BAHAN DAN METODE
2. Pewarnaan Imunohistokimia Cu, Zn SOD
Pewarnaan khusus imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD dilakukan untuk mengamati perubahan kandungan enzim antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal. Langkah awal dilakukan deparafinisasi dengan xylol III – I, waktu untuk xylol III dan xylol II selama 3 menit sedangkan untuk xylol I selama 5 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alkohol absolut III – alkohol 80% masing-masing 3 menit dan terakhir dengan alkohol 70% selama 5 menit. Selanjutnya dimasukkan dalam akuades selama 15 menit. Setelah itu diinkubasi dalam substrat metanol yang ditambahkan H2O2 selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen, selanjutnya dicuci berturut-turut dengan akuades dan Phosphate Buffer Saline (PBS) masing masing 2x10 menit. Setelah itu jaringan dinkubasi dalam serum normal selama 30-60 menit untuk menutupi antigen non spesifik dan berikutnya jaringan dicuci dengan PBS selama 3x 10 menit. Kemudian jaringan dinkubasi dalam antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD (1:200) pada suhu 4ºC selama 2 malam. Selanjutnya diinkubasi dalam antibodi sekunder selama 60 menit, Dako Envision Peroxidase (Dako K 1491) dalam ruang gelap dan sebelumnya harus dicuci dengan PBS selama 3x 5 menit. Hasil reaksi antigen dengan antibodi divisualisasikan dengan menggunakan DAB (Diamino Benzidine)
dalam trisbuffer yang ditambahkan H2O2 selama 25 menit (ditutup gelap), selanjutnya dicounterstain dengan hematoksilin. Setelah itu dilakukan dehidrasi dan clearing, jaringan kemudian dimounting dengan entelan dan siap untuk diamati.
16
Parameter dan Analisis Data Parameter
Hasil pewarnaan HE terhadap jaringan ginjal diamati menggunakan mikroskop cahaya yang diatur sedemikian rupa untuk melihat kondisi morfologi sel. Beberapa tanda histopatologi jaringan ginjal dibandingkan antar kelompok perlakuan. Pengamatan dilakukan dengan melihat morfologi dari inti dan sitoplasma sel tubuli ginjal, glomerulus dan daerah sekitar interstisial.
Pada pewarnaan imunohistokimia dilakukan pengamatan terhadap distribusi dan frekuensi produk reaksi enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal masing-masing kelompok perlakuan. Pengamatan dilakukan secara kualitatif, kuantitatif, dan penghitungan persentase, dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 20x. Pengamatan Cu,Zn-SOD secara kualitatif dilakukan pada seluruh bagian ginjal yaitu pada inti dan sitoplasma tubuli renalis, glomerulus dan daerah medulla. Pengamatan kuantitatif kandungan Cu,Zn-SOD dilakukan terhadap produk hasil reaksi pada inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan dari Cu,Zn-SOD per lapang pandang dengan perbesaran 20x. Ada empat tingkatan hasil reaksi, yaitu : (i) positif kuat (+++), terlihat warna coklat tua, (ii) positif sedang (++), terlihat warna coklat muda, (iii) positif lemah (+/-), terlihat warna coklat kebiru-biruan serta (vi) hasil reaksi negatif (-), terlihat warna biru. Profil kandungan Cu,Zn-SOD juga dilihat dari persentase jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD.
Analisis Data
Hasil pengamatan terhadap kandungan Cu,Zn-SOD (jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD) dianalisis menggunakan Rancangan Acak Lengkap(RAL) dengan analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjutan-Duncan.
HASIL
Profil Antioksidan Cu,Zn-SOD
Pewarnaan imunohistokimia pada jaringan ginjal menunjukkan bahwa sel tubuli renalis yang mengandung antioksidan Cu,Zn-SOD berwarna coklat pada inti dan sitoplasmanya, sedangkan sel tubuli renalis yang bereaksi negatif berwarna biru pada inti dan sitoplasmanya.
Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD dari jaringan ginjal disajikan secara kualitatif, kuantitatif dan persentase jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Z-SOD. Pengamatan secara kualitatif dilakukan dengan cara melihat perbedaan intensitas warna yang terbentuk pada bagian sitoplasma, sedangkan pengamatan kuantitatif dilakukan dengan cara menghitung jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis didasarkan pada jumlah rata-rata inti sel pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD.
a). Pengamatan Kualitatif
Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal yang diamati secara kualitatif dilakukan dengan cara melihat perbedaan intesitas warna coklat pada keseluruhan jaringan (Gambar 2). Adanya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD ditunjukkan dengan warna coklat dan diberi tanda (+) pada jaringan ginjal kelompok yang diamati. Semakin banyak tanda (+) maka semakin tinggi kandungan dari antioksidan Cu,Zn-SOD. Bagian dari jaringan ginjal yang diamati adalah bagian glomerulus, tubuli proksimalis dan tubuli distalis. Perbedaan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD jaringan ginjal dari semua kelompok dapat dilihat pada tabel 1.
18
Tabel 1. Distribusi dan frekuensi antioksidan pada jaringan ginjal tikus
Kelompok Distribusi dan frekuensi Cu,Zn SOD
Glomerulus T.Proksimalis T.Distalis
K ZE I IZ IE IZE - +/- +/- +/- +/- + +/- + + +/++ +/++ +++ +/- + + +/++ +/++ +++
Keterangan : (+) = adanya kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan, (/) = kandungan Cu,Zn SOD berada diantara dua nilai, (-) = tidak adanya kandungan Cu,Zn-SOD
Hasil pengamatan secara kualitatif menunjukkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal kelompok ZE dan kelompok I lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok K. Hal ini terlihat pada seluruh bagian jaringan ginjal. Pada kelompok IZ dan kelompok IE memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok ZE dan kelompok I. Perbedaan itu terlihat pada tubuli distalis dan tubuli proksimalis. Kelompok IZE memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling tinggi dibandingkan kelompok yang lain dan ini terlihat nyata pada tubuli distalis dan tubuli proksimalis.
19
Gambar 2. Fotomikrograf jaringan ginjal tikus perlakuan. Pewarnaan Imunohistokimia. G : Glomerulus, Tp : Tubuli Proksimalis, Td : Tubuli distalis. Skala 50 µm.
K ZE
IZE
IE
I
IZ
G G G G G G Tp Td Tp Td Td Tp Td Tp Tp Td Tp Td20
b). Pengamatan Kuantitatif
Pengamatan kuantitatif kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal dilakukan dengan menghitung jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Untuk melihat reaksi tersebut dibedakan atas tiga tingkatan intensitas warna untuk reaksi positif dan satu warna untuk reaksi negatif. Reaksi positif terdiri dari positif kuat yang ditunjukkan warna coklat tua (+++), positif sedang yang ditunjukkan warna coklat muda (++), positif lemah ditunjukkan warna coklat campur biru (+/-). Sel yang tidak mengandung kandungan Cu,Zn-SOD atau bereaksi negatif ditunjukkan warna biru (-). Hasil penghitungan jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD tersaji pada tabel 2.
Tabel 2.Rata-rata jumlah sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal tikus perlakuan perlapang pandang pada perbesaran 20x
Kelompok Jumlah inti sel tubuli renalis
+++ ++ +/- - K ZE I IZ IE IZE 9.80 ± 2.74a 22.60 ± 1.71b 21.80 ± 1.93b 25.50 ± 2.27c 26.60 ± 2.37c 33.90 ± 2.33d 36.00 ± 4.29a 54.10 ± 9.21b 66.60 ± 8.64c 73.60 ± 7.83d 76.60 ± 5.10de 82.50 ± 4.09e 72.50 ± 3.59b 70.50 ± 7.76b 69.80 ± 7.48b 67.10 ± 6.50ab 63.40 ± 5.10a 66.70 ± 5.23ab 97.70 ± 5.23d 52.80 ± 5.57c 53.50 ± 5.74c 44.10 ± 5.26b 45.80 ± 3.22b 38.40 ± 3.20a
Keterangan : (+++) = positif kuat, (++) = positif sedang, (+/-) = positif lemah, (-) = negatif. Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata pada (p< 0.05)
Hasil uji statistik terhadap jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD menunjukkan kelompok N memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling rendah dibandingkan dengan kelompok lain. Hal ini terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat dan positif sedang pada kelompok K paling rendah secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok lain. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang paling rendah ini juga terlihat pada jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi negatif pada kelompok K paling tinggi secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok lain.
21
Pada kelompok ZE berdasarkan hasil uji statistik terhadap jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD menunjukkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih rendah dibandingkan dengan kelompok I. Hal ini ditunjukkan dengan jumlah inti sel yang bereaksi positif sedang lebih rendah secara nyata (p<0.05) pada kelompok ZE dibandingkan dengan kelompok I.
Pada kelompok IZ, berdasarkan uji statistik terhadap jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD menunjukkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok I. Hal ini terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat dan positif sedang lebih tinggi secara nyata (p<0.05) pada kelompok IZ dibandingkan dengan kelompok I. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang lebih tinggi ini juga ditunjukkan dengan jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah secara nyata (p<0.05) pada kelompok IZ dibandingkan dengan kelompok I. Sedangkan pada kelompok IE jumlah inti sel yang bereaksi positif (positif kuat, positif sedang dan positif lemah) dan negatif tidak berbeda secara nyata (p>0.05) dibandingkan dengan kelompok IZ. Namun jumlah inti sel yang bereaksi positif sedang pada kelompok IE tidak berbeda secara nyata (p>0.05) dibandingkan dengan kelompok IZE, sedangkan jumlah inti sel yang bereaksi positif sedang pada kelompok IZE lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok IZ. Jadi kelompok IE memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok IZ.
Pada kelompok IZE menunjukkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling tinggi dibandingkan dengan kelompok lain karena jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok lain. Selain itu kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang lebih tinggi juga terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah secara nyata (p<0.05) pada kelompok IZE dibandingkan dengan kelompok lain.
22
c). Penghitungan Persentase
Profil kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada ginjal tikus perlakuan juga ditunjukkan dengan penghitungan persentase jumlah rata-rata inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD (Gambar 3). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Persentase Jumlah Inti Sel Tubuli Renalis K ZE I IZ IE IZE Kelompok (+) (-)
Gambar 3.Persentase jumlah inti sel tubuli renalis yang memberikanreaksi positif (+) dan reaksi negatif (-) terhadap kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD.
Dari hasil penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis yang memberikan reaksi positif dan reaksi negatif terhadap kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD, diketahui bahwa kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok K paling rendah dibandingkan dengan kelompok lain. Hal ini terlihat dari lebih rendahnya persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif yaitu 55%. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling rendah juga terlihat pada paling tingginya persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 45% pada kelompok K dibandingkan dengan kelompok lain.
Pada kelompok ZE, berdasarkan hasil penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD sedikit lebih rendah dibandingkan dengan kelompok I. Hal ini ditunjukkan dengan lebih tingginya persentase jumlah sel tubuli yang bereaksi negatif 26% pada kelompok ZE dibandingkan dengan kelompok I yang memiliki persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 25 %.
Kelompok I memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih rendah dibandingkan dengan kelompok IZ dan kelompok IE. Hal ini terlihat dari lebih rendahnya persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif 75% pada kelompok I
23
dibandingkan dengan kelompok IZ dan IE yang memiliki persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif 78% dan 79%. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih rendah juga terlihat pada lebih tingginya persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 25% pada kelompok I dibandingkan dengan kelompok IZ dan IE yang memiliki persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 22% dan 21%.
Pada kelompok IZE, berdasarkan hasil penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang paling tinggi dibandingkan dengan kelompok lain. Hal ini ditunjukkan dengan lebih tingginya persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif yaitu 83%. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang paling tinggi juga terlihat dari lebih rendahnya persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif 17% pada kelompok IZE dibandingkan dengan kelompok lain.
Gambaran Morfologi Ginjal
Gambaran morfologi ginjal tikus pada semua kelompok perlakuan dapat terlihat dengan menggunakan pewarnaan Hematoksilin dan Eosin (HE). Secara umum, pada semua kelompok inti sel-sel tubuli renalis berbentuk bulat dan mengambil warna biru. Seperti halnya pada bagian inti, sitoplasma dari sel-sel epitel tubuli renalis mengambil warna merah.
Hasil pengamatan terhadap morfologi umum jaringan ginjal, pada kelompok K menunjukkan adanya infiltrasi sel radang dan degenerasi sel berkisar 10%-20%. Sedangkan pada kelompok ZE, I, IZ, IE dan IZE tidak menunjukkan gambaran histopatologis (Gambar 4).
24
Gambar 4. Fotomikrograf jaringan tikus perlakuan. Pewarnaan HE. G : Glomerulus, Tp Tubuli proksimalis, Td : tubuli distalis, a : degenerasi sel, b : nekrosa sel, c : infiltrasi sel radang. Skala 50 µm.
G G G G G G
K ZE
IZ
Tp Td Td Td Td Td Td Tp Tp Tp Tp Tp b aI IE
cIZE
PEMBAHASAN
Profil Antioksidan Cu,Zn-SOD
Metabolisme merupakan aktivitas yang sangat penting di dalam kehidupan makhluk hidup karena metabolisme menghasilkan energi yang bermanfaat bagi aktivitas hidup. Makhluk hidup tingkat tinggi melakukan sebagian besar proses metabolismenya dalam suasana aerobik (membutuhkan O2). Bahan-bahan makromolekul dari hasil pencernaan (karbohidrat, protein, lipid) dimetabolisme menjadi molekul yang lebih kecil (hasil akhir berupa energi bebas) dengan cara oksidasi. Proses oksidasi bahan-bahan makromolekul akan menghasilkan produk sampingan berupa radikal bebas (Voet dan Voet 1995). Radikal bebas adalah atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak stabil (mempunyai satu elektron atau lebih yang tanpa pasangan pada orbital terluarnya), sehingga untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak sel. Sebenarnya radikal bebas sangat berperan didalam rantai transport elektron proses metabolisme aerobik(reaksi redoks)(Voet dan Voet 1995). Untuk mengatasi sifat radikal bebas yang tidak stabil, reaktif dan cenderung merusak, tubuh akan memberikan respon penggunaan enzim yang bersifat antioksidatif (antioksidan endogen).
Antioksidan superoksida dismutase (SOD) merupakan salah satu enzim yang bertanggung jawab dalam menjaga tubuh dari radikal bebas (Kerksick dan Willoughby 2005) terutama antioksidan Cu,Zn-SOD merupakan lini pertahanan pertama dalam melawan radikal bebas (Desphande et al. 1996). Enzim ini akan bereaksi dengan anion superoksida menjadi hidrogen peroksida (H2O2) yang lebih stabil atau tidak berbahaya bagi tubuh (Hwang et al. 2005). Selanjutnya H2O2
akan dinetralisir oleh enzim katalase dan glutathion peroksidase.
Kandungan antioksidan Cu,Zn SOD paling rendah dimiliki oleh kelompok K dibandingkan kelompok lain. Hal ini disebabkan oleh tidak adanya penambahan isoflavon, vitamin E dan zinc pada ransum kelompok K. Tidak adanya bantuan isofalvon dan vitamin E sebagai antioksidan (Ames et al. 1993) serta zinc sebagai metaloenzim antioksidan seluler (Cu,Zn-SOD dan Katalase) (Powell 2000) untuk
26
mengatasi radikal bebas, tubuh melakukan perlawanan dengan penggunaan antioksidan seluler sehingga terjadi penurunan kandungan antioksidan tubuh.
Pemberian vitamin E dan zinc pada ransum kelompok ZE dapat memberikan pengaruh yang nyata terhadap tingginya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Hal ini disebabkan karena vitamin E mempunyai peran sebagai antioksidan yang melindungi membran bilayer sel dari peroksidasi lipid dengan cara membentuk ikatan dengan radikal bebas ( Noguchi and Niki 1998). Zinc adalah trace mineral esensial yang berperan dalam berbagai reaksi enzimatis dalam tubuh dan sebagai kofaktor beberapa sistem enzim antioksidan : Cu,Zn-SOD (Bunker 1992).
Pada kelompok I dengan pemberian isoflavon memberikan pengaruh yang nyata terhadap tingginya kandungan Cu,Zn-SOD. Isoflavon adalah senyawa golongan flavonoid yang mempunyai peran sebagai antioksidan yang kuat terutama Genistein (Wei et al. 1996). Mekanisme kerja isoflavon sebagai antioksidan ditunjukkan dengan banyak cara, diantaranya yaitu dengan menangkap radikal bebas secara langsung (Nijveldt 2001) dan mempertahankan stabilitas membran terhadap peroksidasi lipid (Wiseman et al. 1993). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok I lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok ZE. Hal ini disebabkan isoflavon secara struktur molekul memiliki dua
pharmacophore yang bersifat antioksidatif yaitu grup 4’hydroxyl pada B-ring dan grup hydroxyl AC-ring (Gambar 5). Keduanya dapat sebagai donor hidrogen/elektron (Heijnen et al. 2002).
27
Dengan adanya dua pharmacophore tersebut aktivitas sebagai scavanger radikal bebas semakin tinggi (Wu 2005). Berbeda dengan isoflavon, vitamin E hanya mempunyai satu pharmacophore yang berperan sebagai donor hidrogen/elektron (Gambar 6). Sedangkan zinc hanya sebagai kofaktor sistem enzim antioksidan (tidak secara langsung melawan radikal bebas). Sehingga kapasitas isoflavon sebagai antioksidan lebih tinggi dibandingkan dengan kobinasi vitamin E dan zinc.
Gambar 6. struktur molekul vitamin E (sumber Manalu, 1999)
Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok IZ dan IE lebih tinggi secara nyata dibandingkan dengan kelompok I. Hal ini disebabkan adanya kombinasi isoflavon dengan zinc pada kelompok IZ dan kombinasi isoflavon dengan vitamin E pada kelompok IE. Pada kelompok IZ, isoflavon berperan sebagai scavenger radikal bebas (Cristobal, 2000) dan mempertahankan stabilitas membran dari peroksidasi lipid sedangkan zinc berperan sebagai kofaktor sistem enzim antioksidan (Cu,Zn-SOD). Pada kelompok IE, isoflavon dan vitamin E mempunyai fungsi antioksidan yang hampir sama yaitu scavenger radikal bebas dan mempertahankan stabilitas membran dari peroksidasi lipid. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok IE sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok IZ. Hal ini mungkin disebabkan adanya dua antioksidan yang berperan sebagai scavenger radikal bebas yaitu isoflavon dan vitamin E pada kelompok IE. Sedangkan pada kelompok IZ hanya ada isoflavon sebagai
scavenger radikal bebas dan zinc yang tidak secara langsung melawan radikal bebas.
28
Kelompok IZE memiliki kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling tinggi dibandingkan dengan kelompok lain. Hal ini menunjukkan penggunaan antioksidan endogen berkurang karena pada kelompok ini dikombinasikan pemberian isoflavon, vitamin E dan zinc. Isoflavon dan vitamin E bersinergi sebagai scavenger radikal bebas dan pelindung membran dari peroksidasi lipid serta dibantu zinc sebagai motor reaksi enzimatis dan kofaktor sistem enzim antioksidan. Sehingga dengan kombinasi dari tiga bahan tersebut membentuk pertahanan yang kuat dari serangan radikal bebas.
Morfologi Ginjal
Ginjal adalah organ pengatur utama cairan tubuh dan alat ekskresi tubuh. Menurut Dellman dan Brown (1992) fungsi utamanya adalah mengatur cairan elektrolit, mengeluarkan limbah metabolisme, memusnahkan zat toksik dan kesetimbangan asam basa serta tekanan darah. Karena mempunyai fungsi sebagai alat ekskresi tubuh, produksi radikal bebas di ginjal akan lebih banyak dibandingkan dengan organ lain. Radikal bebas tersebut merupakan molekul reaktif atau molekul yang tidak stabil, sehingga untuk melengkapi kekurangan tersebut radikal bebas akan berikatan dengan senyawa makromolekul seperti karbohidrat, protein dan lipid yang merupakan komponen pembentuk sel tubuh (Desphande et al. 1996).
Dengan pewarnaan Hematoksilin dan Eosin (HE) hasil penelitian menunjukkan pada kelompok K ditemukan lebih banyak infiltrasi sel radang dan sel yang mengalami degenerasi dan nekrosa dibandingkan dengan kelompok lain. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh penyerangan radikal bebas terhadap sel dan lemahnya kemampuan antioksidan endogen mengatasi hal tersebut (terjadi penurunan kandungan antioksidan endogen). Sehingga sel mengalami degenerasi yang menyebabkan terjadinya infiltrasi sel radang.
Pada jaringan ginjal kelompok ZE, I, IZ, IE dan IZE yang diberi isoflavon, vitamin E dan zinc tidak menunjukkan adanya perubahan histopatologis. Pemberian isoflavon, vitamin E dan zinc dapat mengatasi serangan radikal bebas sehingga memberikan dampak pada sedikitnya kerusakan sel akibat radikal bebas.