Dengan ini saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang berjudul Rizobakteria Bacillus sp. asal tanah rizosfer kedelai yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, adalah hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis.
Bogor, November 2007
Rina Puji Astuti
Soybean that Potential for Plant Growth Promotion. This thesis is advised by ARIS TRI WAHYUDI and ANJA MERYANDINI.
Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) belonging to Bacillus sp. were isolated from the rhizosphere of soybean plant. The aims of this study were to isolate and caracterize Bacillus sp. from the rhizosphere of soybean plant that potential for promoting of plant growth. 118 isolates that were comfirmed as
Bacillus sp., 90 isolates among them positively produced indole acetic acid (IAA), that 3.58 ppm was the lower, 19.18 ppm was moderate and the highest concentration was 67.29 ppm. 12 isolates significantly induced elongation of primary root, numerous of lateral root and shoot growth. 76 isolates were able to solubilize phosphate and 77 isolates produced siderophore. Isolat Bacillus sp. Cr- 55 produced antifungal compound that inhibited growth of Sclerotium rolsfii. There were 18 isolates of Bacillus sp., include Cr-55, that inhibited Fusarium oxysporum. There were 5 characters of PGPR observed of this study: IAA synthesis, phosphat solubelizing, siderophore production, biocontrol and promoting of soybean growth significantly. The result showed that 3 isolates of
Bacillus sp. (Cr-24, Cr-44, and CR-66), at least had 4 characters of PGPR and potential for PGPR agent. We suggest these isolates of Bacillus sp. can be recommended as inoculants soybean plant to promote plant growth and to inhibit pathogenic fungi.
RINGKASAN
RINA PUJI ASTUTI. Rizobakteria Bacillus sp. Asal Tanah Rizosfer Kedelai yang Berpotensi sebagai Pemacu Pertumbuhan Tanaman. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan ANJA MERYANDINI.
Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) merupakan bakteri tanah di sekitar perakaran. PGPR berpotensi meningkatkan produktivitas dan pertumbuhan tanaman. PGPR dapat memberi keuntungan bagi pertumbuhan tanaman dengan menggunakan kemampuannya dalam memproduksi hormon pertumbuhan, seperti asam indol asetat, asam giberelin, sitokinin dan etilen. Selain itu beberapa rizobakteria juga memiliki kemampuan dalam menambat N2,
menekan pertumbuhan mikroorganisme fitopatogen dengan cara memproduksi siderofor, β-1-3-glukanase, kitinase, antibiotik dan sianida serta kemampuannya dalam melarutkan fosfat. Kemampuan tersebut bermanfaat bagi tumbuhan untuk memenuhi kebutuhan ketersediaan fosfat, sedangkan siderofor yang diproduksi oleh rizobakteria dapat memacu pertumbuhan tanaman dengan cara mengikat besi (Fe3+) yang jumlahnya terbatas di daerah rizosfer untuk berkompetisi dengan mikrob fitopatogen.
Bacillus sp. dapat menghasilkan fitohormon yang digunakan tumbuhan untuk membantu pertumbuhan baik pemanjangan akar, perkecambahan biji maupun meningkatkan perkembangan tajuk dan pembungaan. Peran Bacillus sp. dalam memproduksi asam indol asetat telah diteliti, namun informasi tentang kesatuan karakter Bacillus sp. sebagai pemacu pertumbuhan tanaman belum banyak dilaporkan. Untuk mengatasi masalah tersebut maka pada penelitian ini akan difokuskan pada isolasi beserta karakterisasi Bacillus sp. baik produksi IAA dan karakter lain yang berkaitan dengan pemacuan pertumbuhan tanaman.
Penelitian ini dikerjakan dengan mengisolasi Bacillus sp. Sebanyak 0.5 gram sampel tanah rizosfer kedelai asal Cirebon dimasukkan ke dalam 4.5 ml akuades steril yang sudah terlarut NaCl 0.85 % di dalamnya. Sampel divortek dan dipanaskan 80 oC selama 10 menit, untuk menyeleksi Bacillus sp. dari mikroorganisme lain yang tidak membentuk endospora. Sampel selanjutnya diencerkan berseri hingga pengenceran 10-6. Sebanyak 100 µl dari suspensi pengenceran disebar di atas media cawan nutrien agar-agar dengan komposisi (8 gr Nutrient Broth (NB), 20% bacto agar dalam 1 liter akuades) menggunakan batang penyebar. Cawan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Koloni yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan menggunakan media yang sama. Pewarnaan Gram, pewarnaan endospora dan uji katalase dilakukan mengikuti
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology untuk menentukan isolat tersebut termasuk ke dalam kelompok Bacillus sp.
Produksi IAA dilakukan dengan menggunakan metode standar yaitu dengan mengkulturkan terlebih dahulu 1 lup penuh isolat Bacillus sp. pada media NB dengan penambahan L-Trp dan diinkubasi selama 48 jam. Tiap 1 jam dilakukan pengukuran kadar IAAnya. Pengukuran IAA ini digunakan untuk mengetahui waktu produksi IAA yang paling maksimal.
IAA yang diproduksi oleh Bacillus diukur dengan metode kolorimetri dengan menggunakan reagen Salkowski yang mengandung 150 ml H2SO4 pekat,
kultur dari tiap perlakuan dimasukkan kedalam 2 tabung mikro untuk kemudian disentrifugasi (10.000 rpm) selama 15 menit. Sebanyak 2 ml filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril dan ditambahkan 2 ml reagen
Salkowski.Suspensi kemudian diinkubasi selama 60 menit dalam ruang gelap dan pada suhu ruang. Hal ini dilakukan sebelum diukur serapan IAA nya dengan menggunakan spektrometer (spectronic 20) pada panjang gelombang 510 nm.
Telaah pemacuan pertumbuhan kecambah dilakukan dengan menumbuhkan isolat Bacillus sp. dalam agar-agar nutrien pada suhu ruang selama 24 jam. Inokulan yang akan diuji disiapkan dengan meresuspensikan sel dari cawan agar-agar tersebut ke dalam NB, untuk mencapai konsentrasi sel kira- kira 6.109 sel/ml. Sebanyak 9 kecambah yang telah berukuran 2-3 mm diletakkan di atas media agar-agar 1%. Tiap kecambah diinokulasikan dengan 100 μl suspensi bakteri dan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Sebagai kontrolnya dengan perlakuan yang sama menggunakan NB saja. Setelah 7 hari perlakuan, kemudian diamati dan diukur pertumbuhannya yang meliputi panjang batang, panjang akar utama dan jumlah akar lateral kemudian dibandingkan dengan kontrol. Hasil pengukuran dianalisis secara statistik dengan one-way Analysis of Variance (ANOVA) dan diuji lanjut dengan Duncan menggunakan software SAS.
Kemampuan melarutkan fosfat merupakan salah satu karakter PGPR. Uji ini dilakukan dengan menggunakan metode standar yaitu menggunakan medium Pikovskaya, dengan komposisi glukosa 10 g, Ca3HPO4 5 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KCl
0.2 g, MgSO4.7H2O 0.1 g, ekstrak khamir 0.5 g, MnSO4 25 mgdanFeSO4 25 mg,
serta agar-agar Bacto 20 g dalam 1L akuades. Koloni bakteri uji digoreskan pada media tersebut, zona bening yang dihasilkan disekitar koloni setelah diinkubasi selama 1 sampai 7 hari menunjukkan adanya aktivitas bakteri dalam melarutkan fosfat.
Produksi siderofor merupakan salah satu strategi Bacillus sp. dalam menekan pertumbuhan fitopatogen, yakni dengan mekanisme kompetisi dalam mendapatkan Fe3+. Produksi siderofor oleh Bacillus sp. diuji dengan metode
Chrome Azurol Sulfonat (CAS) agar, dengan modifikasi larutan garam. Larutan 1 (larutan indikator Fe-CAS) mengandung 10 ml (1mM FeCl3.6H2O didalam 10
mM HCL), 50 ml larutan CAS (1.21 mg ml-1), dan 40 ml larutan hexadecyl- trimetylammonium bromide (HDTMA) (1.82 mg ml-1). Larutan 2 merupakan larutan buffer, disiapkan dengan melarutkan 30.24 g PIPES (peperazine-N,N’- bis[2-ethanesulfonic acid]) kedalam 750 ml larutan garam (3 gr KH2PO4, 5 g
NaCl, 10 g NH4Cl, 20 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). Akuades ditambahkan untuk
mencapai volume larutan 800 ml sebelum diukur pH nya hingga 6.8 dengan 50% KOH, kemudian 20 g agar-agar bacto ditambahkan sebelum diautoklaf. Larutan 3 mengandung 2 g glukosa, 2 g manitol dan mikro elemen ( 493 mg MgSO4.7H2O,
11 mg CaCl2, 1.17 mg MnSO4.H2O, 1.4 mg H3BO3, 0.04 mg CuSO4.5H2O, 1.2 mg
ZnSO4.7H2O dan 1.0 mg NaMoO4.2H2O) didalam 70 ml akuades. Larutan 4
berupa 30 ml 10% (w:v) cassamino acid yang disteril dengan membran milipor 0.45 µm. Media ini dibuat dengan mencampurkan larutan 2 dan 4 pada suhu 50 οC setelah sterilisasi, kemudian ditambahkan larutan 3 dan larutan 1 secara perlahan- lahan dan dilakukan homogenisasi dengan menggunakan stirer. Isolat yang telah
diremajakan terlebih dahulu, diuji dengan cara ditotol atau digores pada media agar CAS dengan dua ulangan. Isolat yang mampu memproduksi siderofor akan menghasilkan zona berwarna oranye disekitar koloni setelah diinkubasi selama 24 sampai 72 jam.
Bacillus sp. memiliki sifat biokontrol yang dapat membantu meningkatkan pertumbuhan tanaman yakni dengan menekan pertumbuhan mikroorganisme fitopatogen. Sclerotium rolsfii dan Fusarium oxysporum merupakan fungi fitopatogenik. Uji antagonis dilakukan dengan menggunakan metode standar kultur ganda. Isolat Bacillus sp. digores pada medium Potato Dextros Agar (PDA) dalam cawan petri berdiameter 9 cm, berjarak 3 cm dari kultur fungi Sclerotium rolsfii atau Fusarium oxysporum. Kultur cendawan ditumbuhkan ditengah cawan petri. Kultur dan biakan cendawan diinkubasi selama 4 hari untuk S. rolfsii dan 7 hari untuk F. oxysporum dan diamati perkembangannya. Adanya interaksi antagonis ditandai dengan terbentuknya zona penghambatan antara isolat Bacillus
dengan fungi. Besarnya penghambatan dihitung dalam persen penghambatan menggunakan rumus 1-(a/b) x 100%, dimana a menunjukan jarak antara titik pusat cendawan kearah isolat Bacillus sp., b menunjukan jarak antara titik pusat fungi ke daerah kosong tanpa isolat Bacillus sp.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebanyak 118 isolat Bacillus sp. yang berasal dari rizosfer kedelai asal Cirebon telah berhasil diisolasi. Isolat-isolat ini memiliki karakteristik parsial Gram positif, bentuk sel batang dengan ukuran dan penataan yang berbeda-beda, dan membentuk endospora dengan bentuk dan letak yang bervariasi. Sebanyak 90 isolat Bacillus sp. memiliki kemampuan mensintesis IAA dengan konsentrasi yang beragam. Konsentrasi IAA pada kultur
Bacillus sp. yang ditumbuhkan pada media dengan penambahan L-Trp umumnya lebih tinggi dari pada konsentrasi IAA pada kultur yang ditumbuhkan pada media tanpa penambahan L-Trp. Salah satu Isolat Bacillus sp., Cr-4 mulai memproduksi IAA pada fase log dan berpotensi maksimal dalam memproduksi IAA pada jam ke-25, pada fase stasioner.
Dari 90 isolat tersebut selain memiliki kemampuan mensintesis IAA, beberapa diantaranya juga memiliki kemampuan lain dalam memacu pertumbuhan tanaman melalui pemacuan perpanjangan akar primer, batang, dan akar lateral. Sebanyak 76 isolat Bacillus sp. dari 90 isolat Bacillus sp. tersebut memiliki kemampuan melarutkan fosfat yang terlarut di dalam media Pikovskaya. 77 isolat Bacillus sp. diketahui mampu mengkelat besi dalam media Chrome Azurol Sulfonate (CAS). 18 isolat Bacillus sp. memiliki kemampuan menekan pertumbuhan F. oxysporum dan 1 isolat Bacillus sp. diantaranya mampu menekan pertumbuhan S. rolsfii.
Kesimpulan dari penelitian ini bahwa dua belas isolat Bacillus sp. yang diisolasi dari tanah rizosfer kedelai mempunyai potensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, yaitu Cr-22, Cr-24, Cr-28, Cr-31, Cr-33, Cr-44, Cr-64, Cr- 66, Cr-67, Cr-68, Cr-69, dan Cr-71. Tiga isolat diantaranya yaitu Cr-24, Cr-44 dan Cr-66 merupakan kandidat PGPR yang memiliki karakteristik dapat mensintesis IAA, memacu pertumbuhan perkecambahan secara signifikan, mampu melarutkan fosfat dan menghasilkan siderofor, serta mampu menghasilkan senyawa anti fungi yang dapat menghambat pertumbuhan fungi fitopatogen F. oxysporum. Isolat- isolat tersebut dapat direkomendasikan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan sekaligus sebagai agen biokontrol fungi fitopatogenik pengendali F. oxysporum.
Hak cipta milik IPB tahun 2007 Hak cipta dilindungi undag-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.