3.4 PROSEDUR PENELITIAN
3.4.1 PERSIAPAN BAHAN UJI a.Determinasi Tanaman
b. Penyiapan sampel c. Pembuatan ekstrak
3.4.2 Standardisasi ekstrak etanol daun Pterocarpus indicus Willd a. Penetapan parameter spesifik
1. Identitas 2. Organoleptik
3. senyawa terlarut dalam pelarut tertentu 4. Uji kandungan kimia ekstrak etanol b. Penetapan parameter non spesifik
1. Penetapan Susut Pengeringan 2. Bobot Jenis
3. Penetapan Kadar Air 4. Penetapan Kadar Abu
5. Penentuan cemaran bakteri dan cemaran kapang 6. Penentuan Cemaran Logam
3.4.1 PERSIAPAN BAHAN UJI a. Determinasi Tanaman
Pemeriksaan atau determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Bogor, Jawa Barat.
b. Penyiapan Simplisia
Simplisia yang berasal dari ketiga tempat tumbuh yang berbeda dipisahkan terlebih dahulu dari masing-masing lokasi agar dalam penyiapan simplisia tidak tercampur. Penyiapan simplisia daun P.indicus Willd
dilakukan dengan cara sortasi basah untuk memisahkan kotoran atau bahan-bahan asing lainnya dari daun. Kemudian dilakukan pencucian untuk menghilangkan pengotor yang masih menempel pada bahan. Tahap selanjutnya adalah pengeringan, sampel dikeringkan dalam oven pada suhu 45oC selama 24 jam. Kemudian dilakukan sortasi kering, tujuannya untuk menghilangkan pengotoran-pengotoran lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering, kemudian dilakukan penggilingan untuk mendapatkan serbuk simplisia.
c. Pembuatan Ekstrak
Serbuk simplisia P.indicus Willd yang diperoleh ditimbang sebagai bobot awal. Proses ekstraksi simplisia angsana menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 70% hingga terendam dalam wadah tertutup rapat selama 24 jam. Proses ekstraksi dilakukan sampai hasil larutan maserasi mendekati tidak berwarna. Filtrat yang didapat kemudian disatukan dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 60oC sampai didapat ekstrak kental.
% rendemen ekstrak = berat ekstrak yang didapat (g) x 100%. berat simplisia yang di ekstrak (g) 3.4.2 STANDARDISASI EKSTRAK ETANOL
a. Parameter spesifik (Depkes RI, 2000) 1. Identitas
Deskripsi tata nama dan senyawa identitas yang terkandung 2. Organoleptik
Mendeskripsikan bentuk, warna, bau dan rasa 3. Senyawa terlarut dalam pelarut tertentu
a. Kadar senyawa yang larut dalam air
Sejumlah 1 gram ekstrak dimaserasi selama 24 jam dengan 20 mL air-kloroform kemudian dibiarkan selama 18 jam, saring. Diuapkan 4 mL filtrat hingga kering dalam cawan penguap, residu dipanaskan pada suhu 105oC. Keluarkan, lalu dimasukan ke dalam
desikator kemudian ditimbang. Ulangi perlakuan sampai didapatkan bobot tetap. Dihitung kadar dalam persen senyawa yang larut dalam air terhadap berat ekstrak awal.
% senyawa terlarut air = −
100%
Ket : A1 = Bobot cawan + ekstrak setelah pemanasan (g) Ao = Bobot cawan kosong (g)
B = Bobot sampel awal (g)
b. Kadar senyawa yang larut dalam etanol
Sejumlah 1 gram ekstrak dimaserasi selama 24 jam dengan 20 mL etanol 95% kemudian dibiarkan selama 18 jam, saring. Diuapkan 4 mL filtrat hingga kering dalam cawan penguap, residu dipanaskan pada suhu 105oC. Keluarkan, lalu dimasukan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Ulangi perlakuan sampai didapatkan bobot tetap Dihitung kadar dalam persen senyawa yang larut dalam air terhadap berat ekstrak awal.
% senyawa terlarut etanol = −
100% Ket : A1 = Bobot cawan + ekstrak setelah pemanasan (g)
Ao = Bobot cawan kosong (g) B = Bobot sampel awal (g)
4. Uji kandungan kimia a. Pola kromatogram
Ekstrak sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 1 mL metanol, kemudian ditotolkan pada lempeng KLT selanjutnya dielusi dengan fase gerak yang sesuai.
b. Penapisan golongan kimia ekstrak etanol (Nurhimah A, 2008)
Identifikasi steroid dan triterpenoid
Ekstrak etanol pekat sebanyak 1g dimaserasi dengan 10 mL dietil eter selama 10 menit. Lapisan eter dipisah lalu ditambah 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4. warna merah atau ungu menunjukkan kandungan
triterpenoid pada sampel sedangkan warna hijau menunjukkan kandungan steroid
Identifikasi flavonoid
Ekstrak etanol pekat sebanyak 1gram dilarutkan dengan 100 mL air panas dan didihkan selama 10 menit. Sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan 0.5 mg serbuk Mg, 2 mL larutan HCl, dan 2 mL amil alkohol lalu dikocok kuat. Warna jingga yang terbentuk menunjukkan terdapatnya senyawa flavonoid
Identifikasi saponin
Ekstrak etanol pekat sebanyak 1 gram dilarutkan dengan 100 mL air panas dan didihkan selama 10 menit. Sebanyak 5 mL, filtrat yang diperoleh dikocok. Timbulnya busa hingga selang waktu 10 menit menunjukkan adanya saponin.
Identifikasi tanin
Ekstrak etanol sebanyak 1gram dilarutkan dengan 100 mL air panas dan didihkan selama 10 menit. Ditambahkan beberapa tetes FeCl3. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan terdapatnya tannin
Identifikasi kuinon
Ekstrak etanol pekat sebanyak 1 gram dilarutkan dengan 100 mL air panas dan didihkan selama 10 menit. Sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan NaOH 10% warna merah yang terbentuk menunjukkan terdapatnya senyawa kuinon
Identifikasi alkaloid
Ekstrak etanol pekat sampel sebanyak 1 gram ditambahkan 10 mL kloroform dan 3 tetes amoniak dalam tabung reaksi. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan H2SO4 2 M dan dimasukkan ke dalam 2 buah
tabung reaksi, lalu ditambahkan pereaksi Dragendorff pada tabung pertama, dan pereaksi Mayer pada tabung kedua. Terdapatnya akaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih oleh pereaksi Mayer, dan endapan merah oleh pereaksi Dragendorf.
c. Kadar total flavonoid (Chang, et al., 2002) 1) Larutan uji
1 gram ekstrak ditimbang kemudian dihidrolisis dengan HCl 4N selama 30 menit
Ekstrak disari dengan 15 mL etil asetat sebanyak 3 kali, fraksi EA dikumpulkan dan dipekatkan
Hasil ekstrak EA dimasukan dalam labu 25 mL, kemudian dilarutkan dengan metanol hingga tanda batas
Larutan uji dipipet 0,5 mL kemudian dilarutkan dengan metanol 1,5 mL pada tabung reaksi
Ditambahkan pereaksi 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL Na asetat 1M dan 2,8 mL aquadest, larutan dicampur homogen dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit
Larutan diukur serapannya pada spektro UV pada panjang gelombang 415 nm dengan menggunakan larutan blanko tanpa AlCl3 tapi diganti aquadest
Kadar flavonoid total dinyatakan dengan kesetaraan pembanding kuersetin
2) Kurva kalibrasi
Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan dengan pembanding kuersetin
25 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur 100 mL hingga tanda batas
Dibuat 5 konsentrasi berbeda dengan diencerkan menggunakan metanol
Tiap konsentrasi dipipet 0,5 mL lalu dilarutkan dengan 1,5 mL metanol, dan ditambahkan pereaksi 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL Na asetat 1M dan 2,8 mL aquadest
Larutan dicampur homogen dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit
Larutan diukur pada panjang gelombang 415 nm dengan larutan blangko tanpa kuersetin.
b. Parameter non spesifik (Depkes RI, 2000) 1. Penetapan susut pengeringan
Sebanyak 1 gram ekstrak ditimbang dalam cawan yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105ºC selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum di timbang ekstrak diratakan dengan bantuan pengaduk hingga merupakan ekstrak berupa lapisan setebal 5 sampai 10 mm kemudian dikeringkan pada suhu 105ºC selama 30 menit, keluarkan, lalu dimasukan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Ulangi perlakuan sampai didapatkan bobot tetap. Kemudian dicatat bobot tetap yang diperoleh untuk menghitung persentase susut pengeringannya.
% susut pengeringan = −
100% ( Selawa, widya et al. 2013) Ket : A= Berat sampel sebelum dipanaskan (g)
B = Berat sampel setelah dipanaskan (g) 2. Penetapan kadar air (Metode gravimetri) (Depkes, 2000)
Ditimbang seksama 1 gram ekstrak dalam cawan yang telah ditara. Dikeringkan pada suhu 105ºC selama 5 jam dan ditimbang.
kadar air = −
Ket : A = Berat sampel sebelum dipanaskan (g)
3. Bobot jenis
Bobot jenis diukur menggunakan piknometer bersih, kering dan telah dikalibrasi dengan menetapkan bobot piknometer dan bobot air pada suhu 25°C. Bobot jenis ekstrak cair ditentukan terhadap hasil yang diperoleh dengan membagi bobot ekstrak dengan bobot air, dalam piknometer pada suhu 25°C.
Bobot jenis = −
− BJ air
Ket : A1 = Bobot cawan + ekstrak setelah pemanasan (g) Ao = Bobot cawan kosong (g)
B = Bobot sampel awal (g)
4. Penetapan kadar abu (Depkes RI,2000).
Ditimbang 1 gram ekstrak secara seksama lalu dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditimbang terlebih dahulu, kemudian diratakan. Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang abis. Lalu dinginkan dan ditimbang
Kadar abu = −
− 100%
Ket : A1 = Bobot cawan + ekstrak setelah pemanasan (g) Ao = Bobot cawan kosong (g)
B = Bobot sampel awal (g)
Kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu, didihkan dengan 25 ml asam klorida encer P selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, kemudian dipijarkan hingga bobot tetap dan ditimbang, ditentukan kadar abu yang tidak larut asam dalam persen terhadap berat sampel awal.
Kadar abu tidak larut asam = − − 100% Ket : A1 = Bobot cawan + ekstrak setelah pemijaran (g)
B = Bobot sampel awal (g)
C = Bobot kertas saring kosong (g)
5. Penetapan cemaran mikroba dan cemaran kapang (Depkes RI, 2000) a. Penentuan cemaran mikroba
Larutan ekstrak dibuat dengan pengenceran 1:10 dengan cara melarutkan 1 gram ekstrak ke dalam labu ukur 10 mL. dilanjutkan dengan pengenceran 1:100 dan 1:1000. Untuk penentuan angka lempeng total (ALT) dipipet 1 mL dari tiap pengenceran ke dalam cawan petri yang steril (triplo) dengan menggunakan pipet yang berbeda dan steril untuk tiap pengenceran. Ke dalam tiap cawan petri dituangkan 15 mL media nutrient agar yang telah dicairkan bersuhu 450 C. Cawan petri digoyangkan dengan hati-hati (diputar dan digoyangkan ke depan dan ke belakang ke kanan dan ke kiri) hingga sampel bercampur rata dengan larutan ekstrak. Kemudian dibiarkan hingga campuran dalam cawan petri membeku. Cawan petri dengan posisi dimasukkan ke dalam lemari inkubator suhu 35oC selama 24 - 48 jam. Dicatat pertumbuhan koloni pada masing-masing cawan yang mengandung 30-300 koloni setelah 24 - 48 jam dan menentukan Angka Lempeng Totalnya
b. Penentuan cemaran kapang/khamir
Dibuat larutan ekstrak dengan pengenceran 1:10 dengan cara melarutkan 1 gram ekstrak ke dalam labu ukur 10 ml. Dilanjutkan dengan pengenceran 1:100 dan 1:1000. Media agar yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA). PDA dicairkan dengan suhu 450C, lalu dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak 15 mL, biarkan membeku dalam cawan. Sebanyak 0,5 mL dari tiap pengenceran larutan ekstrak dipipet ke dalam cawan petri yang steril (metode sebar atau spreader) dengan menggunakan pipet yang berbeda dan steril untuk tiap
pengenceran. Cawan petri digoyangkan dengan hati-hati hingga sampel tersebar secara merata pada media. Kemudian diinkubasikan pada suhu kamar (25º C) selama 5 hari, lalu ditentukan jumlah kapang dan khamir.
6. Penentuan cemaran logam berat (Saifudin, et al., 2011).
Ditimbang 1 gram ekstrak dan ditambahkan 10 mL HNO3 pekat, kemudian dipanaskan diatas hot plate (dalam ruang asam) hingga volume larutan setengahnya, setelah itu tambahkan 5 mL HClO4
kemudian dipanaskan hingga asap tidak ada lagi kemudian didinginkan, filtrat disaring dimasukan kedalam labu ukur 50 mL, ditambahkan aquabidest hingga tanda batas. sampel diukur dengan spektrofotometri serapan atom (SSA).