Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Infektifitas Fage Litik dari Limbah Cair Rumah Tangga terhadap Enteropathogenic Escherichia coli Resisten Antibiotik adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2009
Rina Hidayati Pratiwi
ABSTRACT
RINA HIDAYATI PRATIWI. Infectivity of Lytic Phage Isolated from Domestic Waste Water to Antibiotics Resistance Enteropathogenic Escherichia coli. Under direction of SRI BUDIARTI and IMAN RUSMANA
Diarrhea is one of the food and water borne diseases. The pediatric diarrhea cases in developing countries were mostly caused by Enteropathogenic
Escherichia coli (EPEC) virotypes. Some strains of EPEC isolated from patients
in Indonesia were resistant to antibiotics tetracycline and ampicilline. In order to reduce potential infection of EPEC from water, application of specific phages is an alternative solution to reduce potential infection of EPEC from water. The objective of the research was to isolate and characterize potential phages that can lyse EPEC K1.1 cells. The phages were isolated from sample of domestic waste water. All isolated phages were tested their ability to form plaques and determined the characteristics and morphology of their capsid protein. Effectiveness of phage infection and lysis impact of EPEC K1.1 cells were also observed. Four isolated phages were specific to EPEC K1.1 strain and a non pathogenic E. coli was not lysed by the phages. The phages destroyed rapidly the cells of EPEC K1.1 at 25 minutes after infection. Cell surface of EPEC K1.1 was attached by many virion (phage particles) and some of the cells was lysed. At 30 minutes after phage infection, most cells of EPEC K1.1 were lysed and cell population of EPEC K1.1 was reduced significantly after five hours of phage infection. Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis showed two types of phage proteins. The proteins of FB3 and FB4 phages had molecular weights of 30-51 kDa and 35-40 kDa respectively. Electron microscope observation showed that the phages have a hexagonal head with size of 81.56 nm in width and 103.11 nm in length.
Keywords: diarrhea, Enteropathogenic Escherichia coli K1.1, bacteriophages, characterization
RINGKASAN
RINA HIDAYATI PRATIWI. Infektifitas Fage Litik dari Limbah Cair Rumah Tangga terhadap Enteropathogenic Escherichia coli Resisten Antibiotik. Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan IMAN RUSMANA.
Penyakit diare merupakan salah satu food borne disease dan water borne
disease yang banyak menimbulkan masalah di Indonesia dan bisa menyebabkan
kematian apabila tidak ditangani dengan baik. Salah satu bakteri penyebab diare yang umum ditemukan dalam tanah dan air dan dapat mencemari makanan ialah bakteri Escherichia coli Enteropatogenik (EPEC). Telah ditemukan bakteri EPEC K1.1 yang diisolasi dari anak-anak penderita diare di Depok diketahui resisten terhadap tetrasiklin dan ampisilin. Bakteri yang resisten terhadap antibiotik bila mencemari sumber air minum dan makanan dan menyebabkan diare akan menyulitkan pengobatan, sehingga diperlukan bakteriofage (fage) yang dapat melisisnya. Penelitian ini bertujuan mengetahui adanya fage litik yang mampu melisis bakteri EPEC K1.1. Hasil penelitian ini diharapkan dapat diaplikasikan sebagai biokontrol pencemaran air dan makanan.
Fage diisolasi dari limbah cair rumah tangga daerah Babakan Raya, di Darmaga Bogor. Isolat fage yang diperoleh dimurnikan dan diproduksi, ditentukan kisaran inang, dilakukan kuantifikasi, karakterisasi protein serta pengamatan morfologi pada TEM. Isolat fage yang telah dikarakterisasi diuji efektifitas dalam melisiskan sel EPEC K1.1 setiap selang waktu 5 jam selama 24 jam dan diamati morfologi lisis EPEC K1.1 oleh fage dengan SEM.
Dalam penelitian ini didapatkan 4 isolat fage yaitu FB1, FB2, FB3, dan FB4, dengan morfologi yang berbeda. Keempat fage tersebut menginfeksi EPEC K1.1 tetapi tidak menginfeksi E.coli non patogen. Berdasarkan pengamatan secara visual, ukuran dan bentuk plak yang terbentuk dari satu isolat fage tampak berbeda dengan isolat fage yang lain. Plak yang terbentuk dari suatu kultur bakteri yang ditumbuhkan di cawan petri merupakan satu parameter penting dari adanya fage pada siklus litik. Plak tersebut terlihat bening yang menandakan adanya zona kerusakan sel. Fage FB4 memiliki ukuran zona bening lebih besar dari pada ketiga isolat fage lainnya. Hal ini menandakan FB 4 memiliki kemungkinan sebagai fage infektif kuat. Kemampuan infeksi dari keempat fage menunjukkan hasil yang berbeda, FB1, 2, 3, 4 secara berurutan adalah 80; 4100; 250;16000 PFU. Dari hasil ini menunjukkan bahwa FB4 memiliki kemampuan infeksi terkuat terhadap EPEC K1.1. Penambahan FB 4 pada kultur EPEC K1.1 yang diinkubasi pada suhu 370 C selama 5 jam dapat menurunkan jumlah populasi EPEC K1.1 sebanyak 22% dan 84 % setelah inkubasi selama 24 jam. Penurunan awal terhadap jumlah sel bakteri diperkirakan merupakan akibat dari kombinasi aksi enzim polysaccharide depolymerase atau lisozim dari fage dalam mendegradasi polimer lipopolisakarida (LPS) sel EPEC K1.1 dengan proses penginfeksian terhadap suatu proporsi populasi bakteri EPEC K1.1.
Pengamatan pada SEM menunjukkan bahwa FB4 dapat memecahkan/melisiskan sel EPEC K1.1 dalam waktu 25 menit. Dalam waktu lebih lama lagi yaitu 30 menit, sel EPEC terlihat hancur. Hal ini menunjukkan bahwa FB4 secara pasti dapat melisiskan bakteri sasaran EPEC K1.1 resisten
tetrasiklin dan ampisilin. Penemuan ini merupakan titik cerah untuk pengendalian bakteri patogen pencemar makanan dan air yang ramah lingkungan. Perlu dicari konsentrasi fage yang efektif dan efisien untuk mengendalikan bakteri karena dalam proses infeksi hingga melisiskan seluruh sel bakteri perlu perbandingan yang tepat antara fage dengan bakteri. Fage yang diinfeksikan ke bakteri dikondisikan dalam siklus litik karena pada siklus litik, tahap adsorpsi, penetrasi, sintesis, dan pematangan berlangsung cepat. Pada siklus ini pula partikel fage keluar dari sel yang diserangnya dengan memecahkan sel tersebut sehingga sel inang mati (lisis).
Fage melekat ke sel yang peka rangsangan pada lokasi spesifik di dinding sel bakteri. Pada bakteri gram negatif, komponen sel yang peka rangsangan ialah protein dan lipopolisakarida yang melapisi lapisan selaput sebelah luar termasuk peptidoglikan. Fage tertentu atau sekelompok fage akan melekat ke reseptor spesifik, dan fage berbeda akan melekat ke reseptor yang berbeda. Beberapa bagian struktural bakteri seperti flagela, pilus, kapsul, teichoicacid, dan LPS dapat menyediakan reseptor spesifik pada bakteri tertentu. Spesifisitas isolat fage yang diperoleh terhadap EPEC K1.1 menunjukkan dugaan bahwa di permukaan sel EPEC K1.1 memiliki reseptor-reseptor yang spesifik terhadap fage.
Protein yang dimiliki oleh keempat isolat fage ini cenderung kecil. Dalam tiap mililiternya, FB1 hanya memiliki 97,5 µg; FB2 82,5 µg; FB3 170 µg; dan FB4 222,5 µg. Setelah dilihat pada SDS-PAGE, terdapat 2 isolat fage (FB3 dan FB4) yang menunjukkan adanya pita protein. Kisaran protein yang diperoleh antara 30-51 kDa. Konsentrasi protein yang cenderung lebih kecil diduga disebabkan oleh mudahnya protein fage terdegradasi oleh protease ekstraselular yang dimiliki sel EPEC K1.1.
Berdasarkan karakteristik isolat FB4 seperti dari ukuran lisisan yang lebih besar; kemampuan dalam menginfeksi sel EPEC K1.1 yang lebih baik; serta lebih tingginya konsentrasi protein FB4 diantara ketiga isolat fage yang lain, maka selanjutnya FB4 diidentifikasi dengan analisis morfologi fage dan pengaruh serta efektifitas fage FB4 dalam melisis sel EPEC K1.1. Analisis morfologi dengan menggunakan TEM pada FB4 menunjukkan morfologi kepala fage yang besar dan berbentuk heksagonal ikosahedral. Lebar kepala fage sebesar 81.56 nm dan panjangnya sebesar 103.11 nm.
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa ada empat isolat fage dari sampel limbah cair rumah tangga yang spesifik terhadap EPEC K1.1. Fage FB4 merupakan fage yang paling kuat menginfeksi EPEC K1.1, memiliki berat molekul protein sebesar 40.2 kDa dan 35.8 kDa, morfologi kepala berbentuk heksagonal ikosahedral, dapat melisis sel EPEC K1.1 pada 25 menit pertama, serta dapat menurunkan populasi EPEC K1.1 setelah 1 jam dan semakin tampak menurun setelah 5 jam berikutnya.
Kata kunci: diare, Escherichia coli Enteropatogenik (EPEC) K1.1, bakteriofage, karakterisasi.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB