BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Hasil Simulasi
1. Perbandingan perilaku wild type p53 (wt-p53) dan quadruple
M133L/V203A/N239Y/N268D (QMT)
Setelah minimisasi dan equilibrasi dilakukan, wt-p53 disimulasikan selama 9 ns sedangkan QMT disimulasikan dua kali masing-masing selama 5 ns. Hasil simulasi diolah dengan program analisis ptraj. Analisis yang pertama
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
25
dilakukan adalah pengamatan pergesaran posisi rata-rata molekul tiap waktu terhadap posisi awalnya yang disebut dengan RMSD (Root Mean Square Deviation).
Hasil simulasi DM berupa profil RMSD total wt-p53, QMT_1 (simulasi QMT yang pertama), dan QMT_2 (simulasi QMT yang kedua) ditunjukkan oleh gambar 12. Gambar tersebut menujukkan ketiga sistem sama-sama bergeser naik dari 1Å ke kisaran 2,3Å diawal simulasi hingga 800 ps. Hal ini menunjukkan ketiga sistem tersebut masih mengalami tahap equilibrasi artinya masih mencari posisi stabil sebelum simulasi. Pada saat 1-2 ns perbedaan pergeseran posisi mulai terjadi antara wt-p53 dan QMT_2 dengan QMT_1. Baik wt-p53 dan QMT_2 keduanya turun dulu baru naik, sedangkan QMT_1 naik dulu baru turun. Gambaran ini menunjukkan posisi wt-p53 pada saat tersebut bisa dicapai oleh QMT_2 tetapi QMT_1 tidak bisa.
Rentang waktu berikutnya antara 2-3 ns ketiga sistem bertemu pada jarak yang sama. Setelah 3 ns QMT_1 sempat naik lagi tapi kembali turun dan stabil pada jarak 2,5Å hampir sama dengan profil wt-p53 yang naik dulu tapi kembali lagi dan stabil pada jarak 2,5Å.
Profil QMT_2 relatif terus naik perlahan hingga akhir simulasi namun jika dibandingkan dengan profil p53 kenaikan QMT_2 masih mendekati wt-p53 diarea 2,5Å. Pada pertengahan hingga akhir simulasi profil RMSD ketiga sistem stabil pada jarak yang sama, meski pada rentang waktu 1-2 ns ada perbedaan pergeseran posisi ketiganya. Perbedaan posisi yang terjadi pada ketiga sistem berkaitan dengan faktor fluktuasi atomik rata-rata ketiga sistem tersebut. Oleh karena itu dilakukan analisis ptraj B-factor ketiga sistem untuk menjelaskan lebih lanjut karakter dinamika ketiga molekul tersebut.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
26
Gambar 12.Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil simulasi DM untuk quadruple mutan QMT_1 (garis merah), QMT_2(garis biru), dan wild type p53 wt-p53 (garis hitam).
Hasil simulasi DM yang telah dilakukan untuk QMT dan wt-p53 menunjukkan profil B-factor yang relatif sama meski masih ada fluktuasi yang lebih tingi untuk QMT. Jika dibandingkan dengan wt-p53 fluktuasi QMT lebih tinggi pada beberapa residu yang memang lebih fluktuatif dibanding yang lain. Pada gambar 13 dibawah nilai B-factor QMT hasil simulasi DM menunjukkan nilai yang lebih tinggi pada daerah tertentu (residu 120, 181, 186, 226, dan 248).
Gambar 13.Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu untuk quadruple mutan QMT_1 (garis merah), QMT_2 (garis biru), rerata QMT_1 dan QMT_2 (orange) dan wild type p53 wt-p53 (garis hitam).
Perulangan simulasi DM untuk QMT dilakukan untuk memastikan fluktuasiQMT. Hasil simulasi ternyata menunjukkan profil B-factor yang berbeda
120 181 186 248 226 RMSD (Å) Waktu (ps)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
27
meski dilakukan pada rentang waktu yang sama yaitu 5ns. B-factor QMT_2 yang ditunjukkan gambar 13 secara keseluruhan tampak lebih mendekati wt-p53 dari pada B-factor QMT_1 meskipun masih ada beberapa residu yang lebih fluktuatif (120, 186, dan 248).
Perbedaan profil fluktuasi QMT ini hanya menunjukkan probabilitas dinamika molekulnya dimana suatu keadaan bisa dicapai seperti QMT_1 sedangkan keadaan yang lain bisa saja dicapai seperti QMT_2. Bahkan hasil rata-rata B-factor keduanya tidak jauh berbeda dan sangat mendekati wt-p53 sebagaimana ditunjukkan oleh garis orange pada gambar 13. Oleh karena itu untuk mengamati lebih dalam perbedaan profil B-factor yang ada berbeda nyata
atau tidak dilakukan analisis sudut dihedral Ф (phi) dan ψ (psi) backbone residu
yang penting untuk berikatan dengan DNA dan residu lain yang berbeda cukup signifikan.
a. Residu Lisin 120 dan Arginin 248
Baik QMT_1 maupun QMT_2 keduanya menunjukkan fluktuasi pada residu 120 dan 248 yang penting untuk berikatan dengan DNA. Residu 120 adalah asam amino lisin yang merupakan bagian dari loop L1 (Wong etal.,1999)
dan berikatan hidrogen dengan O6 dan N7 dari basa Gua 8 dalam major groove
(lekukan besar) DNA, sedangkan arginin 248 berikatan dengan minor groove DNA (Wright, 2007).
Pada residu lisin 120 profil B-factor QMT tampak sedikit lebih fluktuatif dari wt-p53. Faktor fluktuasi berasal dari kontribusi fluktuatif sudut torsi phi (Ф4)
yaitu backbone C120:N121:CA121:C121 dari residu lisin 120 dan serin 121 baik untuk QMT_1 maupun QMT_2. Ada fluktuasi sudut sebesar 50° pada kisaran 1,5ns hingga akhir simulasi namun masih dominan pada sudut -50° yaitu posisi yang sama dengan wt-p53. Selain itu ada juga perubahan sudut torsi ψ5 backbone
N121:CA121:C121:N122 dari residu serin 121 dan valin 122 sebagaimana ditunjukkan pada gambar 14A. Perubahan sudut dihedral Ф4 dan ψ5 ini menyebabkan fluktuasi rantai samping lisin 120 selama simulasi sebagaimana tampak pada hasil snapshot gambar 14B. Meski tampak fluktuatif namun posisi
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
28
rantai samping wt-p53 masih dominan dapat dicapai oleh QMT_1 atau QMT_2. Posisi yang sama kita lihat dapat terjadi saat 1,5 ns; 2,5 ns; dan 4 ns.
A
B
Gambar 14. Profil perbandingan fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) pada baris bawah
dan Phi (Ф) pada baris atas residu 118-123 (melibatkan residu lisin
120) antara wt-p53, QMT_1, dan QMT_2 berturut-turut ditunjukkan dengan warna hitam, merah, dan biru, A. Grafik fluktuasi sudut dihedral terhadap waktu yang fluktuatif pada Ф4 memuat residu 120
dan 121 dan ψ5 yang memuat residu 121 dan 122. B. Posisi sudut
dihedral selama simulasi dengan backbone residu lisin 120 dan serin 121 digambarkan sebagai stik dan bola sedangkan rantai samping lisin 120 digambarkan sebagai stik.
Lain halnya dengan residu 248, baik wt-p53 dan QMT keduanya memiliki tingkat fluktuasi yang hampir sama berdasarkan profil B-factornya namun terdapat perbedaan yang signifikan pada profil sudut torsinya.Perbedaan
terjadi pada sudut dihedral Ф3 yaitu backbone C246:N247:CA247:C247 dari
residu 246 (metionin) dan 247 (asparagin) serta ψ4 backbone
N247:CA247:C247:N248 yang memuat residu 247 (asparagin) dan 248 (arginin) masing-masing sebesar 100°. Meski berbeda tapi menunjukkan garis yang stabil dari awal hingga akhir simulasi. Perbedaan ini menjelaskan satu kondisi yang
0 ns 1,5ns
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
29
berbeda dapat dicapai wt-p53 dan QMT stabil dari awal hingga akhir simulasi 5 ns sehingga dapat dikatakan stabil secara termodinamika sebagaimana ditunjukkan gambar 15A.
Pada gambar 15B kita melihat adanya perubahan cukup signifikan saat 1 dan 2 ns. Backbone wt-p53 residu 244-246 berubah dari loop menjadi sheet
sedangkan QMT tetap pada struktur loop. Saat 3 ns sheet wt-p53 244-245 berubah menjadi loop kembali tak lama kemudian berubah kembali saat 4 ns. Gambar 14B memang menunjukkan fluktuasi konformasi backbone 244-245 tetapi profil grafik
torsi Ф1, Ф2, ψ1, dan ψ2 tampak stabil. Hal ini menunjukkan konformasi sheet
protein sama dengan konformasi loopnya.
Pada backbone residu 246-248 gambar 15A tampak adanya perubahan sudut permanen sebesar 100°. Perubahan ini nampak pada gambar 15B dimana kedua molekul QMT menekuk dengan besar sudut yang tetap selama simulasi dan wt-p53pun menekuk dengan besar sudut yang berbeda dari QMT konstan selama simulasi. Pergeseran rantai samping arginin 248 terjadi sejak 1 ns tapi hanya berfluktuasi lalu kembali lagi berhimpit diakhir simulasi.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
30
A
B
Gambar 15. Profil perbandingan fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф)
residu 244-248 (melibatkan residu arginin 248) antara wt-p53, QMT_1, dan QMT_2 berturut-turut ditunjukkan dengan warna hitam, merah, dan biru, A. Grafik fluktuasi sudut dihedral terhadap waktu yang fluktuatif
pada Ф3 memuat residu 246 dan 247 serta ψ4 yang memuat residu 247
dan 248. B. Perubahan sudut dihedral selama simulasi dengan backbone
residu 244-249 digambarkan sebagai ribbon sedangkan rantai samping arginin 248 digambarkan sebagai stik.
Berdasarkan hasil simulasi kedua residu tersebut dapat disimpulkan
quadruple mutan ini tidak berpengaruh signifikan terhadap residu lisin 120 dan arginin 248. Quadruple mutan ini bisa membuat residu lisin 120 lebih fluktuatif namun masih dominan pada posisi yang sama dengan wt-p53. Pada residu 248
quadruple mutan ini memang memberikan perubahan signifikan untuk rantai
utamanya namun tidak signifikan karena masih pada posisi yang berdekatan dengan wt-p53.
b. Residu Arginin 181, Asam Aspartat 186, dan Glysin 226
Pengamatan berikutnya dilakukan pada residu-residu yang lebih fluktuatif ditandai dengan nilai puncak B-factor yang lebih tinggi dibanding yang
0 ns 1 ns 2 ns 3 ns 4 ns
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
31
lain, yaitu daerah residu 181,186, dan 226. Pada dasarnya daerah yang sangat fluktuatif dari hasil simulasi DM sama dengan hasil kristalografi sinar-x nya yaitu adanya perbedaan struktur pada daerah loop L1, loop L2, loop L3, dan paling signifikan terjadi pada loop putaran strand S7 dan S8 (gambar 16); dimana, residu 181 dan 186 pada loop L2, serta residu 226 terdapat pada loop putaran S7-S8.
Gambar 16.Perbandingan struktur hasil kristalografi sinar-x wt-p53 dan QMT dalam bentuk stereo dari backbone wild type-p53 tanpa DNA (rantai A,biru), wild type p53 dengan DNA(rantai B, jingga) dan quadruple mutan p53(hitam) setelah dihimpitkan (Joerger,et al, 2004).
Sudut dihedral psi(ψ) dan phi (Ф) untuk backbone residu-residu
fluktuatif pada gambar 17 menunjukkan adanya banyak kontribusi perubahan sudut dihedral terhadap nilai B-factor residu-residu tersebut. Pada gambar 17A
kita melihat perbedaan profil Ф1 backbone C179:N180:CA180:C180 untuk
QMT_1 dan QMT_2 dibandingkan dengan wt-p53. Meskipun torsi Ф1 dari
QMT_1 dan QMT_2 saling berbeda satu sama lain namun masing-masing kondisi masih dapat dicapai oleh wt-p53 pada satu waktu tertentu. Sehingga perbedaan yang ditunjukkan pada dasarnya tidak cukup nyata antara wt-p53 dan QMT.
Lain halnya dengan rentang residu 184-188 pada gambar 17B. Profil torsi QMT_1 dan QMT_2 untuk Ф2 backbone C184:N185:CA185:C185 dan ψ3
backbone N185:CA185:C185:N186 nampak berbeda dibandingkan dengan
wt-p53. Profil torsi Ф2 untuk QMT_2 saat kisaran 4 ns masih bisa dicapai oleh
p53 akan tetapi kondisi QMT_1 tidak bisa. Kondisi QMT_1 baru bisa dicapai wt-p53 saat mendekati 5 ns.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
32
Perubahan yang cukup signifikan terjadi pada ψ3 residu serin 185 dan
asam aspartat 186. Backbone kedua residu tersebut mengalami perubahan sudut hampir 200○ sejak 500 ps hingga 4500 ps. Backbone tersebut sempat kembali pada kondisi wt-p53 sejenak lalu berubah lagi hingga akhir simulasi. Perubahan sudut backbone tampak jelas pada gambar 18. Gambar 18 menunjukkan ada tekukan besar residu serin 185 dan asam aspartat 186 untuk QMT_2 berangsur-angsur selama simulasi. Sedangkan untuk QMT_1 sendiri sempat ada perubahan mendekati arah perubahan QMT_2 namun masih dominan pada kondisi wt-p53 yaitu pada sudut 100○.
Residu 226 adalah residu yang sangat fluktuatif ditandai dengan nilai
B-factor paling tinggi dibanding yang lain. Residu ini terletak pada loop putaran S7
dan S8 yang sangat fleksibel. Perbedaan yang nyata antara wt-p53 dan QMT juga terlihat dari hasil kristalografi sinar-x (gambar 16). Berdasarkan hasil simualsi DM (gambar 17C) fluktuasi pada residu 226 terjadi karena kontribusi perubahan torsi residu 225-230 itu sendiri. Meski demikian perubahan tersebut masih dikategorikan stabil secara kinetika dimana satu kondisi tidak dapat dicapai oleh mutan namun pada saat tertentu bisa kembali lagi dicapai oleh mutan mengikuti kondisi wild type nya.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user 33 A Ф1 Ф2 Ф3 Ф4 Ψ1 Ψ2 Ψ3 Ψ4 B Ф1 Ф2 Ф3 Ф4 Ψ1 Ψ2 Ψ3 Ψ4 C Ф1 Ф2 Ф3 Ф4 Ф5 Ψ1 Ψ2 Ψ3 Ψ4 Ψ5
Gambar17. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф), A. Residu 179-181, B. Residu 184-188, C. Residu 225-230
Hasil pengamatan dinamika molekul wt-p53, QMT_1, dan QMT_2 menunjukkan bahwa ketiga residu fluktuatifnya memiliki karakter fluktuasi yang
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
34
sama secara umum artinya kondisi wt-p53 sebagai pembanding masih dapat dicapai oleh quadruple mutan meski ada perbedaan namun secara umum dominan sama dengan wt-p53.
0ns 1ns 2ns
3ns 4ns 5ns
Gambar18. Perubahan sudut dihedral selama simulasi 0-5ns dengan backbone
residu asam amino 185-187 berturut-turut dari atas ke bawah digambarkan sebagai ribbon sedangkan rantai sampingnya digambarkan sebagai stik.
Dengan asumsi quadruple mutan tidak berpengaruh cukup signifikan terhadap residu penting p53 berikatan DNA (lisin 120, glysin 245, arginin 248, dan arginin 273) dan adanya kesamaan ketiga karakter dinamika konformasi molekul residu fluktuatif, maka dapat dikatakan quadruple mutan
M133L/V203A/N239Y/N268D QMT tidak berbeda nyata dengan wild type p53 wt-p53. Akan tetapi perlu adanya studi lebih lanjut mengenai interaksi quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D dengan DNA khususnya pada residu 120, 245 dan 248.