3. METODE PENELITIAN
3.3. Tahapan Penelitian
3.3.3. Pengaruh Modifikasi Pati Garu terhadap Pembentukan Pat
3.3.3.2. Perlakuan Hidrolisis Asam dan Siklus Auto-
Proses modifikasi pati garut dengan perlakuan hidrolisis asam dan siklus
autoclaving-cooling dilakukan berdasarkan kondisi terpilih dari tahap 3.3.2. Sam- pel hasil modifikasi dikeringkan dengan menggunakan pengering beku (freeze dryer) selama 48 jam, digiling dengan menggunakan mortar dan diayak. Sampel kemudian dikemas dan disimpan dalam freezer -18oC hingga digunakan.
Pati garut hasil modifikasi dengan perlakuan hidrolisis asam secara lambat dan siklus autoclaving-cooling kemudian dianalisis sama dengan analisis sampel pati garut yang diberi perlakuan siklus autoclaving-cooling pada tahap 3.3.3.1.
3.3.3.3. Perlakuan Debranching dan Siklus Autoclaving-cooling (Zhao dan Lin 2009)
Pati garut sebanyak 20,0 g dibuat menjadisuspensi pati garut 20% b/v dan diberi perlakuan pemanasan awal pada suhu terpilih dari tahap 3.3.2.1(a). Pasta pati kemudian dipanaskan pada suhu tinggi dengan otoklaf pada kondisi terpilih pada tahap 3.3.2.1(b). Setelah didinginkan selama satu jam pada suhu ruang, pasta pati disimpan di dalam refrigerator 4oC selama 24 jam. Pasta pati yang telah mengalami modifikasi satu siklus ini kemudian dipanaskan kembali hingga suhu 50oC.
Pasta pati garut yang telah mengalami perlakuan autoclaving-cooling seba- nyak satu siklus kemudian dihidrolisis oleh enzim pullulanase dengan dua konsen- trasi yang terpilih pada tahap 3.3.2.3(b). Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 50oC dan pH 5,2 dan digoyang pada kecepatan 160 rpm. Untuk menghentikan reaksi enzimatis ini, inaktivasi enzim dilakukan dengan cara memanaskan pasta pati terhidrolisis di dalam otoklaf pada kondisi terpilih pada tahap 3.3.2.1(b).
Sampel dari perlakuan tersebut kemudian dianalisis sama seperti analisis sampel pati garut yang diberi perlakuan siklus autoclaving-cooling pada tahap 3.3.3.1.
52
3.3.3.4. Kombinasi Perlakuan Hidrolisis Asam, Debranching, dan Siklus Autoclaving-cooling (Lehmann et al. 2003)
Pati garut dimodifikasi dengan perlakuan hidrolisis asam, debranching dan siklus autoclaving-cooling dengan kondisi yang terpilih dari tahap 3.3.2.
Pati yang telah diberi perlakuan di atas dianalisis sama seperti analisis sampel yang diberi perlakuan siklus autoclaving-cooling pada tahap 3.3.3.1.
3.3.3.5.Analisis Statistika
Uji beda nyata pada taraf kepercayaan 95% atau α=0,05 digunakan untuk menentukan pengaruh perlakuan pada penelitian tahap III terhadap parameter uji yang relevan. Analisis statistika dilakukan dengan menggunakan program SPSS 16. Uji korelasi dilakukan antar parameter yang relevan (pada tingkat kepercayaan 95%).
3.4.Prosedur Analisis 3.4.1. Analisis Proksimat
3.4.1.1. Kadar Air (925.10 AOAC 1998)
Kadar air sampel pati garut dianalisis dengan menggunakan metode gravi- metri. Cawan aluminium dikeringkan dengan oven pada suhu 130+3°C selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam desikator selama 10 menit. Cawan yang sudah kering ditimbang sebelum digunakan. Sekitar 2,0 g sampel pati garut ditim- bang ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 130°C selama 1 jam, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai beratnya konstan. Kadar air dihitung dengan rumus sebagai berikut (persamaan 1):
Kadar air (%bb) = a – (b - c) x 100 (1)
a
dengan: a = bobot sampel awal (g); b = bobot sampel dan cawan setelah dike- ringkan (g); c = bobot cawan kosong (g)
3.4.1.2. Kadar Abu (923.03 AOAC 1998)
Kadar abu pati garut dianalisis dengan menggunakan metode gravimetri. Cawan porselin kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven bersuhu 105°C selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator. Cawan porselin kering tersebut ditimbang dan dicatat bobotnya sebelum digunakan. Sebanyak 3,0-5,0 g sampel
53 pati garut ditimbang di dalam cawan porselen tersebut dan dimasukkan dalam tanur listrik bersuhu 550°C sampai pengabuan sempurna. Setelah pengabuan selesai, cawan contoh didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Penim- bangan diulangi kembali hingga diperoleh bobot tetap. Perhitungan kadar abu dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut (persamaan 2 dan 3):
Kadar abu (%bb) = b x 100 (2)
a
Kadar abu (%bk) = Kadar abu (%bb) x 100 (3)
(100 – kadar air) dengan: a = bobot sampel awal (g); b= bobot abu (g)
3.4.1.3. Kadar Lemak (SNI 01-2891-1992)
Kadar lemak pati garut dianalisis dengan menggunakan soxhlet. Labu lemak dikeringkan di dalam oven 105°C selama 15 menit, didinginkan di dalam desi- kator dan ditimbang sebelum digunakan. Sebanyak 1-2,0 g sampel pati garut dimasukkan ke dalam selongsong kertas saring yang dialasi dengan kapas. Selongsong kertas yang berisi sampel disumbat dengan kapas, kemudian dike- ringkan dalam oven pada suhu tidak lebih dari 80°C selama ± 1 jam. Selongsong kertas tersebut kemudian dimasukkan ke dalam alat soxhlet yang telah dihu- bungkan dengan labu lemak. Lemak dalam sampel diekstraksi dengan heksana selama ± 6 jam. Heksana disuling sehingga diperoleh ekstrak lemak. Ekstrak lemak di dalam labu lemak kemudian dikeringkan dalam oven 105°C selama 12 jam, kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang beratnya. Penge- ringan diulangi sampai diperoleh bobot tetap. Kadar lemak dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan menggunakan rumus sebagai berikut (persamaan 4 dan 5):
Kadar lemak (%bb) = a – b x 100 (4)
c
Kadar lemak (%bk) = Kadar lemak (%bb) x 100 (5)
54 dengan: a = bobot labu lemak setelah proses ekstraksi (g); b = bobot labu lemak sebelum proses ekstraksi (g); dan c = bobot sampel (g)
3.4.1.4. Kadar Protein (960.52 AOAC 1998)
Kadar protein pati garut dianalisis dengan menggunakan metode Kjeldahl. Sebanyak 100-250,0 mg sampel dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl kemudian ditambahkan dengan 1,9 ± 0,1 g K2SO4, 40,0 ± 10 mg HgO, 2,0 ± 0,1 mL H2SO4
pekat, dan 2-3 butir batu didih. Sampel dipanaskan dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai mendidih selama 1-1,5 jam sampai diperoleh cairan jernih. Setelah didinginkan, isi labu dipindahkan ke dalam labu destilasi dengan dibilas menggunakan 1-2,0 mL air destilata sebanyak 5-6 kali. Air cucian dipindahkan ke labu destilasi kemudian ditambahkan dengan 8-10,0 mL larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3. Di tempat yang terpisah, 5,0 mL larutan H3BO3 dan 2-4 tetes indikator
merah metil-biru metil dimasukkan ke dalam erlenmeryer. Labu erlenmeyer kemudian diletakkan di bawah kondensor dengan ujung kondensor terendam di bawah larutan H3BO3. Proses destilasi dilakukan sampai diperoleh sekitar 15,0
mL destilat. Destilat yang diperoleh diencerkan sampai 50,0 mL dengan akuades, kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N yang telah distandarisasi sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Volume larutan HCl 0,02 N terstandar yang digunakan untuk titrasi dicatat. Tahap yang sama dilakukan untuk larutan blanko sehingga diperoleh volume larutan HCl 0,02N untuk blanko. Kadar protein dihitung berdasarkan kadar nitrogen (%N) (persamaan 6). Kadar protein dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan menggunakan faktor koreksi 6,25 sebagai berikut (persamaan 7 dan 8):
Kadar N (%) = (v1 – v2) x NHCl x 14,007 x 100 (6) w
dengan : v1= volume larutan HCl untuk sampel (mL); v2=volume larutan HCl untuk blanko (mL); NHCl= konsentrasi larutan HCl (0,02N), w=berat sampel (mg)
Kadar protein (% bb) = % N x faktor konversi (6,25) (7)
Kadar protein (%bk) = kadar protein (%bb) x 100 (8)
55
3.4.1.5. Kadar Karbohidrat
Kadar karbohidrat dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan metode by difference (persamaan 9 dan 10).
Kadar karbohidrat (%bb) = 100–(% air+% abu+% lemak+% protein) (9) Kadar karbohidrat (%bk) = kadar karbohidrat (%bb) x 100 (10)
(100 - kadar air)
3.4.2. Kadar Total Gula dan Pati (Dubois et al. 1956)
Kadar total gula dan pati sampel pati garut dianalisis dengan menggunakan metode fenol sulfat yang mencakup tahapan pembuatan kurva standar larutan glu- kosa, persiapan sampel, dan analisis sebagai berikut.
Pembuatan Kurva Standar Larutan Glukosa
Larutan glukosa murni (0,5 mL) yang masing-masing mengandung 0,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 70,0 dan 80,0 µg larutan glukosa ditempatkan dalam tabung reaksi. Ke dalam masing-masing tabung reaksi tersebut ditambah- kan 0,5 mL fenol 5%, kemudian diaduk dengan menggunakan vorteks. Sebanyak 2,5 mL larutan H2SO4 pekat ditambahkan secara cepat ke dalam tabung reaksi
tersebut (terjadi reaksi eksoterm yang menghasilkan panas). Larutan tersebut didiamkan selama 10 menit, kemudian diaduk lagi dengan vorteks. Sampel disim- pan pada suhu ruang selama 20 menit sebelum diukur absorbansi dengan spektro- fotometer UV-Vis pada panjang gelombang 490 nm. Persamaan dan kurva standar larutan glukosa dibuat sebagai hubungan antara konsentrasi larutan glukosa (pada sumbu x) dan absorbansi (pada sumbu y).
Persiapan Sampel Analisis Kadar Pati
Sebanyak 1 g pati dimasukkan secara perlahan ke dalam 100 mL etanol 95% dan dihomogenkan menggunakan pengaduk magnetik. Suspensi pati kemu- dian disaring menggunakan kertas saring. Kertas yang berisi residu pati didiam- kan semalam dalam desikator. Residu pati ditimbang sehingga diketahui beratnya untuk menghitung pati pada sampel sebelum mengalami pencucian dengan etanol. Setelah pati kering, pati yang terdapat dalam kertas saring diambil, kemudian dihaluskan dengan mortar. Sebanyak 40 mg pati yang telah dihaluskan ditambah
56 dengan 20 ml akuades, lalu diotoklaf pada suhu 105oC selama 1 jam. Setelah diotoklaf, sampel didinginkan pada suhu kamar lalu diencerkan sebanyak 40 kali.
Analisis Sampel
Sebanyak 0,5 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,5 mL fenol 5% dan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks. Sebanyak 2,5 mL larutan H2SO4 pekat lalu ditambahkan secara cepat ke dalam
tabung reaksi, sehingga terjadi reaksi eksoterm yang menghasilkan panas. Larutan sampel kemudian didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang, diaduk dengan vorteks dan didiamkan kembali selama 20 menit pada suhu ruang. Nilai absor- bansi diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 490 nm. Kadar glukosa (µg/mL) ditentukan dengan menggunakan kurva standar. Kadar total gula (%bb) diperoleh dari kurva standar, sedangkan kadar pati (%bb) dihi- tung dengan mengalikan kadar total gula dengan faktor 0,9.
3.4.3. Kadar Amilosa (IRRI 1978)
Kadar amilosa dianalisis dengan metode spektroskopi. Analisis kadar ami- losa mencakup tahapan pembuatan kurva standar larutan amilosa dan analisis sampel sebagai berikut.
Pembuatan Kurva Standar Amilosa
Sebanyak 40,0 mg amilosa murni dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalam labu tersebut kemudian ditambahkan 1,0 mL etanol 95% dan 9,0 mL larutan NaOH 1 N. Labu takar kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 95oC selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel amilosa yang terben- tuk ditambah dengan akuades sampai tanda tera. Larutan amilosa ini digunakan sebagai larutan stok amilosa standar.
Dari larutan stok amilosa standar tersebut dipipet 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL untuk dipindahkan masing-masing ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalam masing-masing labu takar tersebut kemudian ditambahkan 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mL larutan asam asetat 1 N. Sebanyak 2,0 mL larutan iod (0,2 g I2 dan 2,0 g
KI yang dilarutkan dalam 100,0 mL air destilata) dipipet ke dalam setiap labu, lalu ditambahkan air destilata hingga tanda tera. Larutan dibiarkan selama 20 menit dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
57 gelombang 625 nm. Persamaan dan kurva standar dibuat sebagai hubungan antara kadar amilosa (sumbu x) dan absorbansi (sumbu y).
Analisis Sampel
Sebanyak 100,0 mg sampel pati garut dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, kemudian ditambahkan 1,0 mL etanol 95% dan 9,0 mL larutan NaOH 1 N. Labu takar ini lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 95ºC selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel pati ditambahkan air destilata sampai tanda tera dan dihomogenkan. Dari labu takar ini dipipet 5,0 mL larutan gel pati dan dipindahkan ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalam labu takar tersebut kemudian ditambahkan 1,0 mL larutan asam asetat 1 N dan 2,0 mL larutan iod, lalu ditam- bah akuades hingga tanda tera. Larutan sampel ini dibiarkan selama 20 menit pada suhu ruang sebelum diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 625 nm. Kadar amilosa (dalam persen) ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva standar larutan amilosa.
3.4.4. Kadar Gula Pereduksi (Takeda et al. 1993)
Kadar gula pereduksi sampel dianalisis dengan metode Park-Johnson yang terdiri atas tahapan pembuatan kurva standar gkukosa, persiapan sampel, dan analisis sampel sebagai berikut.
Pembuatan Kurva Standar Larutan Glukosa
Sebanyak 1,0 mL larutan glukosa murni yang masing-masing mengandung 0,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; dan 10,0 µg glukosa dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 0,5 mL bufer sodium karbonat-sodium hidrogen karbonat dan 0,5 mL larutan potasium ferisianida. Sampel dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit kemudian didinginkan dalam air mengalir selama 10 menit. Selanjutnya 5,0 mL larutan ferri-amonium sulfat ditambahkan ke dalam sampel, kemudian dia- duk dengan menggunakan vorteks. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit. Sampel diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV- Vis pada panjang gelombang 715 nm. Persamaan dan kurva standar larutan glu- kosa dibuat sebagai hubungan antara konsentrasi larutan glukosa (pada sumbu x) dan absorbansi (pada sumbu y).
58
Persiapan Sampel
Sebanyak 1,0 g pati dimasukkan secara perlahan ke dalam 100,0 mL etanol 95% dan dihomogenkan dengan menggunakan pengaduk magnetik. Suspensi pati tersebut kemudian disaring menggunakan kertas saring. Kertas yang berisi residu pati didiamkan semalam di dalam desikator. Setelah kering, pati yang terdapat dalam kertas saring diambil, lalu dihaluskan dengan mortar. Sebanyak 40,0 mg pati yang telah dihaluskan ditambahkan dengan 20,0 mL akuades, kemudian dipanaskan dalam otoklaf 105oC selama 1 jam. Setelah pemanasan selesai, pasta pati didinginkan pada suhu kamar dan dilakukan 40 kali pengenceran sebelum digunakan.
Analisis Sampel
Sebanyak 1,0 mL larutan pati dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 0,5 mL bufer sodium karbonat-sodium hidrogen karbonat dan 0,5 mL larutan kalium ferisianida. Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit kemudian didinginkan dalam air mengalir selama 10 menit. Sebanyak 2,5 mL larutan feri- amonium sulfat ditambahkan ke dalam larutan sampel kemudian diaduk dengan vorteks. Larutan sampel tersebut lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit dan diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 715 nm. Gula pereduksi (dalam persen) ditentukan dengan mengguna- kan persamaan kurva standar larutan glukosa.
3.4.5. Kadar Pati Resisten (Goñi et al. 1996)
Kadar pati resisten sampel dianalisis dengan metode spektroskopi yang mencakup tahapan pembuatan kurva standar glukosa dan analisis sampel sebagai berikut.
Pembuatan Kurva Standar Glukosa
Kurva standar glukosa ditentukan dengan menggunakan kit glukosa. Larutan glukosa standar dengan konsentrasi 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; dan 2,0 mg/mL disiapkan. Sebanyak 10 μL dari masing-masing larutan glukosa standar tersebut ditambahkan kit bufer sebanyak 500 μL dan 500 μL akuades. Sampel diinkubasi dahulu pada suhu 37oC selama 5 menit sebelum diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 525 nm.
59
Analisis Sampel
Sebanyak 50,0 mg pati dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, lalu ditam- bahkan 5,0 mL larutan bufer KCl-HCl pH 1,5 dan 0,1 mL pepsin (4000 U/10 mL bufer KCl-HCl). Setelah diaduk dengan menggunakan vorteks, sampel diinkubasi pada suhu 40oC selama 60 menit pada penangas bergoyang. Sampel kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Sebanyak 4,5 mL larutan bufer fosfat pH 6,9 dan 0,5 mL larutan porcine α- amilase (15,2 mg α-amilase per mL bufer fosfat) ditambahkan ke dalam sampel. Sampel kemudian diaduk dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam sambil terus digoyang. Setelah sampel disentrifus (15 menit, 3000 g), bagian residu diambil dan dicuci dengan 10,0 mL akuades. Proses sentrifusi diu- lang lagi dengan cara yang sama seperti di atas dan residunya kembali diambil dan dicuci.
Ke dalam residu sampel di atas ditambahkan 3,0 mL akuades dan 1,5 mL larutan KOH 4 M, lalu diaduk dengan menggunakan vorteks dan didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Secara berturut-turut ke dalam sampel tersebut ditambahkan 2,75 mL 2 M HCl dan 1,5 mL bufer sodium asetat pH 4,75, dan 40 µl enzim amiloglukosidase. Sebelum diinkubasi pada suhu 60oC selama 45 menit, sampel diaduk dengan menggunakan vorteks dalam penangas air bergoyang. Sam- pel disentrifus (15 menit, 3000 g), kemudian bagian supernatan diambil dan dima- sukkan ke dalam labu takar. Bagian residu dicuci dengan 10 mL akua-des, lalu disentrifus kembali. Bagian supernatan kemudian dicampurkan dengan supernatan sebelumnya. Sebanyak 25-1000,0 mL sampel diencerkan dengan akua-des (ting- kat pengenceran tergantung pada kandungan pati resisten dalam sampel). Kadar glukosa (mg) yang terkandung di dalam sampel diukur dengan menggunakan kit glukosa. Kadar pati resisten (%bb) dihitung dengan mengalikan kadar glukosa dalam sampel dengan faktor 0,9.
3.4.6. Daya Cerna Pati in Vitro (Anderson et al. 2002)
Daya cerna pati in vitro dianalisis secara spektroskopi yang mencakup tahapan pembuatan kurva standar maltosa dan analisis sampel sebagai berikut.
60
Pembuatan Kurva Standar Larutan Maltosa
Sebanyak 1,0 mL larutan maltosa standar yang mengandung 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mg maltosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup, kemu- dian ditambahkan masing-masing 2,0 mL larutan dinitrosalisilat (DNS). Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 12 menit, lalu segera didinginkan dengan air mengalir. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 10 mL akuades, kemudian diaduk hingga homogen dengan menggunakan vorteks. Sampel diukur absorban- sinya dengan spektrotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm.
Analisis Sampel
Sebanyak 1,0 g sampel pati garut dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 mL, lalu ditambahkan dengan 100,0 mL akuades. Labu erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan dalam penangas air hingga mencapai suhu 90oC sambil terus diaduk, lalu didinginkan. Sebanyak 2,0 mL larutan sampel tersebut dipipet ke dalam tabung reaksi bertutup, lalu ditambahkan 3,0 mL akuades dan 5,0 mL larutan bufer fosfat pH 7,0. Masing-masing sampel dibuat dua kali, yang salah satunya digunakan sebagai blanko. Tabung ditutup dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 15 menit. Larutan sampel dan blanko diangkat dan ditam- bahkan 5,0 mL larutan enzim α-amilase (1 mg/mL dalam larutan bufer fosfat pH 7,0). Kedua tabung tersebut diinkubasi kembali selama 30 menit, lalu dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup berisi 2,0 mL larutan DNS (asam dinitrosalisilat). Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 12 menit, lalu segera didinginkan dengan air mengalir. Sebanyak 10,0 mL akuades kemudian ditambahkan, lalu dia- duk hingga homogen dengan menggunakan vorteks. Larutan sampel dan blanko tersebut kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm. Daya cerna pati (dalam persen) dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut (persamaan 11):
Daya cerna pati (%bb) = A – a x 100 (11)
B – b
dengan : A = maltosa dalam sampel (mg); a= maltosa dalam blanko (mg), B = maltosa dalam pati murni (mg); b = maltosa dalam blanko pati murni (mg).
61
3.4.7. Analisis Profil Gelatinisasi Pati (RVA Standar 2)
Profil gelatinisasi pati garut alami dianalisis dengan menggunakan Rapid Visco Analyzer (RVA). Sebanyak 3,0 g sampel (berat kering) ditimbang dalam wadah RVA, lalu ditambahkan 25,0 g akuades. Pengukuran dengan RVA menca- kup fase proses pemanasan dan pendinginan pada pengadukan konstan (160 rpm). Pada fase pemanasan, suspensi pati dipanaskan dari suhu 50oC hingga 95oC dengan kecepatan 6oC/menit, lalu dipertahankan pada suhu tersebut (holding)
selama 5 menit. Setelah fase pemanasan selesai, pasta pati dilewatkan pada fase pendinginan, yaitu suhu diturunkan dari 95oC menjadi 50oC dengan kecepatan 6oC/menit, kemudian dipertahankan pada suhu tersebut selama 2 menit. Instrumen RVA memplot kurva profil gelatinisasi sebagai hubungan dari nilai viskositas (cP) pada sumbu y dengan perubahan suhu (oC) selama fase pemanasan dan pendi- nginan pada sumbu x (Gambar 21).
Gambar 21. Profil kurva gelatinisasi pati dengan Rapid Visco Analyzer (RVA)
Data yang diperoleh dari pengukuran RVA adalah suhu awal gelatinisasi (SAG), viskositas puncak atau maximum viscosity (MV), viskositas pada 95oC atau hot paste viscosity (HPV), viskositas breakdown (VB), viskositas setelah mencapai suhu 50oC, viskositas akhir setelah dipertahankan di 50oC atau cold paste viscosity (CPV), viskositas setback atau setback viscosity (SV), dan stabili-
62 tas pengadukan pada 50oC. SAG (oC) adalah suhu pada saat nilai viskositas mulai terbaca yang menandakan pati mulai mengalami gelatinisasi. MV diukur saat pasta pati mencapai viskositas maksimum selama fase pemanasan. VB menunjuk- kan kestabilan viskositas terhadap pemanasan yang dihitung dari selisih antara PV dengan HPV. SV menunjukkan kecenderungan pati untuk mengalami retrogra- dasi yang dihitung sebagai selisih antara CPV dengan HPV. Tipe profil gelatini- sasi pati selanjutnya ditentukan berdasarkan pengelompokan oleh Schoch dan Maywald (1968).
3.4.8. Analisis Morfologi Pati
Perubahan morfologi pati garut sebelum dan setelah perlakuan modifikasi diamati dengan menggunakan mikroskop polarisasi dan Scanning Electron Microscope (SEM) sebagai berikut.
3.4.8.1. Mikroskop Polarisasi (Ridal 2003)
Pati garut alami dibuat suspensi encer dengan melarutkan 1 sudip sampel dalam + 20 mL air. Selanjutnya beberapa tetes suspensi diambil dan diletakkan di atas sebuah gelas objek. Gelas penutup dipasang, lalu preparat diamati dengan menggunakan mikroskop polarisasi cahaya pada skala pembesaran 200 kali dan gambar yang teramati dipotret dengan kamera dan foto granula pati yang dihasil- kan dicetak pada film. Ukuran granula pati dibaca dari gambar (dalam satuan μm).
3.4.8.2. Scanning Electron Microscope (Srichuwong 2006)
Morfologi permukaan granula pati garut sebelum dan setelah modifikasi diamati di bawah Scanning Electron Microscope (SEM).Serbuk pati diletakkan di atas tempat sampel dengan menggunakan isolasi double-side. Sampel kemudian dilapisi dengan emas, lalu dimasukkan ke dalam instrumen SEM. Struktur pati diamati di layar monitor dengan menggunakan skala pembesaran 500 dan 800 kali. Hasil pengamatan kemudian difoto dengan menggunakan kamera digital.
3.4.9.Analisis Perubahan Struktur Pati Garut
Perubahan struktur pati garut sebelum dan setelah perlakuan modifikasi diamati dengan menganalisis distribusi amilosa dan amilopektin dengan GPC dan distribusi panjang rantai amilopektin dengan FACE sebagai berikut.
63
3.4.9.1. Distribusi Amilosa dan Amilopektin (Sunarti et al. 2001; Ozturk et al. 2009)
Analisis distribusi amilosa dan amilopektin dilakukan dengan menggunakan
Gel Permeation Chromatography (GPC). Analisis mencakup tahapan persiapan sampel dan injeksi sampel ke dalam GPC.
Persiapan Sampel
Tahapan persiapan sampel bertujuan menghilangkan lemak dalam sampel pati garut. Sebanyak 2,0 g sampel disuspensikan ke dalam 40 mL dimetil sulfok- sida (DMSO) dan disimpan pada penangas bergoyang pada suhu 37oC selama 12 jam. Suspensi sampel kemudian dituangkan sedikit demi sedikit ke dalam 100,0 mL etanol dan disimpan pada suhu 4oC selama selama 12 jam. Sampel disaring dengan menggunakan 3G-4 glass-filter dan dicuci 4 kali dengan etanol. Sampel kemudian dikeringkan di dalam desikator.
Injeksi Sampel ke Dalam GPC
Sampel pati garut yang sudah dihilangkan lemaknya (40,0 mg) ditimbang dan ditambahkan 20,0 mL akuades dalam tabung sentrifus 15 mL, sehingga diper- oleh konsentrasi suspensi pati 2,0 mg/mL. Tabung sentrifus berisi sampel tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan di dalam otoklaf pada suhu 105oC selama 1 jam. Larutan pati diaduk dengan vorteks, lalu disentrifusi pada 1.000g selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang diperoleh kemu- dian dianalisis total karbohidratnya dengan metode fenol-sulfat (Dubois et al.
1956) sebelum diinjeksikan dalam kolom GPC. Total karbohidrat yang diinjeksi- kan ke dalam kolom memiliki konsentrasi antara 4-6 mg per 10 mL. Fase gerak yang digunakan adalah 50 mM NaCl. Kondisi yang digunakan dalam analisis GPC adalah sebagai berikut.
Gel : Toyopearl HW-65S (Tosoh Co, Japan)
Ukuran sampel : 2,6 cm ID x 100 cm
Eluen : NaCl 50 mM
Laju alir : 60 ml/jam Volume/tabung : 10,0 ml Volume injeksi : 10,0 ml
64 Sampel pada setiap nomor fraksi dari hasil pemisahan GPC ditampung dan dianalisis kadar total karbohidratnya dengan menggunakan metode fenol-sulfat (Dubois et al. 1956). Persentase nisbah karbohidrat ditentukan dari kadar total karbohidrat setiap nomor fraksi dibagi dengan total jumlah karbohidrat seluruh nomor fraksi. Selanjutnya dibuat plot hubungan antara nomor fraksi (pada sumbu x) dan persen nisbah karbohidrat (pada sumbu y). Kurva GPC dikelompokkan menjadi dua (2) kelompok fraksi (I dan II). Fraksi I merupakan penjumlahan dari nomor fraksi 1-30 dan fraksi II dari nomor fraksi 31-48. Masing-masing fraksi I