabkan waktu penambatan semakin lama (Cole, Nissink, & Taylor, 2005). Selain itu, ligan yang terikat pada sisi aktif dapat menghalangi ligan lain untuk berikatan, sedangkan adanya molekul air dapat mengganggu ikatan proses penambatan yaitu kemungkinan terikatnya ligan dengan molekul air melalui ikatan hidrogen (Aditya, 2012). Struktur ini kemudian dipisahkan dari residu non standar tersebut dengan cara menghilangkannya dengan menggunakan perangkat lunak Discovery Studio, sehingga dihasilkan struktur molekul yang siap melalui tahap selanjutnya. Struktur hasil pemisahan ini disimpan dengan format .pdb.
Tahap optimasi pada Autodock Tools dilakukan untuk
28
makromolekul tersebut dapat menyesuaikan dengan lingkungan komputasi sehingga dapat di-docking. Pengoptimasian yang dilakukan yaitu penambahan atom hidrogen (protonasi) yang bertujuan untuk menyesuaikan suasana docking agar mendekati suasana pada pH sitoplasma sel (pH~7) (Drie, 2005), karena PPAR-γ termasuk reseptor inti (nuclear receptor) (Habor, 2010). Penambahan atom hidrogen yang dimaksud adalah memunculkan atom hidrogen yang ada pada struktur sehingga terlihat secara tiga dimensi yang berperan dalam interaksi dengan ligan. Atom hidrogen yang diperhitungkan adalah yang bersifat polar, karena atom ini terlibat dalam ikatan hidrogen (Yanuar, 2012). Atom hidrogen non polar tidak disertakan dalam perhitungan interaksi ligan reseptor pada penambatan molekuler sehingga perlu digabung dengan atom pengikatnya (Yanuar, 2012). Oleh karena itu dipilih pengaturan ‘Merge Non-Polar’. Pada makromolekul juga dilakukan perbaikan muatan dengan menambahankan muatan gasteiger untuk menyesuaikan dengan lingkungan docking sehingga dapat dilakukan perhitungan dengan benar (Huey, Morris, & Forli, 2012). Selain itu diperlukan pengaturan grid box untuk menentukan ruang tambat ligan yang akan di-docking. Ruang tambat ligan ditentukan dengan merujuk kepada penelitian terdahulu berdasarkan ligan yang sudah tertambat dengan makromolekul protein pada saat diunduh, yaitu dalam hal ini rosiglitazon. Pengaturan pada grid box yang digunakan meliputi center_x = 52.734, center_y = -3.774, center_z = 34.258, size_x = 28, size_y = 28, size_z = 28, dan spacing (angstrom) = 1 (Lampiran 2) (Fikry, 2014). File makromolekul maka disimpan dalam format .pdbqt.
4.2 Penyiapan Struktur Ligan
Ligan Rosiglitazon yang digunakan diunduh dari Pubchem dengan
situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf dan dipilih struktur 3D dan diubah menjadi .pdb menggunakan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com), sementara itu ligan uji yaitu ligan etil p metoksisinamat, caffeamide dan ligan amidasi etil p-metoksisinamat, dibuat dengan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com) dengan format .pdb dalam bentuk 3D dengan tipe fine with hydrogenize. Daftar ligan yang ditambatkan terdapat pada Tabel 4.1.
Ligan yang digunakan untuk penambatan molekul pada PPARγ terdiri dari beberapa bagian. Rosiglitazon digunakan sebagai senyawa pembanding. Caffeamide merupakan senyawa turunan asam sinamat dengan ikatan amida yang yang telah dilakukan uji antidiabetes sebelumnya secara in vivo. Senyawa uji yang digunakan adalah senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dan etil p-p-metoksisinamat. Selain itu, digunakan senyawa uji berupa modifikasi pada cincin aromatik dari ligan amidasi etil p-metoksisinamat yang memiliki afinitas terbaik.
Pada pengoimasian ligan dilakukan penambahan muatan gasteiger
dengan menggunakan Autodock Tools. Muatan gasteiger ini secara otomatis akan ditambahkan pada ligan ketika dibuka dengan Autodock Tools. Selain itu pada ligan juga secara otomatis dilakukan merge non polar sehingga hanya atom hidrogen polar yang muncul. Semua file ligan maka disimpan dalam format .pdbqt.
Tabel 4.1. Daftar ligan yang ditambatkan
Ligan Nama Ligan
Senyawa pembanding
Rosiglitazon
Senyawa turunan asam sinamat lain
Caffeamide
Senyawa etil p-metoksisinamat dan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat Ethyl p-methoxycinnamate P-methoxycinnamoylamine P-methoxycinnamoyl methylamine P-methoxycinnamoyl ethylamine P-methoxycinnamoyl diaminomethanal
P-methoxycinnamoyl N-ethanolamine P-methoxycinnamoyl N,N-ethanolamine P-methoxycinnamoyl piperidine P-methoxycinnamoyl cyclohexylamine P-methoxycinnamoyl phenylamine P-methoxycinnamoyl dopamine P-methoxycinnamoyl phenylethylamine P-methoxycinnamoyl Tryptamine
Senyawa modifikasi pada cincin aromatik p-methoxycinnamoyl triptamine Cinnamoyl tryptamine
P-hydroxycinnamoyl Tryptamine
4.3 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina
Setelah penyiapan protein dan ligan yang akan di-docking selesai, maka dapat dilakukan penambatan molekul dengan Autodock Vina. Hal pertama kali dilakukan pada tahap ini adalah menyalin file protein dan ligan berformat .pdbqt ke dalam folder vina pada Local Disk (C:). Kemudian dibuat konfigurasi vina yang diketik pada notepad (Lampiran 2) dan disimpan dengan nama ‘conf.txt’ dalam folder vina. Konfigurasi vina terdiri dari penulisan nama reseptor dan ligan, output, dan gribox. Penulisn nama reseptor dan ligan pada notepad harus sama dengan nama file pada folder vina. Output ‘out’ merupakan hasil dari proses docking tersebut dibuat dengan nama ‘out.pdbqt.’ Sedangkan center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z adalah grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya pada protein reseptor. Setelah pengaturan file konfigurasi notepad selesai, maka proses docking dengan vina dapat dijalankan. Vina dijalankan melalui perintah Command prompt. Dalam Command prompt, masuk ke dalam Local Disk (C:) dengan perintah ‘cd..’ , dilanjutkan dengan perintah ‘cd vina’ untuk masuk ke dalam folder vina. Kemudiann proses docking dapat dijalankan perintah sebagai berikut:
Waktu yang digunakan selama proses docking ini dipengaruhi oleh spesifikasi komputer yang digunakan dan juga ligan yang ditambatkan. Tetapi hal ini tidak terlalu mempengaruhi keakuratan hasil yang diperoleh. Proses penambatan molekul dengan Autodock Vina dapat meningkatkan akurasi dari prediksi mode ikatan bila dibandingkan dengan Autodock 4. Selain itu, vina dapat mengambil keuntungan dari multiple CPU atau CPU core dalam sistem komputer untuk memperpendek waktu running secara signifikan (Trott & Olson, 2010).
Untuk input dan output-nya, vina menggunakan format file struktur molekul yang sama dengan Autodock yaitu pdbqt. File pdbqt. Setelah proses docking selesai, maka muncul 2 file baru dalam folder vina, yaitu ‘log.txt’ dan ‘out.pdbqt’. ‘log.txt’ berisikan nilai afinitas ikatan dan root mean square deviation (RMSD) dari hasil docking. Sedangkan ‘out.pdbqt’ merupakan konformasi dari ligan-ligan yang di-docking-kan. Hasil ini dibuka dengan Autodocktools, LigPlus dan Pymol untuk melihat posisi dan orientasi dari ligan pada protein dan juga asam amino-asam amino yang terikat pada ligan serta jarak ikatan ligan dengan asam amino.