Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul purifikasi dan karakterisasi xilanase ekstraseluler Streptomyces sp.SKK1-8asal Sukabumi adalah benar hasil karya sayasendiri denngan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, September 2007
Nunuk Widhyastuti G351040101
ABSTRACT
NUNUK WIDHYASTUTI. G3501040101. Purification and Characterization of
Streptomyces sp SKK1-8 Extracellular Xylanase from Sukabumi. Under the direction of ANJA MERYANDINI and YULIN LESTARI.
Hemicelluloses, consist of mainly xylans, are the second most abundant polysaccharides on earth and renewable organic carbon. Bioconversion of hemicelluloses by enzymatic process to valuable products has recieved much attention. Xylanase catalyzes the hydrolysis of 1,4-β-glycosidic bound from xylans into small oligomers and xylose residues. Xylanolytic enzymes and its hydrolysis products have potential application in various agro-industrial processes such as in the pulp and paper industries, food and chemical industries, agriculture and poultry. This research was focused on purification and characterization of xylanase from
Streptomyces sp SKK1-8.
Selective precipitation and isolation of xylanase were studied using ammonium sulphate, aceton and anionic polimer eudragit S100. The results indicated that ammonium sulphate and polimer eudragit S100 were not effective for xylanase precipitation. Therefor, xylanase was precipitated with 50-80% acetone.
Xylanase was purified by the procedures of aceton precipitation, gel filtration (Sephadex G100) and anion exchange chromatography (DEAE-Sephadex A-50). The purity of xylanase increased 12.97 fold than those of the crude enzyme. The specific activity after purification was 1.3817 U/mg. The purified xylanase contains two proteins with the estimated molecular weights of 14.4 kDa and 13.4 kDa as shown on native PAGE and SDS-PAGE stained with silver nitrate.
The purified xylanase had different characters from crude xylanase. The activity of purified xylanase was optimal at 50 oC, pH 4.5. The xylanase maintained its stability at 50 oC and over pH range from pH 4.0 – 8.5. The activity and stability of the enzyme were influenced by the buffer system used. Strong inhibition of xylanase activity was observed when Sr2+, Ag2+ and Ba2+ were added to the enzyme reaction mixture, but Cu2+ dan Zn2+ activated the enzyme. The xylanase was capable of hydrolising p-NP-β-D-xylanopiranoside, p-NP-α-L-arabinofuranoside, p-NP-α-D- glucopiranoside and p-NP-α-D-galactopiranoside, but not p-NP-acetate. The capability of hydrolising four kinds of substrates indicated that this purified xylanase had bifungtional activity. The Km and Vmax values at 50 oC measured on birchwood xylan were 0.101 (mg/ml) and 0.1796 (μmoles xilosa/menit/ml) respectively.
RINGKASAN
NUNUK WIDHYASTUTI. G3501040101. Purifikasi dan Karakterisasi Xilanase Ekstraseluler Streptomyces sp. SKK1-8 Asal Sukabumi. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan YULIN LESTARI
Hemiselulosa merupakan heteropolimer yang keberadaaannya di alam kedua terbanyak setelah selulosa. Kadar hemiselulosa pada tanaman mencapai 20-30% berat kering kayu. Saat ini sebagian besar limbah hemiselulosa masih belum dimanfaatkan secara optimal padahal berpotensi untuk diolah menjadi berbagai produk yang lebih bernilai ekonomi. Komponen utama hemiselulosa adalah xilan yang memiliki tulang punggung rantai D-xilopiranosa dengan ikatan glikosidik β-1,4. Residu O-asetil, arabinosil dan 4-O-metil asam glukoronat terikat pada tulang punggung xilan. Kadar dan komposisi xilan pada tanaman bervariasi tergantung pada jenis tanaman. Diperlukan kerja sinergi dari beberapa enzim xilanolitik untuk mendegradasi secara lengkap struktur xilan yang kompleks menjadi monomernya.
Xilanase merupakan enzim kompleks yang terdiri atas 1,4-β-endoxilanase, β- xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam fenolat esterase. Xilanase dan produk hidrolisisnya memiliki potensi untuk diaplikasikan dalam berbagai industri. Xilanase dapat diaplikasikan pada industri kertas, pangan, peternakan dan pengolahan limbah. Xilitol, furfural, xilooligosakarida dan asam glukuronat merupakan produk hidrolisis xilanase yang berpotensi untuk diaplikasikan pada industri pangan, farmasi dan kimia.
Xilanase dihasilkan oleh bakteri, cendawan dan khamir. Streptomyces adalah bakteri Gram positif yang membentuk miselium dan telah digunakan untuk mensintesis senyawa antibiotik, metabolit sekunder lain dan enzim dalam skala industri. Beberapa Streptomyces asal Indonesia diketahui berpotensi sebagai penghasil xilanase, diantaranya Streptomyces sp. 1141-1, Streptomyces sp. 234P-16,
Streptomyces sp 451-3 dan Streptomyces sp SKK1-8.
Xilanase memiliki karakter yang bervariasi. Xilanase bakteri biasanya bersifat netral sampai alkali sedangkan xilanase cendawan bersifat asam. Pada umumnya suhu optimal xilanase antara 40-60 oC, namun xilanase beberapa mikroba diketahui bersifat thermostabil. Studi mengenai karakter xilanase perlu dilakukan untuk mengetahui aplikasi xilanase pada industri yang sesuai. Misalnya xilanase yang digunakan dalam proses bleaching pada industri pulp harus memiliki pH optimum alkali dan stabil pada pH tersebut, bersifat thermostabil dan tidak terkontaminasi selulase.
Xilanase fraksi aseton Streptomyces sp SKK1-8 memiliki karakter yang menarik sehingga dirasa perlu untuk dilakukan pemurnian Karakter tersebut diantaranya yaitu reaksi enzimatisnya optimum pada suhu 50 oC, memiliki aktivitas pada rentang pH yang luas, stabil pada penyimpanan selama 1 bulan dalam refrigerator dan bebas dari selulase. Xilosa dan arabinosa merupakan produk hidrolisis birchwood xilan oleh xilanase tersebut. Hasil SDS-PAGE dan zimogram
menunjukkan adanya tiga pita xilanase yang berdekatan dengan berat molekul 16.80 kDa, 15.21 kDa dan 13.86 kDa.
Dewasa ini penggunaan polimer Eudragit S100 pada tahap awal pemurnian telah dikembangkan. Eudragit S100 merupakan polimer asam metakrilat dan metilmetakrilat yang mengalami perubahan kelarutan tergantung dari pH larutan. Pada kondisi di atas pH 5.5 eudragit S100 bersifat larut sedangkan di atas pH tersebut akan mengendap. Hasil pengujian menunjukkan bahwa Eudragit S100 tidak efektif untuk memisahkan xilanase Streptomyces sp SKK1-8 dari senyawa pengotornya. Sebanyak 40.6% xilanase tidak terikat oleh polimer tersebut dan hanya 5.9% yang dapat dielusi dengan 0.1 M bufer fosfat pH 7.5 yang mengandung 1M NaCl dan 0.2% Triton X-100.
Pengendapan xilanase dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat dan aseton. Xilanase Streptomyces sp SKK1-8 mengendap maksimal pada konsentrasi 90% amonium sulfat dengan aktivitas sebesar 8.872 U/ml dan pemulihan 25%. Xilanase yang diendapkan dengan aseton mulai mengendap pada konsentrasi 60% dan maksimal pada konsentrasi 80% dengan aktivitas sebesar 33.606 U/ml dan pemulihan 96%.
Semipurifikasi xilanase Streptomyces sp SKK1-8 dilakukan dengan filtrasi gel (matrik Sephadex G100) dan kromatografi penukar ion (matrik DEAE-Sephadex. A50). Hasil SDS-PAGE dan native PAGE menunjukkan adanya 2 pita protein yang memiliki BM sekitar 43.2 kDa dan 39.2 kDa. Kemurnian xilanase hasil kromatografi meningkat 12.97 kali dibandingkan aktivitas enzim kasarnya dengan aktivitas spesifik sebesar 1.3817 U/mg.
Proses pemurnian merubah sebagian karakter xilanase Streptomyces sp. SKK1-8 sehingga berbeda dengan karakter xilanase hasil pengendapan dengan aseton. Karakter yang berubah yaitu pH optimum reaksi enzimatis dan pengaruh 1 mM kation terhadap aktivitas xilanase. Xilanase hasil pemurnian memiliki aktivitas optimum pada pH 4.5 dan suhu 50 oC, stabil pada rentang pH 4-8.5 dan suhu 50 oC. Aktivitas dan stabilitas xilanase dipengaruhi baik oleh pH maupun jenis bufer yang digunakan. Aktivitas xilanase dihambat oleh adanya 1 mM Ag2+, Ba2+, Ca2+, Co2+, K+, Na+ dan Sr2+, diaktivasi oleh 1 mM Cu2+ dan Zn2+, dan relatif tidak terpengaruh oleh 1 mM Fe3+ dan Ni2+. Nilai Km dan Vmax xilanase pada substrat birchwood xilan berturut-turut yaitu 0.101 (mg/ml) dan 0.1796 (μM/menit/ml).