UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
STUDI PENAMBATAN MOLEKUL
SENYAWA-SENYAWA
AMIDASI ETIL PARA METOKISINAMAT
PADA PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED
RECEPTOR-GAMMA (PPARγ)
SKRIPSI
FITRIA APRIANI
1111102000071
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JULI 2015
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
STUDI PENAMBATAN MOLEKUL
SENYAWA-SENYAWA
AMIDASI ETIL PARA METOKISINAMAT
PADA PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED
RECEPTOR-GAMMA (PPARγ)
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi
FITRIA APRIANI
1111102000071
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
iv Nama : Fitria Apriani Program Studi : Farmasi
Judul : Studi Penambatan Molekul Senyawa-Senyawa Amidasi Etil Para Metoksisinamat Pada Peroxisome
Proliferator-Activated Receptor- Gamma (PPARγ)
Ikatan amida pada turunan asam sinamat terbukti menjadikan lebih tahan terhadap hidrolisis dan dapat menurunkan konsentrasi glukosa plasma pada tikus setelah diinduksi dengan streptozosin. Salah satu reseptor yang berperan dalam pengobatan diabetes adalah Peroxisome Proliferator-Activated Receptor - Gamma (PPARγ) yang bertanggung jawab terhadap sensitisasi insulin dalam jaringan adiposa. Penelitian ini bertujuan menganalisa interaksi senyawa amidasi etil p-metoksisinamat (EPMS) dengan PPARγ. Metode penelitian dengan penambatan molekul atau secara in silico dipilih karena waktu penelitian yang lebih singkat dan biaya yang lebih murah dibandingkan dengan metode in vitro maupun in vivo. Perangkat lunak yang digunakan yaitu Autodock Vina yang merupakan suatu program yang dapat menambatkan molekul ligan pada makromolekul reseptor. Kemudian divisualisasikan menggunakan Autodock Tools, LigPlus dan PyMOL serta dilakukan analisa Lipinski’s Rule of Five. Rosiglitazon sebagai antidiabetes yang memiliki aktivitas terhadap PPARγ digunakan sebagai standar. Hasilnya menunjukkan bahwa afinitas senyawa-senyawa amidasi etil p-metoksisinamat semakin baik pada penambahan amina dengan alkil rantai panjang, siklik dan aril dengan rentang energi ikatan antara -6,2 kkal/mol sampai -9,3 kkal/mol. Sedangkan energi ikatan rosiglitazon sebesar -8,9 kkal/mol. Senyawa p-methoxycinnamoyil tryptamine memiliki afinitas terbaik dengan nilai energi ikatan -9,3 kkal/mol, sehingga berpotensi sebagai antidiabetes.
Name : Fitria Apriani Major : Pharmacy
Title : Molecular Docking Study Of Amidation Ethyl P-Methoxycinnamate Compounds to Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma
(PPARγ)
Amide bond in cinnamic acid derivatives proved to make it more resistant to hydrolysis and can decrease the plasma glucose concentration in rats after induced by streptozosin. One receptor that plays a role in the treatment of diabetes is Peroxisome Proliferator Activated Receptor-Gamma (PPARγ) which is responsible for the sensitization of insulin in adipose tissue. This study aims to analyze the interaction of amidation compound ethyl p-methoxycinnamate (EPMS) with PPARγ. Methods of research with a molecular docking or in silico been shorter research time and costs cheaper than the method of in vitro and in vivo. The software used is Autodock Vina which is a program that allows docking of molecular ligand to receptor macromolecules. Then visualized using Autodock Tools, LigPlus and PyMOL, as well as analysis Lipinski's Rule of Five. Rosiglitazone as antidiabetic PPARγ activity to be used as a standard. The result showed that the affinity of the compounds amidation ethyl p-methoxycinnamate getting better on the addition of amines with a long chain alkyl, cyclic and aryl with the bond energy range between -6.2 kcal / mol to -9.3 kcal / mol. Whereas rosiglitazone bond energy of -8.9 kcal / mol. P-methoxycinnamoyil tryptamine compounds having the best affinity with the bond energy value -9.3 kcal / mol, potentially as an antidiabetic.
vi
Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT., atas segala rahmat, karunia, dan hidayah-Nya yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul “Studi Penambatan Senyawa-Senyawa Amidasi Etil Para Metoksisinamat Sebagai Antidiabetes”. Shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada junjungan Nabi Muhammad SAW., dan para sahabat serta pengikutnya.
Dalam penyelesaian penelitian dan penulisan skripsi ini penulis banyak menerima bantuan maupun dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini dengan segala kerendahan hati, penulis ingin memberikan penghargaan yang setinggi-tingginya dan menyampaikan terima kasih yang tulus kepada :
1. Bapak Drs. Arif Sumantri, M.Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
2. Bapak Yardi, Ph.D., Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
3. Bapak Supandi, M.Si., Apt., dan Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt., sebagai dosen pembimbing I dan II yang dengan kesabarannya telah memberikan waktu, ilmu, arahan dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan skripsi ini
4. Ibu Dr. Dra. H. Delina Hasan, M.Kes., Apt., selaku penasehat akademik yang telah membimbing penulis selama masa perkuliahan.
5. Ayahanda tercinta Nang Supriadi dan Ibunda Ida Rosidah yang senantiasa selalu memberikan doa, kasih sayang, dan dukungan baik moral maupun materi kepada penulis selama ini
6. Kakak Nadzifah Yuliani senantiasa memberikan dukungan dan motivasi kepada penulis.
7. Bapak dan Ibu Dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan hingga penulis dapat menyelesaikan studi di Program Studi Farmasi
8. Teman seperjuangan penulis Eko Wahyudi, Fathiyah atas kebersamaan, motivasi dan bantuan selama penelitian hingga terselesaikannya skripsi ini.
9. Sahabat-sahabat Fio Noviany, Brasti Eka Pratiwi, Astri Dwi Zahrina, Sry Wardiyah, Hurhafiza, Maharani Pratiwi, Rianisa Karunia Dewi, dan Wina Oktaviyani yang tak pernah bosan memberikan dukungan, masukan, dan semangat bagi penulis dalam penyelesaian skripsi ini.
10. Teman-teman Farmasi Angkatan 2011 atas segala kebersamaanya, semangat, dan bantuan selama dibangku perkuliahan hingga selesai pengerjaan skripsi ini.
11. Dan kepada semua pihak yang telah membantu selama penelitian dan penulisan skripsi baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.
Semoga segala bantuan yang telah diberikan kepada penulis mendapatkan balasan dari Allah SWT.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Untuk itu penulis mengaharapkan masukan berupa kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kita semua.
Jakarta, Juli 2015
Penulis
Halaman
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ...ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
ABSTRAK ... iv
ABSTRACT ... v
KATA PENGANTAR ... vi
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH ... viii
DAFTAR ISI ... ix
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
DAFTAR ISTILAH ... xv BAB 1 PENDAHULUAN ... 1 1.1. Latar Belakang ... 1 1.2. Rumusan Masalah ... 3 1.3. Tujuan Penelitian ... 3 1.4. Manfaat Penelitian ... 3 1.5. Hipotesis ... 4
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ... 5
2.1. Diabetes Mellitus ... 5
2.2. Antidiabetik Oral Golongan Tiazolidindion ... 6
2.3. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ) ... 7
2.4. Etil Para Metosksisinamat ... 9
2.5. Ester ... 10
2.6. Amida dan Sintesis Amida ... 11
x
2.8.3. IkatanVan der Waals ... 16
2.8.4. Ikatan Dipol-Dipol ... 16
2.8.5. Ikatan Kovalen ... 16
2.9. Penambatan Molekul (Molecular Docking) ... 17
2.10. Lipinski’s Rule of Five ... 19
2.11. MarvinSketch ... 20
2.12. Protein Data Bank... 20
2.13. PubChem ... 21
2.14. Discovery Studio 3.5 Visualizer... 21
2.15. Autodock ... 22
2.16. Autodock Vina... 22
2.17. Pymol ... 22
BAB 3 METODE PENELITIAN ... 23
3.1. Waktu Dan Tempat Penelitian ... 23
3.2. Alat ... 23
3.2.1 Perangkat Lunak ... 23
3.2.2 Perangkat Keras ... 23
3.3 Bahan ... 23
3.3.2. Struktur Tiga Dimensi PPAR-γ ... 23
3.3.2. Struktur Tiga Dimensi Ligan ... 24
3.4. Prosedur Kerja ... 24
3.4.1. Penyiapan Struktur PPAR-γ ... 24
3.4.2. Penyiapan Struktur Ligan ... 25
3.4. Penambatan Dengan Autodock Vina ... 25
3.4. Analisa Dan Visualisasi Penambatan Molekul ... 25
3.4. Analisa Lipinski’s Rule of Five ... 26
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 27
4.1. Penyiapan Struktur PPAR-γ ... 27
4.2. Penyiapan Struktur Ligan ... 29
3.4. Penambatan Dengan Autodock Vina ... 32
3.4. Analisa Dan Visualisasi Penambatan Molekul ... 33
5.2. Saran ... 51 DAFTAR PUSTAKA ... 52 LAMPIRAN ... 56
xii
Halaman
Tabel 4.1. Daftar ligan yang ditambatkan ... 30
Tabel 4.2. Nilai ΔGbind ligan ... 35
Tabel 4.3. Ikatan ligan dengan residu protein ... 44
Tabel 4.5. Interaksi ligan dengan protein ... 45
Tabel 4.6. Keterangan warna pada gambar Autodock Tools, LigPlus, dan PyMOL ... 47
Halaman
Gambar 2.1. Struktur obat-obat tiazolidindion ... 6
Gambar 2.2. Struktur dan cara regulasi gen PPAR Gamma ... 8
Gambar 2.3. Struktur umum senyawa etil para metoksisinamat ... 10
Gambar 2.4. Struktur umum senyawa ester ... 10
Gambar 2.5. Reaksi pembuatan amida ... 11
Gambar 2.6. Struktur CAPA dan CAPE ... 12
Gambar 2.7. Struktur caffamide ... 12
Gambar 2.8. Hidrofobik, asam amino alifatik ... 13
Gambar 2.9. Hidrofobik, asam amino aromatik ... 13
Gambar 2.10. Polar, asam amino bermuatan ... 14
Gambar 2.11. Polar, asam amino tidak bermuatan ... 14
Gambar 2.12. Konsep dasar penambatan molekul ... 18
Gambar 4.1. Struktur 2PRG ... 28
Gambar 4.2. Visualisasi interaksi rosiglitazon dengan molekul reseptor (PPARγ) ... 39
Gambar 4.3. Visualisasi interaksi p-methoxycinnamoyl tryptamine dengan molekul reseptor (PPARγ) ... 40
xiv
Halaman Lampiran 1. Alur Penelitian ... 57 Lampiran 2. Prosedur kerja penambatan molekul
dengan Autodock Vina ... 58 Lampiran 3. Data hasil docking Autodock Vina ... 82 Lampiran 4. Visualisai ligan dan molekul reseptor (PPARγ) ... 87
AMP : Adenosin Mono Phosphat AMPK : AMP-activated protein kinase ATP : Adenosine Triphosphate CAPA : Caffeic Acid Phenethyl Amide CAPE : Caffeic Acid Phenethyl Ester DM : Diabetes Mellitus
EPMS : Etil para metoksisinamat/ Ethyl para Methoxycinnamate GLUT4 : Reseptor Glukosa Transporter 4
Grid Box : Kotak pencarian tempat ikatan ligan dengan reseptor
Kkal/mol : Kilo kalori per mol
KATP : ATP-sensitive potassium
Molar Refractivity : Pengukuran total polarizabilitas satu mol senyawa tergantung temperatur, indeks refraksi, dan tekanan Molecular Docking : Penambatan Molekul
pdb : Protein Data Bank
PPAR-γ : Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma RMSD : Root Mean Square Deviation
TZD : Tiazolidindion
ΔGbind : Energi yang dibutuhkan ligan untuk berinteraksi (ikatan) dengan reseptor pada binding site
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Diabetes Mellitus (DM) merupakan salah satu kelompok penyakit metabolik yang ditandai oleh hiperglikemia (kadar gula darah meningkat) karena gangguan sekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya (ADA, 2014). Keadaan Hiperglikemia kronis dari diabetes berhubungan dengan gangguan fungsi dan kegagalan berbagai organ, terutama mata, ginjal, saraf, jantung, dan pembuluh darah (ADA, 2014).
Data dari WHO pada tahun 2013 menunjukkan bahwa 347 juta orang di seluruh dunia menderita diabetes. Indonesia merupakan Negara ke-7 dengan jumlah penderita diabetes terbanyak di dunia. Sekitar ke-7,6 juta penduduk Indonesia menderita diabetes, sementara 12,6 juta orang lainnya dalam kondisi prediabetes. Pada tahun 2030, diperkirakan populasi penderita diabetes di Indonesia mencapai angka 11,8 juta, dengan persentase pertumbuhan 6 % per tahun yang jauh melebihi pertumbuhan penduduk Indonesia secara keseluruhan (Novo Nordisk, 2013).
Pengobatan farmakoterapi untuk diabetes terdiri dari obat antidiabetik oral dan/atau insulin. Obat-obat antidiabetik oral ini terdiri dari beberapa golongan berdasarkan mekanisme kerjanya, yaitu sulfonilurea (meningkatkan sekresi insulin), biguanid (mengurangi glukoneogenesis hepatik, meningkatkan sensitifitas insulin), tiazolidindion (meningkatkan sensitivitas insulin), penghambat α-glukosidase, dan penghambat glucagon-like peptide-1 (GLP-1). Namun, penggunaan antidiabetes oral terbatas karena efek samping yang merugikan termasuk reaksi hematologikal, kutan dan gastrointestinal, koma, hipoglikemik, gangguan fungsi hati dan ginjal (Alarcon,
et al., 2000). Untuk mengatasi permasalahan itu, diperlukan adanya penelitian untuk menemukan senyawa obat baru yang memiliki efek antidiabetes dengan efek samping yang lebih ringan dan efektivitas yang jauh lebih baik.
Salah satu kondisi yang terjadi pada diabetes mellitus yaitu sensitivitas insulin yang terganggu. Hal ini terjadi pada diabetes mellitus tipe 2. Reseptor yang berperan terhadap sensitisasi insulin ini yaitu PPARγ. Antidiabetes dengan mekanisme kerja berikatan pada Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma (PPARγ) diantarnyada adalah tiazolidindion (rosiglitazon dan pioglitazon). Tiazolidindion bekerja pada reseptor tersebut menyebabkan terjadinya peningkatan perangsangan insulin oleh reseptor glukosa transporter 4 (GLUT4) dan sintesis glikogen yang menyebabkan peningkatan sinyal insulin dan sensitifitas insulin (Coman & Socaciu, 2012).
Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu senyawa yang diperoleh dari rimpang kencur (Kaemferia galanga L.), dan telah dilaporkan memiliki beberapa manfaat diantaranya yaitu sebagai antiinflamasi, antimikroba, antituberkulosis, antikanker, dan antidibaetes.
Chowdhury et al (2014) melaporkan bahwa ekstrak kencur dengan dosis 200 mg/kg BB yang diduga mengandung senyawa etil p-metoksisinamat
dapat menghambat peningkatan kadar glukosa pada tikus setelah diinduksi dengan streptozosin.
Beberapa senyawa turunan asam sinamat yaitu caffeic acid phenethyl amide (CAPA) yang berasal dari caffeic acid phenethyl ester (CAPE), serta caffeamide memiliki ikatan amida dengan aktivitas sebagai antidiabetes. CAPA dapat menurunkan kadar glukosa plasma pada dosis oral 0,5 mg/kg dan caffeamide pada dosis 40 mg/kg untuk tikus. Adanya ikatan amida pada CAPA menjadikan lebih tahan terhadap hidrolisis, menurunkan konsentrasi glukosa plasma dan efek terhadap dilatasi pada tikus normal dan diabetes, selain itu ditemukan lebih stabil dalam plasma dibandingkan CAPE secara in vivo (Yang, 2012). CAPA dilaporkan memiliki aktivitas menghambat KATP channels dan meningkatkan GLUT4
(glucose trasporter 4), sementara Caffeamide dilaporkan memiliki aktivitas
dalam forforilasi AMPK (AMP-activated protein kinase) dan
berperan dan GLUT4 berkaitan dengan PPARγ dalam sensitisasi insulin. Selain itu telah dilaporkan pula bahwa asam sinamat dan Klorogenat dapat meningkatkan ekspresi PPARγ (Prabhakar, 2011). Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efektivitas antidiabetes etil p-metoksisisnamat yang dimodifikasi secara amidasi dengan target PPARγ. Pada penelitian ini menggunakan senyawa pembanding yaitu Rosiglitazon yang merupakan antidiabetes golongan tiazolidindion yang memiliki aktivitas terhadap PPARγ. Selain itu, Rosiglitazon juga memiliki kemiripan struktur karena adanya kemiripan struktur dengan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat.
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui interaksi antara PPARγ dan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat yang dapat ditentukan dengan metode penambatan molekul (molecular docking) atau secara in silico. Metode ini dipilih karena membutuhkan waktu penelitian yang lebih singkat dan biaya yang lebih murah dibandingkan dengan metode in vitro maupun in vivo. Sintesis tradisional dari senyawa obat baru mengunakan kombinasi kimiawi dan screening merupakan proses yang membutuhkan biaya besar dan waktu yang lama, sedangkan screening database molekul dari senyawa model dapat dijadikan metode alternatif dalam desain obat baru (Ekins et al., 2007).
1.2 Rumusan Masalah
Apakah senyawa-senyawa amidasi etil p-metoksisinamat memiliki interaksi yang baik terhadap Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma (PPAR-γ) ?
1.3 Tujuan dan Sasaran Penelitian
Menganalisa interaksi penambatan molekul senyawa-senyawa amidasi etil p-metoksisinamat pada Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma (PPAR-γ).
1.4 Manfaat Penelitian
Memberikan data perbandingan interaksi senyawa amidasi etil p-metoksisinamat terhadap Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma (PPAR-γ) untuk membantu dalam perancangan obat antidiabetes baru.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Diabetes Mellitus
Diabetes Mellitus (DM) merupakan salah satu kelompok penyakit metabolik yang ditandai oleh hiperglikemia (kadar gula darah meningkat) karena gangguan sekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya (ADA, 2014). Fungsi insulin adalah untuk mengatur kadar normal glukosa darah (Wilcox, 2005). Keadaan Hiperglikemia kronis dari diabetes berhubungan dengan kerusakan jangka panjang, gangguan fungsi dan kegagalan berbagai organ, terutama mata, ginjal, saraf, jantung, dan pembuluh darah (ADA, 2014).
Keadaan ini juga dapat menyebabkan komplikasi kronik mikrovaskular, makrovaskular, dan neuropatik (Schwinghammer,2009). Kadar glukosa puasa pada pasien diabetes adalah > 126 mg/dl atau postprandial > 200 mg/dl atau glukosa sewaktu > 200 mg/dl (Suherman, 2009).
Menurut American Diabetes Association (ADA,2014), klasifikasi diabetes meliputi empat kelas klinis :
a. Diabetes Mellitus tipe 1
Hasil dari kehancuran sel β pankreas, biasanya menyebabkan defisiensi insulin yang absolut.
b. Diabetes Mellitus tipe 2
Hasil dari gangguan sekresi insulin yang progresif menjadi latar belakang terjadinya resistensi insulin.
c. Diabetes tipe spesifik lain
Misalnya : gangguan genetik pada fungsi sel β, gangguan genetik pada kerja insulin, penyakit eksokrin pankreas (seperti cystic fibrosis), dan yang dipicu oleh obat atau bahan kimia (seperti dalam pengobatan HIV/AIDS atau setelah transplantasi organ).
d. Gestational Diabetes
Diabetes melitus gestasional (gestational diabetes melitus [GDM]), adalah diabetes yang terjadi pada wanita hamil yang sebelumnya tidak mengidap diabetes (Corwin, 2009).
2.2 Antidiabetik Oral Golongan Tiazolidindion
Tiazolidindion (TZD) adalah golongan obat yang mensensitisasi insulin yang merupakan agonis untuk reseptor nuklir Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ). TZD yang pertama, troglitazon (Rezulin©), telah disetujui untuk digunakan di Amerika Serikat pada tahun 1997, segera diikuti oleh pioglitazon (Actos©) dan rosiglitazon (Avandia©). Mekanisme yang tepat dimana TZD bertindak belum jelas digambarkan, namun data menunjukkan bahwa TZD meningkatkan sensitivitas insulin oleh efek langsung dan tidak langsung pada jaringan adiposa dan otot. Troglitazon telah dihapus dari pasar pada tahun 2000 karena hepatotoksisitas, tetapi pioglitazon dan rosiglitazon tetap dipasarkan (DiStefano J.K & Watanabe R. M, 2010).
TZD bekerja dengan mengikat PPAR-γ, yang terutama terletak (DiStefano J.K & Watanabe R. M, 2010)
dari gen yang memetabolisme glukosa, menghasilkan sensitivitas insulin pada otot, hati, dan jaringan lemak secara tidak langsung. TZD menyebabkan preadiposit untuk berdiferensiasi menjadi sel-sel lemak matang pada penyimpanan lemak subkutan. Sel-sel lemak kecil lebih sensitif terhad ap insulin dan lebih mampu menyimpan asam - asam lemak bebas. Hasilnya adalah fluks asam-asam lemak bebas keluar dari plasma, lemak viseral, dan hati menjadi lemak subkutan, jaringan penyimpanan yang kurang resistensi terhadap insulin. Lemak yang dihasilkan dari otot intraseluler yang berkontribusi terhadap resistensi insulin juga menurun. TZD juga mempengaruhi adipokin, (misalnya, angiotensinogen, jaringan necrosis factor - α, interleukin - 6, penghambat aktifator plasminogen-1), yang secara positif dapat mempengaruhi sensitivitas insulin, fungsi endotel, dan peradangan. Dari catatan khusus, adiponektin berkurang pada obesitas dan / atau diabetes tetapi meningkat dengan terapi TZD, yang meningkatkan fungsi endotel, sensitivitas insulin, dan memiliki efek antiinflamasi yang kuat (DiPiro et al, 2008).
2.3 Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ)
Peroxisome proliferator – activated receptors (PPARs) termasuk ke dalam kelompok reseptor inti (nuclear receptor), yang didefinisikan sebagai faktor transkripsi yang diaktifkan oleh ligan (beberapa asam lemak dan/atau metabolit lipidnya). PPAR memiliki peran dalam mengontrol metabolisme lipid dan lipoprotein, homeostasis glukosa, serta diferensiasi sel. Akhir-akhir ini ditemukan bahwa PPAR juga mengganggu perkembangan proses tumor, mengontrol respon inflamasi, dan penyakit-penyakit terkait (Habor, 2010).
Reseptor inti dari kelompok Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) merupakan salah satu yang berperan dalam pengaturan diferensiasi adiposit, pada lipid dan homeostasis glukosa. PPARγ berperan dalam proses sensitisasi insulin, dan digunakan sebagai target terapi diabetes mellitus tipe 2. Tiazolidindion bekerja pada reseptor tersebut
menyebabkan terjadinya peningkatan perangsangan insulin oleh reseptor Glukosa transporter 4 (GLUT4) dan sintesis glikogen yang menyebabkan peningkatan sinyal insulin dan sensitifitas insulin (Coman & Socaciu, 2012). Ada tiga tipe PPAR, yaitu alfa (α), beta (β), gamma (γ), yang dikodekan pada berbagai jenis gen dan mempunya jaringan distribusi yang berbeda-beda. Diaktifkan oleh ligan yang berkonsolidasi dengan PPARs membentuk heterodimer dengan bantuan reseptor 9-cis RXR asam retinoat dan memperbaiki elemen respon spesifik pada tingkat promotor gen target. Elemen respon ini pada umumnya dibentuk melalui pengulangan langsung heksametrik yang muncul (dikenal sebagai reseptor inti, yang dibedakan oleh nukleotida) (Habor, 2010).
PPARs membentuk heterodimer dengan reseptor retinoid X (RXR) yang meningkatkan ikatan DNA dan kemudian mengatur transkripsi DNA dengan mengikat urutan nukleotida yang ditentukan (unsur respon proliferator Peroksisom, PPRE) di daerah promotor gen target. Beberapa kofaktor (koaktifator atau korepresor) memediasi kemampuan reseptor inti untuk merangsang atau menekan proses transkripsi. Ketika jenis mutan dari PPAR terikat dengan RXR, korepresor membentuk kompleks yang menempel pada heterodimer tersebut. Kemudian, faktor transkripsi basal (BTF) tidak terikat. Ketika jenis normal PPAR terikat dengan RXR, koaktifator membentuk kompleks yang menempel pada heterodimer tersebut. Setelah itu, BTF tersebut terikat dan banyak fungsi yang dijalankan (Sohn et al, 2010).
Beberapa asam lemak mampu mengikat dan mengaktifasi PPARs. Asam linoleat merupakan salah satu diantara banyaknya aktifator dan dapat mengaktifasi 3 tipe PPARs. Hal ini telah dibuktikan bahwa eikosanoid dan prostaglandin (PG) tertentu dari seri A, D, J merupakan aktivator PPARs (Habor, 2010).
Golongan tiazolidindion (TZD) merupakan ligan bagi PPAR-γ yang menyebabkan aktifitas transkripsi dapat terstimulasi, sehingga dapat disimpulkan bahwa PPAR-γ terlibat dalam mekanisme resistensi insulin. Hasil riset secara jelas menunjukkan bahwa molekul golongan turunan TZD (troglitazon, pioglitazon, rosiglitazon), mampu memperbaiki resistensi insulin in vivo secara signifikan. Ada hipotesis yang mengatakan bahwa aktifasi PPAR-γ melibatkan diferensiasi adiposit dan penyimpanan asam lemak dalam jaringan adiposa (mengurangi sirkulan lipid, yang menyebabkan otot lebih sensitif terhadap insulin) (Habor, 2010).
PPAR-γ yang aktif yang bekerja pada jaringan adiposa dan makrofag memicu diferensiasi sel lemak dan mengatur penyimpanan asam lemak dan metabolisme glukosa dengan mempengaruhi gen terkait. Oleh karena itu, PPAR-γ merupakan target obat utama untuk pengobatan diabetes mellitus tipe 2. Meskipun beberapa molekul alami seperti eikosanoids dan asam lemak tak jenuh ganda yang mampu mengaktifkan reseptor ini, ligan buatan memiliki lebih banyak potensi sebagai agonis dari PPAR (Sohn et al, 2010).
2.4 Etil Para Metoksisinamat
Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu senyawa yang diperoleh dari rimpang kencur (Kaemferia galanga L.), termasuk dalam golongan senyawa ester yang mengandung senyawa benzena dan senyawa metoksi yang bersifat non polar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar (Firdausi, 2009). EPMS telah dilaporkan mempunyai anti-tuberkolosis, nematisidal, penolak nyamuk, larvasidal, antineoplastic dan potensi anti microbial (Umar et al, 2014).
Chowdhury et al (2014) melaporkan bahwa ekstrak kencur dosis 200 mg/kg BB yang diduga mengandung EPMS diberikan pada tikus dapat menghambat peningkatan kadar glukosa setelah diinduksi dengan streptozosin.
Gambar 2.3. Struktur umum senyawa etil para metoksisinamat
2.5 Ester
Ester adalah suatu senyawa organik yang terbentuk melalui pergantian satu (atau lebih) atom hidrogen pada gugus karboksil dengan suatu gugus organik. Kebanyakan ester tersebar luas pada semua senyawa alam. Sebagai contoh, metil butanoat ditemukan pada minyak nanas dan isopentil asetat merupakan senyawa pokok minyak pisang (McMurry, 2008). Penamaan ester terdiri dari dua kata, kata pertama adalah nama gugus alkil yang terikat pada oksigen ester sedangkan kata kedua berasal dari nama asam karboksilatnya, dengan membuang kata asam (Inggris: -ic acid menjadi –ate).
IUPAC : Asam propanoat
Trivial : Asam propionat
O 2.6 Amida dan Sintesis Amida
Suatu amida ialah suatu senyawa yang mempunyai nitrogen trivalent yang terikat pada suatu gugus karbonil. Suatu amida diberi nama dari asam karboksilat induknya, dengan mengubah imbuhan asam -oat (atau –at) menjadi –amida.
Amida disintesis dari derivat asam karboksilat dan amonia atau amina yang sesuai. Reaksi pembentukan sebagai berikut:
Gambar 2.5. Reaksi pembuatan amida (Fessenden & Fessenden, 1999)
Senyawa sinamida telah banyak disintesa, dan kemudian dilakukan uji kanker, yaitu 2-metil sinamida yang diisolasi dari Streptomyces griseoliteus, menunjukkan efek anti-invasif atau antimetastatik yag signifikan (Welch, 1993). Hubungan struktur hasil mofidikasi etil p-metoksisinamat terhadap antiinflamasi menujukkan pergantian gugus fungsi ester menjadi amida dapat meningkatkan aktivitas antiinflamasi (Hardiansyah, 2014). Beberapa senyawa turunan asam sinamat lain yaitu caffeic acid phenethyl amide (CAPA) yang berasal dari caffeic acid phenethyl ester (CAPE), serta caffeamide memiliki ikatan amida yang dengan aktivitas sebagai antidiabetes. Adanya ikatan amida pada CAPA
R’2NH R’2NH R’2NH RCNR’2 Asil Klorida Anhidrida asam Ester
menjadikan lebih tahan terhadap hidrolisis, menurunkan konsentrasi glukosa plasma dan efek terhadap dilatasi pada tikus normal dan diabetes, selain itu ditemukan lebih stabil dalam plasma dibandingkan CAPE secara in vivo
(Yang, 2012). Caffeamide dilaporkan memiliki aktivitas dalam
meningkatkan GLUT4 (glucose trasporter 4) di hati dan otot (Kuo, 2014).
Gambar 2.6. Struktur CAPA dan CAPE (Yi-Jin Ho et al, 2013)
Gambar 2.7. Struktur caffeamide (Kuo, 2014)
2.7 Protein dan Asam Amino
Asam amino merupakan suatu susunan protein. Protein dari semua spesies, dari bakteri sampai manusia, terdiri dari kumpulan dari 20 asam amino standar yang sama. Sembilan belas di antaranya adalah asam α-amino
dengan gugus amino primer (-NH3+) dan asam karboksilat (karboksil;
-COOH) yang terikat pada atom karbon pusat, yang disebut atom α-karbon (Cα) karena berdekatan dengan gugus karboksil dan juga terikat pada atom Cα yaitu atom hidrogen dan variabel rantai samping atau gugus 'R'. Nama-nama asam amino sering disingkat menjadi tiga huruf atau satu huruf. Contoh: prolin disingkat Pro atau P (Hames & Hooper, 2005).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Ada 20 asam amino standar yang hanya berbeda dalam struktur rantai samping atau gugus 'R'. Asam amino tersebut dapat dibagi menjadi kelompok-kelompok kecil berdasarkan kesamaan dalam sifat-sifat rantai sampingnya.
Gambar 2.8. Hidrofobik, asam amino alifatik (Hammes & Hopper, 2005)
Gambar 2.9. Hidrofobik, asam amino aromatik (Hammes & Hopper, 2005)
Gambar 2.10. Polar, asam amino bermuatan (Hammes & Hopper, 2005)
Gambar 2.11. Polar, asam amino tak bermuatan (Hammes & Hopper, 2005)
Urutan linear asam amino yang bergabung melalui ikatan peptida disebut struktur primer protein. Posisi ikatan kovalen disulfida antara residu sistein juga termasuk dalam struktur primer. Gabungan antara dua struktur primer membentuk struktur protein sekunder. Struktur sekunder protein ini mengacu pada lipatan teratur daerah dari rantai polipeptida. Dua jenis struktur sekunder adalah α-helix dan β-pleated sheet. α-helix berbentuk silinder, rangkaian heliks asam amino seperti batang dalam rantai polipeptida yang ditahan oleh ikatan hidrogen yang sejajar dengan sumbu helix. Dalam β-pleated sheet, ikatan hidrogen terbentuk antara bagian yang berdekatan dari polipeptida yang baik berjalan di arah yang sama (β-pleated
sheet paralel) atau dalam arah yang berlawanan (β-pleated sheet antiparalel). β- membalikkan arah rantai polipeptida dan seringkali ditemukan terhubung
dengan ujung β-pleated sheet antiparalel (Hames & Hooper, 2005).
Struktur tersier protein mengacu pada susunan tiga dimensi dari semua asam amino dalam rantai polipeptida. Struktur ini aktif secara biologis, konformasi asli ini diikat oleh beberapa ikatan nonkovalen. Jika protein terdiri dari lebih dari satu rantai polipeptida dikatakan memiliki struktur kuaterner. Hal ini mengacu pada tata ruang dari subunit polipeptida dan sifat interaksi di antara mereka (Hames & Hooper, 2005).
2.8 Interaksi Ikatan
Ada beberapa bentuk ikatan yang berperan. Biasanya dalam bentuk interaksi ikatan intermolekular seperti ikatan ion, ikatan hidrogen, ikatan van der waals, dan ikatan dipol-dipol. Beberapa obat juga membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya (Patrick, 2001).
2.8.1 Ikatan Ion
Ikatan ion terbentuk antara gugus – gugus yang memiliki muatan yang berlawanan dan sangat penting untuk beberapa interaksi ikatan obat-target. Beberapa pengantar pesan kimia alami tubuh berinteraksi melalui ikatan ion (Patrick, 2001).
2.8.2 Ikatan Hidrogen
Ikatan ini terlibat dalam interaksi antara dua molekul, yang salah satunya bertindak sebagai donor dan yang lainnya sebagai akseptor. Hidrogen donor mengandung gugus fungsi yang mempunyai proton yang terikat pada atom elektronegatif. Atom elektronegatif memiliki bagian yang lebih besar dari elektron dalam ikatan hidrogen, sehingga membuat hidrogen sedikit bermuatan positif dan elektrofilik. Hidrogen akseptor mengandung elektronegatif atom seperti oksigen atau nitrogen. Ikatan hidrogen lebih lemah dari ikatan ion. (Patrick, 2001).
2.8.3 Interaksi Van Der Waals
Interaksi van der waals adalah interaksi lemah yang muncul diantara gugus – gugus hidrofobik seperti cincin aromatik dan gugus alkil. Interaksi ini muncul disebabkan adanya fluktuasi acak dalam densitas elektron sehingga membentuk daerah sementara yang kaya elektron atau sedikit elektron. Daerah kaya elektron pada satu molekul akan menarik daerah yang elektronnya sedikit pada molekul lain. Interaksi ini lebih lemah dari ikatan ion dan ikatan hidrogen dan melibatkan molekul hidrogen netral (Patrick, 2001).
2.8.4 Interaksi Dipol-Dipol
Momen dipol penting dalam orientasi molekul ketika berinteraksi dengan situs ikatan. Obat mempunyai momen dipol yang kemungkinan untuk menyelaraskan dengan momen dipol lokal pada situs ikatan sehingga momen dipol sejajar dan dalam arah yang berlawanan. Momen dipol yang salah berorientasi bisa juga mengakibatkan penurunan aktivitas (Patrick, 2001).
2.8.5 Ikatan Kovalen
Kebanyakan obat berinteraksi dengan targetnya menggunakan ikatan intermolekular. Namun, beberapa obat membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya. Obat-obat yang mengandung gugus alkil halida dapat bertindak sebagai elektrofilik dan bereaksi dengan residu asam amino nukleofilik, seperti serin dan sistein, pada situs ikatan target, yang menyebabkan hubungan ireversibel antara obat dan target. Beberapa penghambat enzim dirancang untuk bekerja sebagai substrat dan untuk menjalani reaksi katalis enzim. Hal ini menyebabkan pembentukan hubungan kovalen antara obat dan enzim (Patrick, 2001).
2.9 Penambatan Molekul (Molecular Docking)
Dalam bidang pemodelan molekul, docking adalah metode untuk memprediksi orientasi yang lebih diutamakan dari suatu molekul ketika terikat satu sama lain untuk membentuk kompleks yang stabil. Informasi tentang oreintasi ini dapat digunakan untuk memprediksi kekuatan hubungan atau afinitas ikatan antara dua molekul yang digunakan misalnya fungsi penilaian. Hubungan antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat, karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi sinyal. Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam desain obat secara rasional (Mukesh & Rakesh, 2011)
Gambar 2.12. Konsep dasar penambatan molekul (Mukesh, 2011)
Fokus Penambatan molekul untuk mensimulasikan secara komputasi proses pengenalan molekul. Tujuan dari Penambatan molekul adalah untuk mencapai konformasi yang optimal untuk kedua protein dan ligan serta orientasi relatif antara protein dan ligan sehingga energi bebas dari sistem secara keseluruhan diminimalkan. Proses komputasi mencari ligan yang cocok baik secara geometris dan energi ke situs pengikatan protein ini disebut penambatan molekul. Penambatan molekul membantu dalam mempelajari obat / ligan atau interaksi reseptor / protein dengan mengidentifikasi situs aktif yang cocok pada protein, mendapatkan geometri terbaik dari ligan - kompleks reseptor, dan menghitung energi interaksi dari ligan yang berbeda untuk merancang ligan yang lebih efektif (Mukesh, 2011).
Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi sinar-x, atau spektroskopi NMR. Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan program
docking tergantung pada dua komponen: pencarian algoritma dan fungsi scoring (Mukesh, 2011).
Fungsi scoring untuk menghitung afinitas kompleks ligan-protein reseptor yang terbentuk dan untuk mengurutkan peringkat senyawa (Reddy et al, 2007). Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi bebas Gibbs. Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007). Gugus – gugus fungsional ligan akan berinteraksi dengan residu – residu asam amino protein reseptor sehingga membentuk ikatan intermolekular. Kekuatan ikatan inilah yang dihitung dan diperingkatkan (ranking) dengan Scoring function.
Berdasarkan interaksi yang terjadi, terdapat beberapa jenis molecular docking, yaitu:
1. Docking protein / ligan kecil 2. Docking protein / peptida 3. Docking protein / protein
4. Docking protein / nukleotida (Mukesh, 2011).
2.10 Lipinski’s Rule of Five
Lipinski’s Rule of Five juga dikenal sebagai Pfizer's Rule of five atau Rule of five (RO5) adalah aturan praktis untuk mengevaluasi obat atau menentukan apakah senyawa kimia dengan aktivitas farmakologi atau biologi tertentu memiliki sifat yang akan membuatnya menjadi obat yang aktif diberikan secara oral pada manusia. Aturan ini menjelaskan sifat molekul penting bagi farmakokinetik obat dalam tubuh manusia, termasuk penyerapan, distribusi, metabolisme, dan ekskresi (Lipinski, 2001 & Lipinski et al, 2004). Maka dari itu, apabila diinginkan dalam merancang obat yang aktif secara oral harus memenuhi ‘Lipinski’s Rule of Five’ yaitu:
- Berat molekul kurang dari 500,
- Memiliki tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor, - Memiliki tidak lebih dari 10 gugus hidrogen akseptor, - Nilai logP tidak lebih dari 5.
- Molar refractivity sebaiknya diantara 40-130 (Lipinski, 2001 & Lipinski et al, 2004).
2.11 MarvinSketch
MarvinSketch adalah komponen editing query, struktur, dan reaksi dari Java teknologi perangkat lunak ChemAxon.Pengguna MarvinSketch dapat dengan cepat digunakan untuk membuat dan mengedit struktur,
reaksi atau pertanyaan dan menghitung struktur terkait data
(chemaxon.com).
MarvinSketch tersedia sebagai standalone aplication untuk
pengguna akhir, Java Applet untuk aplikasi berbasis web dan JawaBean untuk pengembang alat kimia. Seperti semua perangkat lunak ChemAxon, MarvinSketch portabel dan dapat dijalankan dalam semua sistem operasi
utama dan termasuk Java dan .NET integration(chemaxon.com).
MarvinSketch memiliki sistem pengerjaan intuitif dan banyak pilihan pengeditan. Struktur file dari berbagai format file yang didukung dan template memungkinkan pengguna untuk menambahkan struktur sendiri, atau menggunakan perpustakaan template yang disediakan untuk
menyederhanakan struktur, reaksi dan permintaan menggambar
(chemaxon.com).
2.12 Protein Data Bank
Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb/) adalah sebuah dokumen atau kumpulan data eksperimental struktur tiga dimensi dari makromolekul biologis, yang sekarang berjumlah lebih dari 32.500
molekul tersebut adalah molekul yang ditemukan di semua organisme termasuk bakteri, ragi, tanaman, lalat, hewan lain, dan manusia. Informasi ini dapat digunakan untuk membantu menyimpulkan peran struktur dalam kesehatan manusia dan penyakit, dan dalam pengembangan obat. Struktur yang terdapat dalam arsip ini mulai dari protein kecil dan potongan-potongan DNA sampai molekul kompleks seperti ribosom (RCSB, 2014).
2.13 PubChem
PubChem (http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov) adalah gudang informasi molekuler untuk umum, sebuah karya ilmiah dari Institut Kesehatan Nasional Amerika (US National Institutes of Health / NIH). Basis data PubChem memiliki lebih dari 27 juta catatan struktur kimia khusus dari senyawa yang berasal dari hampir 70 juta senyawa endapan, dan berisi lebih dari 449.000 catatan bioassay dengan lebih dari ribuan biokimia in vitro dan skrining berbasis sel, dengan menargetkan lebih dari 7000 protein dan gen yang terhubung dengan lebih dari 1,8 juta senyawa (Xie, 2010). Pada situs PubChem ini dapat diunduh struktur kimia dari suatu senyawa secara gratis yang dibutuhkan dalam studi penambatan molekul.
2.14 Discovery Studio 3.5 Visualizer
Discovery Studio Visualizer adalah penampil gratis yang dapat digunakan untuk membuka, mengedit data serta alat untuk melakukan analisis data yang dihasilkan oleh perangkat lunak lain. Perangkat ini dirancang untuk memberikan gambaran yang interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, urutan, data refleksi X-ray, script, dan data lainnya. Aplikasi ini dapat digunakan pada Windows dan Linux dan terintegrasi dengan desktop yang menyediakan akses ke fitur sistem operasi standar seperti sistem berkas, clipboard, dan percetakan (Accelrys Enterprise Platform, 2005).
2.15 Autodock
Autodock merupakan program penambatan molekuler yang efektif yang secara cepat dan akurat dapat memprediksi konformasi dan energi dari suatu ikatan antara ligan dan target makromolekul. Autodock terdiri dari dua program utama, yaitu Autodock dan Autodock grid. Autodock untuk melakukan penambatan molekuler ligan dan protein target dengan set grid yang telah terdeskripsi. Pendeskripsian ini dilakukan
sebelumnya dengan Autogrid. Untuk memungkinkan pencarian
konformasi, Autodock membutuhkan ruang pencarian dalam sistem koordinat dimana posisi ligan dianggap akan terikat (Morris, et al., 2009).
2.16 Autodock Vina
AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat, penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command line (Sandeep et al, 2011).
2.17 PyMOL
PyMOL merupakan salah satu program visualisasi yang digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur suatu molekul. Perangkat lunak ini dikomersilkan oleh DeLano Scientific LLC (DeLano & Bromberg, 2004).
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah bulan April sampai Juni 2015.
3.2 Alat
3.2.1 Perangkat Keras
Notebook Sony VAIO (E series E Series SVE11125CVP) dengan spesifikasi Processors AMD E2 1800 APU with Radeon™ HD Graphic @1,7 Ghz ( 2 CPU ), dan RAM (Random Access Memory) 2 gigabyte. Notebook, AC Adapter VGP-AC19V57 dan terkoneksi internet.
3.2.2 Perangkat Lunak
Sistem Operasi Windows 8.1 Enterprise 64 bit, Paket Autodock Tools yang terdiri dari Python 2.5.2 dan MGLTools 1.5.6 (Scripps Research Institute), Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Autodock Vina, PyMOL (DeLano Scientific LLC.), Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/), Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com), Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) dan LigPlus.
3.3 Bahan
3.3.1 Struktur Tiga Dimensi PPAR-γ
Struktur tiga dimensi PPAR-γ diunduh dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Makromolekul protein yang dipilih
adalah PPAR-γ pada manusia yang didapat dari metode kristalografi X-ray dengan resolusi 2,30 Å yang tertambat dengan rosiglitazon. Identitas makromolekul tersebut adalah 2PRG berformat .pdb, data makromolekul diunduh dalam format format text (gz).
3.3.2 Struktur Tiga Dimensi Ligan
Struktur tiga dimensi ligan yang digunakan adalah rosiglitazon diunduh dari http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf dan senyawa-senyawa modifikasi secara amidasi dari etil p-metoksisinamat yang dibuat dengan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com) dengan format .pdb.
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Penyiapan Struktur Molekul Reseptor (PPAR-γ) 1. Pengunduhan makromolekul
Pengunduhan makromolekul PPAR-γ dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul tersebut yaitu 2PRG. Data makromolekul diunduh dalam format text (gz).
2. Pemisahan Makromolekul Air dan Ligan
Makromolekul protein dipisahkan dari pelarut dan ligan atau residu non standar. Pemisahan makromolekul dari molekul yang tidak diperlukan dilakukan dengan menggunakan program Discovery Studio 3.5 Visualizer. Hasil pemisahan tersebut akan digunakan untuk penambatan. Hasil pemisahan disimpan dalam format .pdb.
3. Optimasi Molekul
Optimasi makromolekul dilakukan dengan menggunakan Autodock Tool dan buka makromolekul yang disimpan dalam format .pdb (file → read molecule → .pdb). Optimasi tersebut meliputi : penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter. Pengaturan grid
(center x, y, z) dan, besarnya ukuran (amstrong) dan simpan (file → close saving current). Hasil ini disimpan dalam format .pdbqt.
3.4.2 Penyiapan Struktur Ligan
1. Pengunduhan dan pembuatan ligan
Ligan yang digunakan adalah rosiglitazon sebagai pembanding dan
ligan uji dibuat dengan Marvin Sketch 5.5.1.0
(http://www.chemaxon.com) dengan format .pdb, dan ligan Rosiglitazon diunduh dari situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov
sebagai pembanding senyawa amidasi dengan format .sdf. Format ligan rosiglitazon tersebut diubah menjadi .pdb menggunakan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com).
2. Optimasi Ligan
Struktur ligan yang telah dibuat, kemudian dioptimasi dengan menggunakan Autodock Tools. Kemudian, buka ligan yang telah dibuat (ligand → input → open), setelah itu simpan dalam bentuk .pdbqt (ligand → output → save as pdbqt →save.
3.4.3 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina
Ligan dan protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dicopy ke dalam folder Vina. Kemudian konfigurasi file vina diketik pada notepad, disimpan dengan nama ‘conf.txt’. Vina dijalankan melalui Command prompt.
3.4.4 Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekul 1. Hasil docking
Hasil kalkulasi docking dilihat pada output dalam format notepad. Hasil docking dilakukan dengan memilih ligan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah, nilai ikatan dapat dilihat di ‘log.txt’.
2. Visualisasi interaksi makromolekul dan ligan dengan menggunakan: a. Ligplus
Makromolekul dan output dalam bentuk .pdbqt dibuka dengan menggunakan wordpad. Kopi isi dalam output.pdbqt dan tambahkan ke dalam makromolekul dan simpan dalam format .pdbqt. masukan file tersebut (output makromolekul dan ligan) kemudian dibuka menggunakan ligplus. Visualisi interaksi makromolekul dan ligan dengan menggunakan LigPlus untuk melihat interaksi dan ikatan ligan pada asam amino dalam bentuk dua dimensi.
b. Autodock Tools
Hasil docking ligan berupa out.pdbqt dan makromolekul dibuka menggunakan Autodock Tools, kemudian dilihat interaksi makromolekul dengan ligan secara tiga dimensi.
c. PyMOL
Makromolekul dan output dalam bentuk .pdbqt dibuka secera bersamaan menggunakan PyMOL. PyMOL digunakan untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan situs tambatnya.
3.4.5 Analisa Lipinski’s Rule of Five
Lipinski’s Rule of Five ditentukan dalam merancang obat yang aktif secara oral. Kriteria Lipinski’s Rule of Five terdiri dari berat molekul (kurang dari 500), log P (tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor (tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor), jumlah hidrogen donor (tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor), jumlah akseptor donor, berat molekul, dan molar refarctivity (sebaiknya diantara 40-130). Aturan tersebut dilihat pada ligan dengan menggunakan MarvinSketch dan Advanced Chemistry Development (ACD/Labs).
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penyiapan Struktur Molekul Reseptor (PPAR-γ)
Pada tahap ini, struktur makromolekul yang digunakan diunduh
dari Protein Data Bank dengan situs http://www.rcsb.org/. Identitas protein yang dipilih adalah 2PRG yang merupakan struktur Peroxisome Proliferator-Activeted Receptor-Gamma (PPAR-γ) pada manusia (Homo sapiens) yang diperoleh dari difraksi sinar-X dengan resolusi 2,3 Å. Struktur ini diunduh dengan memilih tipe file yaitu PDB File (text) dengan format .pdb.
Struktur makromolekul PPAR-γ yang diperoleh tersebut telah terikat dengan ligan Rosiglitazon dan molekul air. Bentuk ini merupakan sisa hasil pengkristalan sebelumnya. Ligan dan molekul air dapat mengganggu proses penambatan. Pada dasarnya dengan adanya molekul air akan memediasi interaksi ligan dengan reseptor, sehingga hasil docking yang didapat semakin baik. Tetapi proses penambatan akan berlangsung lebih kompleks karena variabel persamaan-persamaan matematika docking yang perlu diselesaikan menjadi lebih banyak yang menyebabkan waktu penambatan semakin lama (Cole, Nissink, & Taylor, 2005). Selain itu, ligan yang terikat pada sisi aktif dapat menghalangi ligan lain untuk berikatan, sedangkan adanya molekul air dapat mengganggu ikatan proses penambatan yaitu kemungkinan terikatnya ligan dengan molekul air melalui ikatan hidrogen (Aditya, 2012). Struktur ini kemudian dipisahkan dari residu non standar tersebut dengan cara menghilangkannya dengan menggunakan perangkat lunak Discovery Studio, sehingga dihasilkan struktur molekul yang siap melalui tahap selanjutnya. Struktur hasil pemisahan ini disimpan dengan format .pdb.
Tahap optimasi pada Autodock Tools dilakukan untuk
28
makromolekul tersebut dapat menyesuaikan dengan lingkungan komputasi sehingga dapat di-docking. Pengoptimasian yang dilakukan yaitu penambahan atom hidrogen (protonasi) yang bertujuan untuk menyesuaikan suasana docking agar mendekati suasana pada pH sitoplasma sel (pH~7) (Drie, 2005), karena PPAR-γ termasuk reseptor inti (nuclear receptor) (Habor, 2010). Penambahan atom hidrogen yang dimaksud adalah memunculkan atom hidrogen yang ada pada struktur sehingga terlihat secara tiga dimensi yang berperan dalam interaksi dengan ligan. Atom hidrogen yang diperhitungkan adalah yang bersifat polar, karena atom ini terlibat dalam ikatan hidrogen (Yanuar, 2012). Atom hidrogen non polar tidak disertakan dalam perhitungan interaksi ligan reseptor pada penambatan molekuler sehingga perlu digabung dengan atom pengikatnya (Yanuar, 2012). Oleh karena itu dipilih pengaturan ‘Merge Non-Polar’. Pada makromolekul juga dilakukan perbaikan muatan dengan menambahankan muatan gasteiger untuk menyesuaikan dengan lingkungan docking sehingga dapat dilakukan perhitungan dengan benar (Huey, Morris, & Forli, 2012). Selain itu diperlukan pengaturan grid box untuk menentukan ruang tambat ligan yang akan di-docking. Ruang tambat ligan ditentukan dengan merujuk kepada penelitian terdahulu berdasarkan ligan yang sudah tertambat dengan makromolekul protein pada saat diunduh, yaitu dalam hal ini rosiglitazon. Pengaturan pada grid box yang digunakan meliputi center_x = 52.734, center_y = -3.774, center_z = 34.258, size_x = 28, size_y = 28, size_z = 28, dan spacing (angstrom) = 1 (Lampiran 2) (Fikry, 2014). File makromolekul maka disimpan dalam format .pdbqt.
4.2 Penyiapan Struktur Ligan
Ligan Rosiglitazon yang digunakan diunduh dari Pubchem dengan
situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf dan dipilih struktur 3D dan diubah menjadi .pdb menggunakan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com), sementara itu ligan uji yaitu ligan etil p metoksisinamat, caffeamide dan ligan amidasi etil p-metoksisinamat, dibuat dengan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com) dengan format .pdb dalam bentuk 3D dengan tipe fine with hydrogenize. Daftar ligan yang ditambatkan terdapat pada Tabel 4.1.
Ligan yang digunakan untuk penambatan molekul pada PPARγ terdiri dari beberapa bagian. Rosiglitazon digunakan sebagai senyawa pembanding. Caffeamide merupakan senyawa turunan asam sinamat dengan ikatan amida yang yang telah dilakukan uji antidiabetes sebelumnya secara in vivo. Senyawa uji yang digunakan adalah senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dan etil p-p-metoksisinamat. Selain itu, digunakan senyawa uji berupa modifikasi pada cincin aromatik dari ligan amidasi etil p-metoksisinamat yang memiliki afinitas terbaik.
Pada pengoimasian ligan dilakukan penambahan muatan gasteiger
dengan menggunakan Autodock Tools. Muatan gasteiger ini secara otomatis akan ditambahkan pada ligan ketika dibuka dengan Autodock Tools. Selain itu pada ligan juga secara otomatis dilakukan merge non polar sehingga hanya atom hidrogen polar yang muncul. Semua file ligan maka disimpan dalam format .pdbqt.
Tabel 4.1. Daftar ligan yang ditambatkan
Ligan Nama Ligan
Senyawa pembanding
Rosiglitazon
Senyawa turunan asam sinamat lain
Caffeamide
Senyawa etil p-metoksisinamat dan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat Ethyl p-methoxycinnamate P-methoxycinnamoylamine P-methoxycinnamoyl methylamine P-methoxycinnamoyl ethylamine P-methoxycinnamoyl diaminomethanal
P-methoxycinnamoyl N-ethanolamine P-methoxycinnamoyl N,N-ethanolamine P-methoxycinnamoyl piperidine P-methoxycinnamoyl cyclohexylamine P-methoxycinnamoyl phenylamine P-methoxycinnamoyl dopamine P-methoxycinnamoyl phenylethylamine P-methoxycinnamoyl Tryptamine
Senyawa modifikasi pada cincin aromatik p-methoxycinnamoyl triptamine Cinnamoyl tryptamine
P-hydroxycinnamoyl Tryptamine
4.3 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina
Setelah penyiapan protein dan ligan yang akan di-docking selesai, maka dapat dilakukan penambatan molekul dengan Autodock Vina. Hal pertama kali dilakukan pada tahap ini adalah menyalin file protein dan ligan berformat .pdbqt ke dalam folder vina pada Local Disk (C:). Kemudian dibuat konfigurasi vina yang diketik pada notepad (Lampiran 2) dan disimpan dengan nama ‘conf.txt’ dalam folder vina. Konfigurasi vina terdiri dari penulisan nama reseptor dan ligan, output, dan gribox. Penulisn nama reseptor dan ligan pada notepad harus sama dengan nama file pada folder vina. Output ‘out’ merupakan hasil dari proses docking tersebut dibuat dengan nama ‘out.pdbqt.’ Sedangkan center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z adalah grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya pada protein reseptor. Setelah pengaturan file konfigurasi notepad selesai, maka proses docking dengan vina dapat dijalankan. Vina dijalankan melalui perintah Command prompt. Dalam Command prompt, masuk ke dalam Local Disk (C:) dengan perintah ‘cd..’ , dilanjutkan dengan perintah ‘cd vina’ untuk masuk ke dalam folder vina. Kemudiann proses docking dapat dijalankan perintah sebagai berikut:
Waktu yang digunakan selama proses docking ini dipengaruhi oleh spesifikasi komputer yang digunakan dan juga ligan yang ditambatkan. Tetapi hal ini tidak terlalu mempengaruhi keakuratan hasil yang diperoleh. Proses penambatan molekul dengan Autodock Vina dapat meningkatkan akurasi dari prediksi mode ikatan bila dibandingkan dengan Autodock 4. Selain itu, vina dapat mengambil keuntungan dari multiple CPU atau CPU core dalam sistem komputer untuk memperpendek waktu running secara signifikan (Trott & Olson, 2010).
Untuk input dan output-nya, vina menggunakan format file struktur molekul yang sama dengan Autodock yaitu pdbqt. File pdbqt. Setelah proses docking selesai, maka muncul 2 file baru dalam folder vina, yaitu ‘log.txt’ dan ‘out.pdbqt’. ‘log.txt’ berisikan nilai afinitas ikatan dan root mean square deviation (RMSD) dari hasil docking. Sedangkan ‘out.pdbqt’ merupakan konformasi dari ligan-ligan yang di-docking-kan. Hasil ini dibuka dengan Autodocktools, LigPlus dan Pymol untuk melihat posisi dan orientasi dari ligan pada protein dan juga asam amino-asam amino yang terikat pada ligan serta jarak ikatan ligan dengan asam amino.
4.4 Analisa dan Visualisai Hasil
Hasil penambatan molekul pada penelitian ini meliputi nilai energi
bebas (ΔGbind) dan Root Mean Square Deviation (RMSD), serta interaksi ligan dengan residu pada makromolekul protein. Konformasi masing-masing ligan hasil docking diperingkatkan berdasarkan nilai ΔGbind dari yang terkecil sampai yang terbesar. ΔGbind merupakan energi yang dibutuhkan ligan untuk berinteraksi (ikatan) dengan reseptor pada binding site. Semakin kecil harga ΔGbind maka semakin stabil ikatan ligan dengan reseptor. Setiap ligan yang ditambatkan pada makromolekul protein, maka menghasilkan konformasi ligan berdasarkan peringkat nilai ΔGbind dari terendah dengan hasil yang paling baik.
Dasar yang digunakan untuk memberikan penilaian adalah nilai RMSD. Dari ke-9 peringkat konformasi yang dihasilkan, maka dipilihlah
peringkat teratas yang memiliki nilai ΔGbind dengan RMSD 0, karena merupakan konformasi terbaik dari penambatan masing-masing ligan. Selain itu, nilai RMSD dikatakan baik jika < 2 Å. Dengan penyimpangan yang semakin besar, semakin besar kesalahan pada prediksi interaksi ligan dengan protein (Brooijmans, 2009). RMSD merupakan nilai penyimpangan antara satu konformasi ligan tambat dengan ligan x-ray. RMSD digunakan untuk menentukan apakah prediksi modus ikatan tersebut berhasil dan penting untuk validasi program docking. Batas atas RMSD (u.b.) menyatakan kecocokan antara suatu atom pada salah satu konformasi dengan dengan atom yang sama pada konformasi lainnya dan batas bawah RMSD (i.b.) menyatakan kecocokan antara suatu atom pada salah satu konformasi dengan atom dari unsur sejenis pada konformasi lainnya (Nauli, 2014). ΔGbind dengan RMSD terendah masing-masing ligan dikumpulkan dalam Tabel 4.2. Dari data hasil docking diperoleh nilai ΔGbind amidasi etil p-metoksisinamat dengan rentang -6,2 kkal/mol sampai -9,3 kkal/mol. Sedangkan rosiglitazon sebagai pembanding menunjukkan nilai ΔGbind -8,9 kkal/mol. P-methoxycinnamoyil tryptamine menghasilkan nilai terbaik dari senyawa amidasi etil p-metoksisinamat lainnya dan rosiglitazon. Hal ini menunjukkan bahwa P-methoxycinnamoyil tryptamine dengan ΔGbind -9,3 kkal/mol lebih potensial sebagai antidiabetes dibandingkan Rosiglitazon.
Dari hasil senyawa etil p-metoksisinamat sebagai antidiabetes terhadap PPAR-γ memiliki ΔGbind sebesar -6,2 kkal/mol. Hal ini berarti nilai energi ikatan pada PPAR-γ kurang baik dibandingkan senyawa pembanding Rosiglitazon dengan ΔGbind sebesar -8,9 kkal/mol, sehingga modifikasi dilakukan untuk mendapatkan hasil yang lebih baik. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa adanya gugus amida dibandingkan dengan ester, dapat menunjukkan nilai ΔGbind lebih kecil dan lebih baik sebagai antidabetes pada PPAR-γ. Sehingga senyawa amidasi etil p-metoksisinamat berpotensi memiliki efek antidiabetes yang jauh lebih baik.
Tabel 4.2. Nilai ΔGbind ligan
Rumus molekul Ligan Nama Ligan ΔGbind
(kkal/mol) Senyawa pembanding
Rosiglitazon -8.9
Senyawa turunan asam sinamat lain
Caffeamide -7,7
Senyawa EPMS dan senyawa amidasi EPMS
Ethyl p-methoxycinnamate -6.2 P-methoxycinnamoylamine -6.2 P-methoxycinnamoyl methylamine -6.5 P-methoxycinnamoyl ethylamine -6.6
P-methoxycinnamoyl N,N-ethanolamine -6.6 P-methoxycinnamoyl Ethanolamine -6.9 P-methoxycinnamoyl diaminomethanal -7.5 P-methoxycinnamoyl piperidine -7.7 P-methoxycinnamoyl cyclohexylamine -8.0 P-methoxycinnamoyl phenylamine -8.3 P-methoxycinnamoyl phenylethylamine -8.5
P-methoxycinnamoyl dopamine -8.7 P-methoxycinnamoyl Tryptamine -9.3
Senyawa modifikasi pada cincin aromatik p-methoxycinnamoyl tryptamine
Cinnamoyl tryptamine -9.1
P-hydroxycinnamoyl Tryptamine
-9.2
Dari hasil docking pada ligan amidasi etil p-metoksisinamat menunjukkan bahwa modifikasi struktur yang dilakukan pada gugus etil p-metoksisinamat menjadi turunan amida dapat meningkatkan afinitas ikatan dengan reseptor PPARγ sebagai antidiabetes. Ketika gugus ester OC2H5
pada ethyl p-methoxycinnamate digantikan dengan NH2 seperti pada
p-methoxycinnamoylamine, ΔGbind yang dihasilkan adalah sama yaitu . Sementara itu, pada hasil yang lain diperoleh bahwa semakin panjang rantai alkil pada amina yang ditambahkan, maka semakin kecil nilai ΔGbind yang berarti ligan semakin stabil ketika ditambatkan dengan PPARγ. Begitupun ketika gugus alkil digantikan dengan siklik dan aril, nilai ΔGbind yang dihasilkan semakin kecil.
Caffeamide dibandingkan dengan senyawa amidasi EPMS yang memiliki gugus amina sama yaitu p-methoxycinnamoyl piperidine
menunjukkan ΔGbind yang sama pula. Hal ini menandakan bahwa adanya 2 gugus OH pada benzen dari caffeamide memiliki pengaruh yang sama dengan gugus OCH3 pada gugus benzen dari p-methoxycinnamoyl piperidine.
Setelah diperoleh afinitas ligan yang paling baik yaitu p-methoxycinnamoyl triptamine, selanjutnya dilakukan penghilangan gugus CH3 dan OCH3 pada cincin aromatiknya. Hasil yang diperoleh bahwa dengan penghilangan gugus metil dan metoksi pada cincin aromatik dapat meningkatkan nilai ΔGbind. Walaupun nilai ΔGbind tidak terjadi perubahan yang signifikan, tetapi kestabilan afinitas ligan menjadi berkurang. Hal ini menandakan bahwa keberadaan O dan CH3 pada cincin aromatik mempengaruhi afinitas ligan amidasi etil p-metoksisinamat sebagai antidiabetes. Sehingga apabila gugus tersebut hilang, maka dapat menurunkan energi ikatannya.
Selain itu, diperhatikan juga interaksi yang terjadi antara ligan dengan residu-residu makromolekul reseptor. Identifikasi interaksi tersbut dilihat menggunakan program Autodock Tools (3D) dan LigPlus (2D). Interaksi yang terjadi berupa ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi elektrostatik (Arwansyah, 2014). Tetapi pada software yang digunakan hanya dapat mendeteksi ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Sementara PyMOL (3D) digunakan untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan makromolekul protein. Visualisasi tersebut ditunjukkan pada Gambar 4.2 dan Gambar 4.3.
Gambar 4.2 .Visualisasi interaksi rosiglitazon dengan molekul protein (PPARγ) Autodock Tools (Kiri), LigPlus(Kanan), dan PyMOL Bawah)
Gambar 4.3 Visualisasi interaksi p-methoxycinnamoyl triptamine dengan molekul protein (PPARγ)
