4. Perlakuan Media
4.4 Peubah yang Diamati
Pengukuran pertumbuhan sel mikroalga dilakukan dengan mengukur OD kultur mikroalga yang dilakukan setiap 2 hari sekali selama 16 hari pengamatan. OD diukur dengan cara sampel tiap perlakuan diambil sebanyak 8 ml dan dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 680 nm (Lee et al. 1998).
Biomassa
Pengukuran bobot basah dan bobot kering dilakukan pada hari ke-16. Pengukuran dilakukan dengan cara mengambil 100 ml kultur mikroalga, kemudian disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan diambil peletnya sebagai bobot basah. Selanjutnya pelet di oven pada suhu 80°C selama 24 jam. Biomassa yang telah kering kemudian ditimbang sebagai bobot kering. Kandungan Lipid
Pengukuran kandungan lipid dilakukan pada hari ke-16 dengan proses ekstraksi. Lipid mikroalga diukur dengan mengikuti metode yang dilakukan oleh
Bligh dan Dyer (1959) yang telah dimodifikasi dalam hal kecepatan sentrifus diubah menjadi 3000 rpm selama 10 menit. Metode ini menggunakan pelarut metanol dan kloroform. Pengujian kandungan lipid mikroalga dilakukan dengan cara biomassa mikroalga yang telah kering ditambah dengan 2 ml air murni, 5 ml metanol dan 2,5 ml kloroform, selanjutnya digoyang dengan shaker selama 1 malam. Setelah selesai ditambah kembali dengan 2,5 ml air murni dan 2,5 ml kloroform.
Tahap berikutnya larutan disentrifus kembali pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan diambil endapan lipid (pelet) dan diletakkan di dalam tabung reaksi, kemudian dipanaskan pada waterbath suhu 200°C untuk menghilangkan campuran larutan kimia yang ditambahkan sebelumnya. Kandungan lipid mikroalga yang sudah ditumbuhkan pada medium yang sesuai dianalisa dengan rumus yang digunakan oleh Weldy dan Huesemann (2007) sehingga didapatkan berat lipid. Perhitungan % total lipid mikroalga adalah:
%
Keterangan : Lw = Bobot lipid (g)
Bw = Bobot kering mikroalga (g)
Produktivitas lipid mikroalga dihitung menggunakan rumus
/ /
Kandungan Pati
Kandungan pati diukur berdasarkan kandungan gula total mengikuti metode Cleg-Anthrone (Apriyantono et al. 1989) dengan cara 1 g sampel kering atau 2,5 g sampel basah ditambahkan 10 ml air dan dilarutkan dengan 13 ml asam perklorat 52%. Hasil yang diperoleh diencerkan menjadi 100 ml lalu dilakukan penyaringan. Ekstrak yang dihasilkan diencerkan lagi sampai volume 250 ml. Ekstrak tadi diambil 10 ml dan diencerkan dengan air menjadi volume 100 ml larutan. Sebanyak 1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan ditambah 5 ml pereaksi Anthrone dengan cepat. Setelah itu dipanaskan dalam penangas air 100°C selama 12 menit. Pengukuran
absorbansinya pada panjang gelombang 630 nm. Hasilnya dibandingkan dengan larutan standar glukosa pada konsentrasi 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Kandungan pati dapat dihitung dengan rumus dari Goni et al. (1997) sebagai berikut
Kandungan pati = kandungan gula 0,9
Kandungan Protein
Metode yang digunakan untuk menetapkan kandungan protein adalah metode Biuret (Apriyantono et al. 1989) yang telah dimodifikasi. Pengujian ini dilakukan dengan cara menyiapkan sampel dengan volume total masing-masing 1 ml pada tabung corning ukuran 15 ml. Ke dalam masing-masing tabung corning tersebut ditambahkan 1 ml Trichloro-acetic acid (TCA) 10% sehingga protein akan terdenaturasi. Selanjutnya tabung disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap dan supernatan dibuang dengan cara dekantasi. Ke dalam endapan ditambah dengan 2 ml etil eter dan dicampur merata lalu disentrifus kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk menghilangkan residu TCA.
Sampel yang sudah siap dibiarkan kering pada suhu kamar dalam ruang asam. Ke dalam endapan kering ditambahkan 4 ml air dan dicampur merata. Pada saat dilakukan pengukuran protein ditambahkan 6 ml pereaksi biuret. Setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Hasil absorbansinya dibandingkan dengan nilai absorban dengan larutan BSA pada konsentrasi 0, 20, 40, 60, 80, 100 ppm.
4. Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis sidik ragam pada tingkat kepercayaan 95% menggunakan program SPSS (Statistical Product Service Solution) dan dilanjutkan dengan uji DMRT (Duncan Multiple Range Test).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Penelitian
1. Identifikasi Mikroalga
Penentuan keseragaman jenis merupakan tahap awal yang harus dilakukan pada mikroalga yang akan dijadikan sebagai bahan baku biodiesel untuk memastikan bahwa isolat yang digunakan benar-benar jenis yang diharapkan dan dalam kultur yang dibiakkan terdapat satu jenis mikroalga (monokultur). Akan tetapi pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 x menunjukkan bahwa kultur sel-sel isolat mikroalga mengalami kontaminasi, sehingga di dalam kultur ditemukan beberapa jenis mikroalga (Gambar 4B). Adapun pengecekan kandungan lipid menunjukkan isolat mikroalga berpendar merah kekuningan yang berarti isolat mikroalga mengandung lipid polar dan lipid netral (Gambar 4A).
(A) (B) Gambar 4 (A) Pengamatan hasil verifikasi lipid dengan mikroskop fluorescence.
(B) Pengamatan morfologi isolat mikroalga dengan mikroskop
cahaya.
Identifikasi secara morfologi dari jenis mikroalga yang dominan menunjukkan isolat mikroalga membentuk koloni yang tersusun atas 2, 4, 8 sel atau kelipatannya dan berbentuk seperti bola kubus, sel dilindungi oleh adanya lapisan musilagenus yang melapisi setiap sel seperti amplop, warna selnya biru kehijauan (Gambar 4B) diduga termasuk dalam genus Chroococcus sp. dan dikelompokkan dalam divisi Cyanophyta, sedangkan golongan yang lain termasuk
spesies dari Chlorophyta.Warna isolat yang mengalami perlakuan berbagai air media dan konsentrasi P mulai hari ke-0 sampai hari ke-16 cenderung memiliki warna yang sama yaitu berwarna hijau (Lampiran 2), tetapi berbeda nilai OD-nya. Identifikasi secara morfologi hanya berhasil sampai pada tingkat genus untuk jenis yang dominan dalam kultur.
Identifikasi molekuler dilakukan untuk mendukung identifikasi secara morfologi. Pengecekan fragmen hasil isolasi DNA mikroalga (Gambar 5) melalui elektroforesis menunjukkan hasil yang bagus dan terlihat adanya pita DNA yang tajam, jelas dan tidak terdegradasi dengan ukuran sesuai dengan yang diharapkan.
Gambar 5 Hasil isolasi DNA (1,2) pita DNA isolat mikroalga (3) marka molekuler yang digunakan 1 kb DNA Ladder.
Pengecekan hasil PCR melalui elektroforesis menunjukkan panjang produk PCR sesuai dengan yang diharapkan yaitu 600 bp untuk fragmen 1 yang menggunakan primer SR1-SR5 dan 750 bp untuk fragmen 2 dengan primer SR4-SR9 (Gambar 6). Tahap selanjutnya adalah purifikasi fragmen DNA hasil amplifikasi PCR menggunakan protokol yang tersedia pada kit (Promega, USA) untuk mendapatkan DNA secara murni untuk dilakukan sekuensing dan analisis BLAST pada database Bank gen.
- 1 - 10 - 2 - 3 - 0,5 - 1,5 2 1 3 kb
Gambar 6 Hasil Amplifikasi DNA (PCR) gen 18S rDNA (1) pita DNA yang dihasilkan menggunakan primer forward-reverse SR1-SR5 dengan panjang produk 600 bp (2) marker yang digunakan 1000 bp DNA Ladder (3) pita yang dihasilkan dengan menggunakan primer forward-reverse SR4-SR9 dengan panjang produk 750 bp.
Hasil sekuen gen 18S rDNA dari fargmen 1 dan fragmen 2 yang diperoleh dengan menggunakan primer forward-reverse SR1-SR5 dan SR4-SR9 disajikan pada Gambar 7. Berdasarkan hasil analisis sekuen gen 18S rDNA dengan menggunakan program BLAST terhadap sekuen DNA menunjukkan bahwa 50% dari sekuen DNA mikroalga mempunyai kemiripan (similaritas) 84% (E value 0,0 dan skor maksimum 645) dengan sekuen DNA aksesi Uncultured freshwater eukaryote clone LG11-03 18S ribosomal RNA gene (AY919722.1), sedangkan daftar beberapa organisme yang urutan nukleotidanya mempunyai kemiripan DNA dengan isolat mikroalga dengan max identity 79-84% berdasarkan hasil analisis BLAST ditampilkan dalam Tabel 5.
750 bp 600 bp
GGACTGCTGT CTCAAGATAA GCCATGCATG TCTAAGTATA AACAATTTAT 50
ACCGGTAAAA CCGCCAAGGG CTCTATAATA CATTTATTTT TTATTTTATT 100
GCACCCACAA TTTATATAAC TGCGTAATTT CTAGAGATAA TATACGTGAA 150
AAATCCCCAG TCTTTGGAAG GGATGTATTT ATTAAATAAA AAACCAATCC 200
ATCTCTCCGT TCGCTCCTTG GTGAATCATA ATAACTTTCC GGATCAAACG 250
GCCGCGTGTC TGCTACGCTT CATTCAAATT TCTGCCCGAT CAACTTTCTA 300
TGGACGGATA GAGGCCTAAC ATCCTTTTAA CGGGCGACGG ACAATTAAGG 350
ATCGATTCCT TACAGAGAGC CTGCCAGATC AATACCACTT CCAAGGAAGG 400
AAAGTAGCCC GCACATTACC CAATCCTTAC TCACACAGGT AGTGACTATC 450
AATAACTATG CAGTCCCCGA ACAGGCCGGT GTAATTGGAA TGAGAACAAT 500
TTAAATCCCT TATCGAGGAA CAATTAGAGG GCAAGTCTGG TGCCAGCAGC 550
CGCGGTAATT CCAGCTCCAA TAGCGTATAT TAAAGTTGCT GCAGTTAAAA 600
AGCTCGTAGT TGAATTTCTG GAGCGTATAT TAAAGTTGCT GCAGTTAAAA 650
AGCTCGTAGT TGAATTTCTG GCCCGGGNCG CCTGGCCGCC CAGCGTTGGC 700
CCGTGGCGTG GAGGCTCCCT CCCGCTGTAC GACTGGGGAT CATCTTTTCC 750
GTTTGTTGGC CCGCGTCCGC CATTGTGATC TGTTAAAATT AAAAAGCGCA 800
AGCGTCGCTC TTGCGCTCTT GCTTTGAATA CATTGAAATG GTAAAACCGC 850
GCTTTACTTT CGTTTGTTTT TGAAGGTGAC AAAAAGTAAA ATAAGTTGGG 900
AGGGGGGTTG TTGGGCTGTC GGGTGTTCAG TGCTGGTCTT TGTTGACCAC 950
AAGCTGAACA GAAACCAACG CCCAGNCGGA ATCATTTCTT TAATAAAAAA 1000
GTAAAGTTAT AGGAGAGAAT AAGATAACCT CCCGCCCTTG TTCATACAAT 1050
AAGCCTTCCC ACCTGTCTTT GACTGCGGTT TGACTCTGTC TCATCTGGCG 1100
GATCTCTAGA AACTTAAGGT TCCGGGTTCC CGGGGGGTAT GGTTGGAATN 1150
CTGAAACTTT TGACAAANAC CGCCAGTCNC CCGAGNAGCG GAGCCTGTGG 1200
CCTAACTCTG ACTCACAAAA CGAAACCTCA CTCGACCACG ACACTTTTGA 1250
CATATAGAGA GGGATT 1266
Gambar 7 Hasil sekuen gen 18S rDNA isolat mikroalga yang berasal dari sumber air panas Cipanas.
Tabel 5 Daftar organisme yang mempunyai kemiripan DNA dengan isolat mikroalga berdasarkan hasil BLAST dari koleksi database Bank Gen
Accecion Description Max score Total score Query coverage E value Max indentity AY919722.1 Uncultured freshwater
eukaryote clone LG11-03 18S ribosomal RNA
gene, partial sequence 645 645 50% 0,0 84% AJ130863.1 Unidentified eukaryote
18S ribosomal RNA,
clone LKM74, partial 636 636 50% 1,00E-178 83% AY919786.1 Uncultured freshwater
eukaryote clone LG30-03 18S ribosomal RNA
gene, partial sequence 630 630 50% 6,00E-177 83% GQ995317.1 Uncultured
Chytridiomycota clone T5P1AeC12 18S ribosomal RNA gene,
partial sequence 531 531 50% 4,00E-147 80% AB586075.1 Spizellomyces sp. NBRC
105423 gene for 18S ribosomal RNA, partial
sequence 524 524 50% 6,00E-145 79%