Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengembangan Marka Molekuler DNA dalam Identifikasi Sel Gonad Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Menggunakan PCR adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2009
Marlina Achmad NIM C151060021
ABSTRACT
MARLINA ACHMAD. Establishment of DNA Molecular Marker in Gonad Cell Identification of Gouramy (Osphronemus gouramy) and Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Using PCR. Under direction of ODANG CARMAN, and ALIMUDDIN
The technology of fish germ cell transplantation had been established to create broodstock systems by which a target offspring can be produced from a surrogate parent. This technique successfully applied in salmonid. Donor cell for transplantation is derived from transgenic fish carrying green fluorescent protein gene functions as a marker to distinguish the donor from recipient cell. In this study, we developed an alternative technique for identifying gouramy-derived donor cell and nile tilapia as recipient by PCR amplification method using growth hormone (GH) and vasa genes as a molecular marker. Beta actin gene was used as an internal control of DNA loading. The result showed that a specific PCR amplification product of 340 and 300 bp in length was obtained for GH and vasa, respectively. Both of evaluated molecular markers could be used to distinguish the donor cell, and GH marker showed higher sensitivity than vasa marker.
RINGKASAN
MARLINA ACHMAD. Pengembangan Marka Molekuler DNA dalam Identifikasi Sel Gonad Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Menggunakan PCR. Dibimbing oleh ODANG CARMAN, dan ALIMUDDIN.
Teknologi transplantasi sel germinal ikan telah dikembangkan baru-baru ini untuk merekayasa produksi benih ikan melalui induk “semang” (surrogate broodstock. Teknologi induk “semang” tersebut dilakukan dengan cara mentransplantasikan primordial germ cells (PGC) atau sel spermatogonia di dalam rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel transplan berdiferensiasi menjadi telur atau sperma. Pemijahan ikan resipien yang membawa sperma dan telur yang berkembang dari sel donor, akan menghasilkan ikan target. Transplantasi sel germinal dari ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) pada ikan salmon masu (Oncorhynchus masou) menghasilkan anak berupa ikan rainbow trout. Teknik ini berpotensi digunakan untuk merekayasa produksi benih ikan-ikan di Indonesia, khususnya ikan yang matang gonad relatif lambat seperti ikan gurame.
Identifikasi sel donor atau sel tranplan dalam individu ikan resipien umumnya dilakukan dengan cara mengamati pendaran sel transplan yang mengekspresikan gen GFP (Green Fluorescent Protein) mengunakan mikroskop fluorescent. Sel tranplan tersebut diperoleh dari ikan transgenik. Akan tetapi, produksi ikan transgenik membutuhkan waktu yang cukup lama, dan ketersediaan mikroskop fluorescent masih terbatas di Indonesia. Selain dengan GFP, marka PKH26 juga telah digunakan untuk mengidentifikasi sel donor. Akan tetapi, karena harga PKH26 yang relatif mahal, sehingga metode ini kurang efisien diaplikasikan di Indonesia. Dengan demikian, pada penelitian ini ingin dikembangkan metode alternatif yang, yakni menggunakan marka mlebih aplikatifolekuler berupa primer spesifik, yang diamplifikasi dengan PCR. Primer spesifik tersebut didisain dari sekuen gen sebagai marka molekuler untuk ikan donor. Pada ikan gurame, sekuen gen yang tersedia adalah growth hormone (GH) dan vasa. Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi cara alternatif pendeteksi sel gonad donor dalam individu resipien pada proses transplantasi menggunakan PCR.
Tahapan penelitian yang dilakukan untuk mencapai tujuan penelitian, dilakukan dengan empat kegiatan yaitu disain primer, eksraksi DNA, amplifikasi DNA dengan PCR, uji spesivitas primer, dan uji sensitivitas PCR dalam membedakan ikan gurame dan ikan nila. Disain primer spesifik untuk marka GH dan vasa dilakukan dengan menyejajarkan sekuen GH dan vasa gurame dan nila menggunakan program GENETYX versi 7.0. Sebagai kontrol internal loading DNA untuk kedua primer spesifik ikan gurame digunakan beta aktin yang bersifat universal dan dapat mengikat sekuen DNA gurame maupun nila. Primer forward dan reverse β-aktin adalah F (5’-GTGCCCATCTACGAGGGTTA-3’) dan R (5’-TTTGATGTCACGCACGATT-3’). DNA diekstraksi dari potongan sirip ikan gurame, menggunakan KIT (Gentra, Minneapolis, USA) yang dilakukan sesuai prosedur manual KIT. Setelah DNA genom diperoleh, dilanjutkan dengan proses
PCR. Dalam proses PCR, dilakukan optimasi beberapa kombinasi suhu annealing dan durasi ekstensi untuk memperoleh kondisi PCR yang optimal bagi masing- masing primer hasil disain. Suhu annealing yang dicobakan adalah untuk primer GH adalah 58 dan 59oC, sedangkan vasa adalah 59, 60, dan 61oC. Lama waktu ekstensi yang diujikan untuk sama untuk masing-masing primer yaitu 30 dan 45 detik. Setelah kondisi optimal diperoleh, dilanjutkan pada tahap pengujian spesivitas primer hasil disain. Tahap ini dilakukan dengan masing-masing DNA gurame dan nila di PCR, selanjutnya di elektroforesis, dengan harapan hasil amplifikasi menunjukkan pita produk PCR secara spesifik hanya pada ikan gurame. Setelah dilakukan pengujian spesivitas, dilanjutkan pada tahap akhir yakni pengujian sensitivitas PCR dalam membedakan DNA ikan gurame dan DNA ikan nila. Pengujian sensitivitas dilakukan dengan menghitung konsentrasi masing-masing DNA menggunakan GENEQUANT,selanjutnya membuat pencampuran DNA gurame dan nila dengan berbagai rasio secara gradual. Pencampuran DNA dari berbagai rasio di PCR, kemudian di elektroforesis, dengan harapan sensitivitas PCR dapat menunjukkan konsentrasi terendah DNA gurame di dalam DNA nila dengan primer spesifik yang berbeda.
Hasil penyejajaran primer GH diperoleh sepasang primer forward dan reverse spesifik ikan gurame dengan sekuen masing-masing F1GH (5’-TGTTC- TCTGACGGCGTGGTT-3’) dan R1GH (5’-GCAACAAAAAACCACCAGAA- AGAG-3’). Sama halnya GH, dari penyejajaran vasa juga diperoleh sepasang primer forward dan reverse spesifik ikan gurame yakni F2VSGR (5’-TGAAGA- AGAGTGGGAGTAGAAGG-3’) dan R3VSGR (5’-ACGTTCTGTCTGTCAG- ACACATTG-3). Untuk kondisi yang optimal, primer GH menggunakan suhu annealing 58oC dengan durasi ekstensi 45 detik, sedangkan vasa dengan suhu annealing 61oC dan lama waktu ekstensi 45 detik.
Berdasarkan uji spesivitas primer, baik primer GH maupun vasa menunjukkan spesifik hanya bagi DNA ikan gurame saja. Hal ini ditunjukkan dengan pita yang jelas dan konsisten pada masing-masing sampel DNA gurame. Dengan demikian, membuktikan bahwa bahwa primer GH dan vasa hasil disain hanya dapat mengikat sekuen DNA gurame secara spesifik, tidak dapat mengikat sekuen DNA nila. Primer beta aktin tidak bersifat spesifik karena dapat mengikat kedua sekuen DNA baik gurame maupun nila.
Hasil sensitivitas PCR menunjukkan bahwa primer GH dapat mendeteksi
sampai konsentrasi terendah DNA gurame 1 ng/ L, sedangkan vasa hanya mendeteksi sampai 50 ng/ L masing-masing di dalam konsentrasi DNA nila 700
ng/ L. Hal ini mengindikasikan bahwa primer GH lebih sensitif dibanding vasa dalam membedakan DNA gurame setelah terinkorporasi di dalam DNA nila. Berdasarkan penyetaraan konsentrasi DNA dan jumlah sel, diduga bahwa dengan marka molekuler GH dapat mendeteksi 1 sel gurame di dalam 104 sel nila
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencatumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER DNA DALAM
IDENTIFIKASI SEL GONAD IKAN GURAME
(Osphronemus gouramy) DAN IKAN NILA
(Oreochromis niloticus) MENGGUNAKAN PCR
MARLINA ACHMAD
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis : Pengembangan Marka Molekuler DNA dalam Identifikasi Sel Gonad Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Menggunakan PCR
Nama : Marlina Achmad NIM : C151060021
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc
Ketua Anggota
Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Perairan
Prof. Dr. Ir. Enang Harris, M.S Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah TESIS ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret sampai Juli 2009 adalah genetika reproduksi ikan, dengan judul “Pengembangan Marka Moleuler DNA dalam Identifikasi Sel Gonad Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) MenggunakanPCR”.
Keberhasilan penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini tidak semata didapatkan sendiri, melainkan didukung dengan bantuan semua pihak. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Dr. Odang Carman selaku Pembimbing I yang telah membimbing dan mengarahkan penulis selama penelitian sampai dengan penyusunan karya ilmiah ini.
2. Bapak Dr. Alimuddin selaku Pembimbing II yang telah membimbing dan mengarahkan penulis selama melakukan penelitian sampai dengan penyusunan karya ilmiah ini.
3. Ibu Dr. Dinamella Wahjuningrum selaku dosen Penguji Luar Komisi yang telah memberikan saran dalam penyusunan karya ilmiah ini.
4. Direktorat Pendidikan Tinggi yang telah memberikan bantuan beasiswa melalui Program BPPS.
5. Suami tercinta, Fahrul, S.Pi, M.Si atas doa, cinta dan kasih sayang, serta kesabaran dalam menunggu dan memberi dukungan baik moril maupun material buat penulis.
6. Ibunda Radiah Abubakar, SH, Kakak Rahmat Achmad, dan adik-adikku Mardiana, S.Hut, Wahyuningsih, SP, dan Nurul Chaerani, dan keluarga besar yang telah memberi kasih sayang dan doa tanpa henti serta dukungan moril dan material.
7. Khusus untuk Anna Octavera S.Pi yang telah banyak membantu selama pengerjaan di Laboratorium, sharing ilmu, maupun sebagai pendengar setia curahan hati penulis.
8. Khusus untuk Nuril Farizah, S.Pi, M.Si atas dukungan, kebersamaan, persahabatan, serta pengertiannya terhadap penulis mulai dari kuliah S1 sampai kuliah S2.
9. Mba Lina Mulyani, Aliah Hidayani, Mauluddin, Dwi, Radi, Ade, Ibu Irmawati, Ibu Sri Pudji, Pak Andi, Pak Ilyas, Indra, dan Demin, atas kebersamaan dan persaudaraan selama di Laboratorium.
10.Teman-teman seperjuangan Ilmu Perairan (AIR) angkatan 2006 atas kebersamaan, kekeluargaan, dan pengalaman indah selama kuliah.
11.Teman-teman WACANA SULSEL, Pak Ridwan, Ibu Nadiarti, Ibu Hasni, Pak Hamzah, Nurmila, Fifi, Pak Jaya, atas dukungan moril yang diberikan.
12.Pak Am, Pak Ranta, Mba Yuli, Kang Asep atas kemudahan yang diberikan selama penelitian dan dalam pengurusan administrasi.
13.Teman-Teman di Wisma Ar-Riyadh, Twin House, dan Gardena, atas persahabatan, kebersamaan, dan pengertiannya selama penulis berada di Bogor.
Penulis telah berusaha semaksimal mungkin dalam penyelesaian karya ilmiah ini. Dengan harapan, karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan para pembaca pada umumnya.
Bogor, Agustus 2009 Penulis
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Makassar pada tanggal 6 April 1983 dari ayah Alm. Achmad Sadarang dan Ibu Radiah Abubakar, SH. Penulis merupakan putri kedua dari lima bersaudara.
Tahun 2000 penulis lulus dari SMU Negeri 5 Makasar dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Universitas Hasanuddin (UNHAS) melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN). Penulis memilih Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan (FIKP).
Penulis bekerja sebagai Staf Pengajar pada Jurusan Perikanan, FIKP, UNHAS, sejak tahun 2005. Tahun 2006 penulis melanjutkan studi untuk Program Magister, mengambil Program Studi Ilmu Perairan (AIR), Institut Pertanian Bogor (IPB). Selama studi, penulis juga aktif dalam organisasi pascasarjana WACANA SULSEL, sebagai Bendahara Umum periode 2006-2007.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... vi DAFTAR GAMBAR ... vii DAFTAR LAMPIRAN ... viii I. PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang ... 1 1.2. Perumusan masalah ... 3 1.3. Tujuan dan manfaat ... 4 II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Klasifikasi dan biologi ikan gurame ... 5 2.2. Klasifikasi dan biologi ikan nila ... 6
2.3. Transplantasi sel germinal ... 7 2.4. Marka molekuler ... 8
2.5. PCR ... 10 III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan tempat penelitian ... 13 3.2. Metode penelitian ... 13 3.2.1. Disain primer marka molekuler ... 13 3.2.2. Ekstraksi DNA ... 14 3.2.3. Amplifikasi DNA dengan PCR ... 14 3.2.4. Uji spesivitas primer ... 15 3.2.5. Uji sensitivitas PCR dalam membedakan DNA gurama dan nila . 15 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil ... 16 4.1.1. Primer marka molekuler ... 16 4.1.2. Ekstraksi DNA ... 16 4.1.3. Amplifikasi DNA dengan PCR ... 18 4.1.4. Uji spesivitas primer ... 19 4.1.5. Uji sensitivitas PCR dalam membedakan DNA gurame dan nila . 20 4.2. Pembahasan ... 21 V. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan ... 26 5.2. Saran ... 26 DAFTAR PUSTAKA ... 27 LAMPIRAN
DAFTAR TABEL
Halaman 1. Kuantifikasi DNA genom hasil ekstraksi ... 16 2. Progam PCR berdasarkan kandidat primer yang dihasilkan ... 18
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Ikan gurame ... 5 2. Ikan nila ... 6 3. Tahapan kerja PCR ... 11 4. Posisi primer forward dan reverse dari hasil pensejajaran, (A) GH,
(B) Vasa F2VSGR, (C) Vasa F1VSGR, dan β-aktin ... 17 5. Elektroforegram ketidakberhasilan proses amplifikasi dengan primer
marka molekuler vasa F1VSGR ... 19 6. Eletroforegram spesivitas primer GH dan vasa, serta β-aktin sebagai
kontrol ... 20 7. Elektroforegram sensitivitas marka molekuler GH dan vasa ... 20
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Ekstraksi DNA ... 31 2. Penentuan suhu annealing berdasarkan jumlah basa nukleotida dan
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang
Teknologi transplantasi sel germinal ikan telah dikembangkan baru-baru ini untuk merekayasa produksi benih ikan melalui induk “semang” (surrogate broodstock) (Okutsu et al. 2006a). Teknologi induk “semang” tersebut dilakukan dengan cara mentransplantasikan sel germinal berupa primordial germ cells (PGC) (Takeuchi et al. 2003) atau sel spermatogonia (Okutsu et al. 2006b) ke dalam rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel donor berdiferensiasi menjadi telur atau sperma. Pemijahan ikan semang/resipien yang membawa sperma dan telur yang berkembang dari sel donor, akan menghasilkan ikan target (Okutsu et al. 2006a). Keberhasilan teknologi ini telah ditunjukkan pada ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) menggunakan induk semang ikan salmon masu (Oncorhynchus masou) (Takeuchi et al. 2004). Teknik ini berpotensi digunakan untuk merekayasa produksi benih ikan budidaya di Indonesia, khususnya ikan yang matang gonad relatif lambat seperti ikan gurame.
Ikan gurame (Osphronemus gouramy) merupakan salah satu jenis ikan air tawar yang memiliki harga jual relatif tinggi dan pengembangan usaha budidayanya telah menjadi salah satu fokus revitalisasi perikanan budidaya 2006- 2009 (DKP 2005, diacu dalam Nugroho et al. 2008). Namun demikian, waktu pencapaian matang gonad pertama kali pada ikan gurame cukup lama, yakni sekitar 3-4 tahun, sehingga dibutuhkan waktu relatif panjang untuk memproduksi induk ikan gurame. Aplikasi teknologi transplantasi sel germinal ikan gurame pada ikan semang yang cepat matang gonad diduga dapat mengatasi keterlambatan ikan gurame matang gonad dan selanjutnya dapat mendukung peningkatan produksi benih ikan gurame secara signifikan di masa mendatang.
Salah satu penentu keberhasilan transplantasi sel germinal adalah pemilihan ikan resipien yang kompeten; yang dapat mendukung perkembangan sel gonad ikan gurame. Dengan pertimbangan karakter telur yang relatif mirip dengan ikan gurame, diduga ikan yang potensial digunakan sebagai resipien adalah ikan nila. Selain itu, ikan nila dapat mencapai matang awal pada umur sekitar 4-6 bulan. Spermatozoa ikan nila pertama kali terlihat di dalam testes
sekitar 100 hari setelah penetasan (Kobayashi et al. 2000). Ikan nila juga dapat dipijahkan dengan mudah secara buatan di wadah terkontrol, sehingga mendukung kegiatan rekayasa genetik di masa mendatang (Alimuddin et al. 2009). Selanjutnya, transplantasi sel germinal pada ikan nila telah dilakukan dengan sel donor dari ikan sejenisnya (Lacerda et al. 2006; Zaparta 2009).
Identifikasi sel donor dalam individu ikan resipien umumnya dilakukan dengan cara mengamati pendaran sel yang mengekspresikan gen GFP (Green Fluorescent Protein) menggunakan mikroskop fluoresen. Sel donor tersebut diperoleh dari ikan transgenik (Yoshizaki et al. 2000). Saat ini, ikan gurame transgenik yang memiliki sel germinal mengeksrepsikan gen GFP belum tersedia. Karena waktu matang gonad ikan gurame secara alamiah cukup lama, maka waktu yang dibutuhkan untuk membuat ikan gurame transgenik juga panjang. Selain itu, metode efektif untuk pembuatan ikan gurame transgenik juga belum diketahui. Ketersediaan mikroskop fluoresen yang masih terbatas di Indonesia juga menjadi salah satu kendala penggunaan sel berpendar sebagai donor. Oleh karena itu, pada penelitian ini dikembangkan metode alternatif untuk identifikasi sel donor menggunakan ikan gurame bukan transgenik. Sistem penanda sel germinal donor yang berasal dari ikan bukan transgenik telah dikembangkan meggunakan PKH26. Sel donor akan berpendar merah bila terpapar dengan sinar UV, sehingga dapat dibedakan dengan sel endogenus ikan resipien (Alimuddin et al. 2009). PKH26 telah digunakan dalam penelitian transplantasi sel testikular
ikan mulloway (Argyrosomus hololepidotus) pada ikan nibe Jepang (Nibea mitsukurii) (Yoshizaki et al. 2008). Seperti halnya pada sel donor
mengekspresikan gen GFP, identifikasi sel donor yang ditandai dengan PKH26 juga membutuhkan mikroskop fluoresen. Dengan demikian, penggunaan PKH26 juga belum efisien diaplikasikan di Indonesia.
Pada penelitian ini dikembangkan metode alternatif yang lebih aplikatif yang didukung oleh ketersediaan fasilitas. Metode alternatif yang memungkinkan diaplikasikan saat ini di Indonesia adalah marka molekuler DNA, yang dapat dideteksi dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer spesifik bagi ikan donor. Mesin PCR sudah tersebar di seluruh Indonesia. Primer spesifik didisain dari sekuen gen target ikan donor. Pada ikan gurame, sekuen gen
yang tersedia adalah gen penyandi hormon pertumbuhan (growth hormone, GH) (Nugroho et al. 2008) dan vasa (Alimuddin et al. 2009). Pada penelitian ini kedua gen tersebut dikembangkan sebagai marka molekuler pendeteksi sel gonad donor dalam individu resipien.
1.2. Perumusan masalah
Pertumbuhan dan waktu matang gonad yang lambat diduga menjadi suatu masalah dalam ketersedian benih ikan gurame yang tidak dapat mencukupi untuk mendukung pencapaian target produksi nasional. Hingga saat ini, penelitian yang telah dilakukan dalam upaya peningkatan produksi ikan gurame terbatas pada komposisi pakan yang memberi pertumbuhan tinggi. Rekayasa produksi benih ikan gurame melalui aplikasi metode teknologi surrogate broodstock atau teknologi induk “semang” diduga dapat mendukung pengembangan budidaya ikan gurame untuk mencapai target produksi nasional di masa datang.
Aplikasi teknologi induk “semang” dilakukan dengan mentransplantasikan sel germinal ikan donor (ikan gurame) ke rongga perut larva resipien. Ikan yang dapat matang gonad lebih cepat daripada ikan gurame menjadi salah satu pertimbangan pemilihan ikan resipien. Pada penelitian Takeuchi et al. (2004), aplikasi teknologi induk “semang” ikan rainbow trout berhasil dilakukan pada ikan salmon masu. Sel donor yang digunakan berasal dari ikan rainbow trout transgenik yang membawa gen berpendar GFP (Green Fluorescent Protein). Pendaran GFP bergatung pada aktivitas promoter yang digunakan. GFP yang dikendalikan oleh aktivitas gen vasa, hanya dapat mencapai puncak pendaran pada sel germinal ikan rainbow trout tahap meiosis (Yano et al. 2008), pendaran sangat kuat pada tahap spermatogonia A dan melemah pada tahap spermatogonia B. Berbeda dengan vasa, pendaran GFP yang dikendalikan oleh promoter β-aktin dapat mencapai puncak pendaran sampai pada tahap spermatozoa ikan nila (Zaparta 2009). Pendaran GFP dengan kedua promoter tersebut, vasa dan GFP dapat dilihat di bawah mikroskop fluoresen. Kerersediaan mikroskop fluoresen masih sangat terbatas di Indonesia. Selain itu, metode efektif untuk membuat dan ketersediaan ikan gurame transgenik dengan sel germinal mengekspresikan gen GFP juga menjadi penghambat dalam penyediaan sel donor yang berpendar.
Pada penelitian ini digunakan sel donor alami yang berasal dari ikan gurame bukan transgenik, dan menggunakan marka molekuler sebagai primer spesifik untuk membedakan sel germinal ikan gurame dan ikan nila sebagai calon resipien. Marka molekuler dianalisis menggunakan metode PCR dengan primer spesifik ikan donor. Pengembangan marka molekuler didukung oleh ketersediaan mesin PCR yang tersebar luas di Indonesia. Hingga saat ini, gen ikan gurame yang sudah diketahui sekuennya adalah gen GH dan vasa. Oleh karena itu, kedua gen tersebut digunakan sebagai marka pembeda antara donor (ikan gurame) dan resipien (ikan nila). PCR dengan primer spesifik yang didisain berdasarkan marka GH dan vasa hanya akan menghasilkan produk amplifikasi pada ikan donor.
1.3. Tujuan dan manfaat
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi cara alternatif pendeteksi sel gonad donor dalam individu semang pada proses transplantasi. Pengembangan marka molekuler ini sangat bermanfaat untuk mendukung aplikasi teknologi transplantasi sel germinal donor pada individu semang dalam rangka merekayasa produksi benih ikan-ikan budidaya di Indonesia, khususnya yang membutuhkan waktu relatif lama untuk mencapai matang gonad pertama kali.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Klasifikasi dan biologi ikan gurame
Ikan gurame (Osphronemus gouramy) (Gambar 1) merupakan salah satu ikan air tawar yang bernilai ekonomis tinggi di Indonesia khususnya di daerah Jawa Barat. Taksonomi ikan gurame adalah sebagai berikut:
Kelas : Pisces Sub Kelas : Teleostei Ordo : Labyrinthici Sub Ordo : Anabantoidae Famili : Anabantidae Genus : Osphronemus
Species : Osphronemus gouramy (Lacepede)
Gambar 1. Ikan gurame
Panjang dan bobot tubuh ikan gurame konsumsi sangat bergantung terhadap lamanya waktu pembesaran. Pemanenan hasil pembesaran ikan gurame minimal mencapai umur dua tahun. Ikan gurame yang berumur dua tahun memiliki panjang dan bobot tubuh yaitu 25 cm dan 0,3 kg/ekor, umur tiga tahun memiliki panjang dan bobot tubuh yaitu 35 cm dan 0,7 kg/ekor, empat tahun mencapai panjang dan bobot tubuh yaitu 40 cm dan 1,5 kg/ekor. Pertumbuhan yang lambat ini merupakan salah satu masalah besar dalam usaha pembesaran gurame, di samping pencapaian matang gonad pertama kali yang relatif lama, yakni sekitar 3-4 tahun.
2.2. Klasifikasi dan biologi ikan nila