Analisis profil lipid (trigliserida, kolesterol, LDL, HDL), SGOT/SGPT, dan Gula Darah Puasa (GDP) dilakukan oleh Laboratorium Klinik Katili pada hari-H pengambilan darah intervensi (H-0 dan H-21). Instrumen yang digunakan adalah RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer (Reiged Diagnostic) untuk menganalisis SGOT/SGPT dan Microlab 300 (Vital Scientific) untuk menganalisis profil lipid
dan Gula Darah Puasa (GDP). Prosedur analisis dari setiap parameter adalah, sebagai berikut :
3.3.3.1 Trigliserida
Metode analisis trigliserida yang digunakan adalah kolorimetri GPO-PAP-enzimatis. Reagen Triglycerides–Liquizyme GPO-PAP (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC, lalu diinjeksikan pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut:
- Trigliserida dihemolisis oleh Lipoprotein Lipase (LPL) menjadi gliserol. Trigliserid LPL Gliserol + AsamLemak
- Gliserol yang bereaksi dengan ATP mengalami fosforilasi menjadi gliserol-3-fosfat pada reaksi katalisis oleh enzim gliserol kinase (GK).
Gliserol + ATP GK Gliserol-3-fosfat + ADP - Oksidasi gliserol-3-fosfat dikatalisis oleh gliserol fosfat oksidase membentuk
dihidroksi aseton fosfat dan hidrogen peroksida (H2O2).
Gliserol-3-fosfat + O2 GPO dihidroksi aseton fosfat + H2O2 - Adanya peroksidase (POD) mengkatalisis reaksi oksidasi berpasangan
Hidrogen Peroksidase dari 4-klorofenol dan 4-aminoantifirin (4 APP) untuk membentuk warna merah quinoneimine dye yang terukur pada panjang gelombang 546 nm.
2 H2O2 + 4 APP + 4 klorofenol POD Quinoneimine dye + 4 H2O Penghitungan hasil trigliserida dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut:
Konsentrasi trigliserida (mg/dL) = Aspesimen/Astandar x 200 3.3.3.2 Kolesterol
Metode analisis kolesterol yang digunakan adalah kolorimetri CHOD-PAP-enzimatis. Reagen Cholesterol–Liquizyme CHOD-PAP (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC, lalu diinjeksi pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut:
- Ester kolesterol dihidrolisis secara enzimatis oleh kolesterol esterase (KE) menjadi kolesterol dan asam lemak
Ester kolesterol KE Kolesterol + Asam lemak
- Kolesterol bebas kemudian dioksidasi oleh kolesterol oksidase (KO) menjadi
cholestenone dan hidrogen peroksida
Kolesterol bebas + O2 KO Cholestenone + H2O2
- Hidrogen peroksida, fenol dan 4 amino antifirin (APP) direaksikan dengan peroksida (POD) membentuk kromofor quinoneimine dye yang dapat terbaca pada panjang gelombang 500-550 nm.
2H2O2 + fenol + 4 AAP POD Quinoneimine dye + 4 H2O
Penghitungan hasil kolesterol dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut:
Konsentrasi kolesterol (mg/dL) = Aspesimen/Astandar x 200 3.3.3.3 High Density Lipoprotein (HDL)
Metode analisis HDL yang digunakan adalah berdasarkan prinsip pengendapan. Reagen HDL-Cholestero (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 20-25oC, lalu diinjeksi pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah LDL dan VLDL pada sampel diendapkan dengan ion
phosphotungstate dan magnesium. Setelah disentrifugasi selama 10 menit (4000 rpm), supernatan yang mengandung fraksi HDL ditentukan berdasarkan prinsip sebagai berikut:
- Ester kolesterol dihidrolisis secara enzimatis oleh kolesterol esterase (KE) menjadi kolesterol dan asam lemak
Ester kolesterol KE Kolesterol + Asam lemak
- Kolesterol bebas kemudian dioksidasi oleh kolesterol oksidase (KO) menjadi
cholestenone dan hidrogen peroksida
Kolesterol bebas + ½ O2 + H2O KO Cholestenone + H2O2 - Air, fenol dan 4 amino antifirin direaksikan dengan peroksida (POD)
membentuk kromofor quinoneimine dye yang dapat terbaca pada panjang gelombang 500-550 nm.
2H2O + fenol + 4 AAP POD Quinoneimine dye + 4 H2O Penghitungan hasil HDL dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut:
Konsentrasi HDL (mg/dL) = Asampel x 570 3.3.3.4 Low Density Lipoprotein(LDL)
Penghitungan konsentrasi LDL menggunakan persamaan Friedewald (1972) sebagai berikut:
Konsentrasi LDL (mg/dL) = Total kolesterol (mg/dL) – HDL (mg/dL) – (Trigliserida (mg/dL)/5)
3.3.3.5 SGOT
Metode analisis SGOT yang digunakan adalah metode kinetik berdasarkan
International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Reagen yang digunakan adalah AST/GOT (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah, lalu diinjeksi pada alat RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer (Reiged Diagnostic) dan dibaca pada panjang gelombang 340 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut:
- Grup amino secara enzimatis ditransfer oleh AST dalam sampel dari L-aspartat menjadi 2-oksaloglutarat menghasilkan oksaloasetat dan L-glutamat
- Oksaloasetat, NADH direduksi dengan malat dehidrogenase (MDH) menjadi L-malat. Pada reaksi ini NADH dioksidasi menjadi NAD.
Oksaloasetat + NADH + H+ MDH L-malat + NAD+
- Penambahan laktat dehidrogenase (LDH) pada reagen ditujukan untuk mempercepat reaksi reduksi dari pirufat, agar tidak mempengaruhi analisis.
Sampel pirufat+ NADH + H+ LDH L-laktat + NAD+
Penentuan hasil analisis dilakukan otomatis oleh alat tersebut. Hasil Pembacaan absorbansi dilakukan setelah 90 detik (initial absorbance) dan dibaca lagi setelah 30, 60, dan 90 detik setelah initial absorbance. Hasil analisis akhir adalah rata-rata perubahan absorbansi tersebut per menit, yang dihitung dengan rumus, sebagai berikut:
SGOT (U/L) = 1746 x delta A340 nm/menit 3.3.3.6 SGPT
Metode analisis SGPT yang digunakan adalah metode kinetik berdasarkan
International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Reagen yang digunakan adalah ALT/GPT (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah, lalu diinjeksi pada alat RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer (Reiged Diagnostic) dan dibaca pada panjang gelombang 340 nm. Prinsip analisis adalah sebagai berikut:
- Grup amino secara enzimatis ditransfer oleh ALT dalam sampel dari L-alanin menjadi 2-oksoglutarat menghasilkan pirufat dan L-glutamat
L-aspartat + 2-oksaloglutarat ALT pirufat dan + L-glutamat - Pirufat direduksi dengan Laktat dehidrogenase (LDH) menjadi NAD. Pada
reaksi ini NADH dioksidasi menjadi NAD.
Pirufat + NADH + H+ MDH L-malat + NAD+
- Penambahan laktat dehidrogenase (LDH) pada reagen ditujukan untuk mempercepat reaksi reduksi dari pirufat, agar tidak mempengaruhi analisis.
Sampel pirufat+ NADH + H+ LDH L-laktat + NAD+
Penentuan hasil analisis dilakukan otomatis oleh alat tersebut. Hasil Pembacaan absorbansi dilakukan setelah 90 detik (initial absorbance) dan dibaca lagi setelah 30, 60, dan 90 detik setelah initial absorbance. Hasil analisis akhir adalah rata-rata perubahan absorbansi tersebut per menit, yang dihitung dengan rumus, sebagai berikut:
SGPT (U/L) = 1746 x delta A340 nm/menit 3.3.3.7 Glukosa Darah Puasa
Metode analisis Gula Darah Puasa (GDP) yang digunakan adalah kolorimetri GOD-PAP-enzimatis. Reagen Glucose–Liquizyme GOD-PAP (Spectrum) ditambahkan pada plasma darah kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 15-25oC, lalu diinjeksi pada alat Microlab 300 (Vital Scientific) dan dibaca pada panjang gelombang 546 nm. Prinsip analisis adalah kadar glukosa ditentukan setelah oksidasi enzimatis oleh enzim glukosa oksidase (GOD). Hidrogen peroksida (H2O2) yang terbentuk kemudian dikatalisis oleh peroksidase
(PAP) dengan fenol dan 4-aminoantifirin (AAP) untuk membentuk warna merah ungu quinoneimine, dengan reaksi sebagai berikut:
Glukosa + 2H2O +O2 GOD Asam glukonat + H2O2
2H2O2 + fenol + 4 AAP PAP Quinoneimine dye + 4 H2O
Penghitungan hasil glukosa darah puasa dilakukan secara otomatis oleh alat tersebut dengan prinsip, sebagai berikut:
Konsentrasi glukosa(mg/dL) = Aspesimen/Astandar x 100