DAFTAR PUSTAKA
Lampiran 10 Pewarnaan Silver Metode Vorum (Moertz et al , 2001) Prosedur
1. Setelah gel dilepaskan dari perangkat elektroforesis, gel difiksasi dalam larutan fiksasi selama 2 jam sampai satu malam
2. Cuci gel dalam 35% etanol selama 30 menit x 3 3. Rendam gel dalam larutanenhancerselama 2 menit 4. Cuci gel dengan akuades selama 5 menit x 3
5. Rendam gel dalam larutan pewarna selama 20 menit 6. Cuci dengan akuades selama 20 detik x 2
7. Bila perlu, potong marker dan pisahkan dari sampel untuk diwarnai dengan silver
8. Rendam gel dalam larutandeveloperhingga pita-pita muncul 9. Hentikan reaksi pewarnaan dengan menuang larutanstopper 10. Cuci gel dengan akuades selama 5 menit x 3
11. Packing dan scanning gel atau simpan gel dalam 1% asam asetat (4oC)
Formula Larutan
Larutan Fiksasi : 50% metanol, 10% asam asetat Larutan Pencuci : 35% etanol
LarutanEnhancer/Sensitivasi : 0.02% Na2S2O3 Larutan Pewarna : 0.2% AgNO3, akuades
LarutanDeveloper: 6% Na2CO3, 0.0004% Na2S2O3 Larutanstopper: 50% metanol, 10% asam asetat
ABSTRACT
ELFI. Purification of Proteases from Noni (Morinda citrifolia L.) Leaves. Under guidance of NURI ANDARWULAN and DAHRUL SYAH
It has been proved that protease could tenderize meat and octopuses. One of the protease sources is noni (Morinda citrifolias L.) leaves. Yet, the study of proteases in noni leaves has not been reported. The research was aimed to characterize physic and chemistry of noni leaves and purify the protease of noni leaves both from base and shoot part.
The physic and chemistry characterization of noni leaves was done by observation and proximate analysis, respectively. The purification of noni leaves proteases was conducted by several steps consisting of extraction, centrifugation, precipitation using saturated ammonium sulfate (100%), dialysis and electrophoresis also zymography.
The noni leaves used in this research have facing position, large and thick size, single, flat edge, pinnate veins, green-shiny color, and hairless. Base leaves are dark green dan shoot leaves are light green. The proximate analysis showed that the protein content of base noni leaves (2.92%dry base) was lower than shoot leaves (2.98% dry base). Purification of noni leaves proteases showed that the crude extract of base leaves had higher enzyme specific activity (0.46U/mg protein) than the crude extract of shoot leaves (0.43U/mg protein). Protein content of base leaves (11.29%) was lower than the other (11.47%). Noni leaves purification steps decreased protease specific activity. SDS-PAGE of shoot and base leaves dialysates showed the polypeptides molecular weights were 58- 61.5kDa and 70kDa respectively; whereas zymogram showed the molecular weight of the enzymes are 39kDa and 50kDa.
PENDAHULUAN
Latar BelakangMakhluk hidup termasuk tumbuhan membutuhkan reaksi biokimia seluler yang melibatkan enzim untuk menjaga kelangsungan hidupnya. Salah satu enzim yang terlibat adalah protease. Pada tanaman protease tidak hanya diperlukan untuk degradasi protein, tetapi juga untuk pertahanan tubuh, perkembangan dan pematangan buah, aktifasi proenzim, penguraian simpanan protein dalam biji yang sedang berkecambah dan lain sebagainya.
Beberapa enzim dari tumbuhan, mikroba dan binatang seperti lipase, karbohidrase dan protease sudah diisolasi, dimurnikan dan diaplikasikan pada berbagai industri. Menurut Aehle (2007) enzim banyak diaplikasikan untuk keperluan medis, industri pangan, industri kosmetik, industri farmasi dan lain sebagainya. Dalam industri pangan khususnya, enzim lipase, karbohidrase dan protease merupakan enzim yang banyak digunakan.
Perdagangan protease mencapai 60% dari total penjualan enzim dunia yang mencapai dua milliar US$ dengan peningkatan nilai jual mencapai enam hingga tujuh persen pertahun, sedangkan dari kuantitasnya meningkat sebesar 10 hingga 15% pertahun (Suhartono, 2000). Impor enzim Indonesia pun juga terus meningkat dari 124,1 juta US$ pada tahun 2000 (BPS, 2000) menjadi 127.4 juta US$ pada tahun 2001 (BPS, 2001).
Mengkudu (Morinda citrifolia L.) termasuk tumbuhan keluarga kopi-kopian (Rubiaceae), yang pada mulanya berasal dari wilayah daratan Asia Tenggara dan kemudian menyebar sampai ke Cina, India, Filipina, Hawai, Tahiti, Afrika, Australia, Karibia, Haiti, Fiji, Florida dan Kuba. Secara keseluruhan mengkudu merupakan bahan makanan yang bergizi lengkap.
Mengkudu banyak terdapat di Indonesia. Produksi mengkudu pun di Indonesia meningkat setiap tahun. Pada tahun 2003 produksi mengkudu mencapai 1,9 ton meningkat pesat pada tahun 2007 menjadi 14 ton (Departemen Pertanian Republik Indonesia, 2008).
Sebagian besar adat budaya Polinesia pada masa lampau maupun sekarang, menggunakan buah mengkudu sebagai makanan utama. Penduduk asli kepulauan
Pasifik Selatan mengkonsumsi buah mengkudu untuk dapat bertahan hidup pada waktu kelaparan. Para prajurit yang menetap di kepulauan Polinesia selama perang dunia II dianjurkan untuk mengkonsumsi buah mengkudu untuk menambah kekuatan dan tenaga. Zat-zat nutrisi yang dibutuhkan tubuh antara lain: karbohidrat, protein, vitamin, dan mineral-mineral esensial juga tersedia dalam buah maupun daun mengkudu (Nelson, 2006).
Hasil penelitian Heinicke seperti yang dikutip oleh Wang et al. (2002) menunjukkan bahwa mengkudu mengandung prekursor alami xeronine (proxeronin). Proxeronine diubah menjadi xeronine di dalam tubuh oleh enzim proxeroninase. Xeronine merupakan sejenis alkaloid yang mampu memodifikasi struktur molekul protein. Jika protein mengalami kerusakan maka xeronine akan berinteraksi dengan protein dan mengembalikan konformasinya ke bentuk yang sesuai sehingga dapat berfungsi kembali. Senyawa ini juga banyak terdapat pada bromelain (nenas). Bangun dan Sarwono (2002) juga menyebutkan bahwa dalam jus buah mengkudu terdapat berbagai senyawa kimia dan enzim yang diduga mampu bekerja sama secara sinergistik dalam menyembuhkan penyakit.
Daun mengkudu di Tonga digunakan sebagai pengempuk daging (Walter et al., 2002), mirip dengan penggunaan daun papaya yang juga digunakan untuk pengempuk daging. Penelitian pada papaya telah membuktikan protease (papain) yang bertanggung jawab untuk pengempukkan daging. Protease pada daun mengkudu sejauh ini belum ada yang melaporkan.
Selain hal tersebut diatas, perdagangan protease yang terus meningkat setiap tahun ikut melatarbelakangi penelitian tentang pemurnian protease dari daun mengkudu. Oleh karena itu pencarian sumber enzim merupakan potensi usaha yang sangat potensial.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan :
1. Mengkarakterisasi sifat fisik dan kimia daun mengkudu pada dua tingkat ketuaan yang berbeda.
2. Memurnikan protease dari daun mengkudu pada dua tingkat ketuaan yang berbeda.
3. Menentukan bobot molekul protease dari mengkudu pada dua tingkat ketuaan yang berbeda.
TINJAUAN PUSTAKA
Mengkudu (Morinda citrifoliaL.)
Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dikenal secara komersial dengan sebutan noni, banyak ditemukan di sepanjang Kepulauan Pasifik. Mengkudu pada mulanya berasal dari wilayah daratan Asia Tenggara dan kemudian menyebar sampai ke Cina, India, Filipina, Hawaii, Tahiti, Afrika, Australia, Karibia, Haiti, Fiji dan Florida. Mengkudu dikenal dengan berbagai nama yaitu mengkudu, pace, kemudu, kudu (Jawa), cangkudu (Sunda), kodhuk (Madura), wengkudu (Bali), noni (Hawaii), nono (Tahiti), nonu (Tonga), ungcoikan (Myanmar) dan ach (Hindi), indian mulberry (Inggris), kikiri di pulau Solomon, kura di Fiji dan lain-lain (Nelson, 2006).
Pengklasifikasian mengkudu adalah : Filum : Angiospermae Sub filum : Dycotiledones Divisi : Lignosae Famili : Rubiaceae Genus :Morinda Spesies :citrifolia
Mengkudu merupakan tanaman perdu atau pohon kecil yang tumbuh agak membengkok dengan tinggi 3-8m, banyak bercabang dengan ranting persegi empat. Letak daun berhadapan secara bersilang, bertangkai, bentuknya bulat telur sampai berbentuk oval, panjang 10-40cm dengan lebar 5-17cm, tebal mengkilap, tepi rata, ujung runcing, bagian pangkal menyempit, tulang daun menyirip dan bewarna hijau tua (Wijayakusuma, 1998). Pohon mengkudu dapat dilihat pada Gambar 1.
Mengkudu dapat tumbuh dalam lingkungan yang kurang subur, tanah yang asam dan basa baik tanah kering maupun basah. Semua bagian tanaman mengkudu mempunyai manfaat dibidang kesehatan maupun industri. Akar dan kulit pohon digunakan untuk pewarna dan obat, batang untuk kayu bakar dan membuat peralatan, serta daun dan buah yang dijadikan sebagai makanan dan obat-obatan (Nelson 2006).
serta triptofan (EFSA, 2008). Hal yang sama juga dinyatakan oleh Wijayakusuma (1998) bahwa daun mengkudu mengandung protein, zat kapur, zat besi, karoten dan askorbat, selain itu juga mengandung asam kapron dan kaprilat yang mudah menguap. Komposisi kimia daun mengkudu dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi Kimia Daun Mengkudu (mentah)
Komposisi Daun Mengkudu Satuan Per 100 g
Air g 93.7 Protein g 1 Lemak g 0.2 Karbohidrat g 4.4 Serat g 1.1 Abu g 0.7 Kalsium ng 0.7 Fosfor mg 93 Besi mg 4.4 Beta karoten mg 0.3 Riboflavin mg 0.07 Niasin mg 5.6 Asam askorbat mg 50 Sumber : EFSA (2008) Protease Tumbuhan
Semua sel tumbuhan mengandung lebih dari 10.000 protein. Beberapa dari protein ini mungkin tidak dibutuhkan lagi karena sudah tidak berfungsi. Beberapa yang lain mungkin rusak selama sintesis atau karena kelebihan panas atau karena stress lainnya. Lainnya beberapa enzim didisain berumur pendek karena hanya dibutuhkan pada awal reaksi dan protein yang mengalamimisfolding. Alasan ini membuat protein merupakan subjek untuk didegradasi oleh enzim proteolitik yang disebut protease (Hopkin dan Norman (2004).
Degradasi protein adalah bentuk kegiatan menjaga sel atau pemeliharaan sel dimana protein yang tidak diinginkan atau rusak diurai menjadi asam amino dan dapat digunakan kembali. Biasanya hampir separuh protein penyusun sel diganti setiap 4-7 hari. Protein didegradasi di beberapa bagian sel seperti kloroplas, nukleus, mitokhondria, vakuola serta sitosol (Hopkin dan Norman, 2004).
Selama proses pelayuan tumbuhan, kadar total protein menurun seiring dengan meningkatnya aktifitas enzim proteolitik dan menurunnya sintesa protein.
Degradasi protein dan remobilisasi dari asam amino ke jaringan yang berkembang merupakan proses metabolisme yang utama dalam proses pelayuan (Nooden, 2004).
Klasifikasi Protease
Naz (2002) mengklasifikasikan protease menjadi beberapa subklas. Diantaranya yaitu serin (EC. 3.4.21) memiliki residu ser pada sisi aktif, sistein (EC.3.4.22) yang memiliki residu cys pada sisi aktif, aspartat (EC.3.4.23) tergantung residu Asp pada aktifitas katalitiknya dan metalloprotease (EC.3.4.24) yang menggunakan ion metal pada mekanisme katalitiknya.
Protease sistein menghidrolisa ikatan peptida protein dan dapat dihambat oleh peraksi sulfidril. Protease sistein yang diambil dari tumbuhan diantaranya papain dari pepaya (EC.3.4.4.10), fisin dari fig (EC.3.4.4.12), dan bromelain dari nenas (EC.3.4.4.24). Protease sistein dipercaya sebagai protease utama yang terlibat dalam hidrolisis protein. Protease sistein telah diidentifikasi dari pelayuan daun, pelayuan bunga dan pematangan buah (Nooden, 2004).
Protease sistein atauthiol proteasememegang peranan penting dalam respon tanaman menghadapi ransangan. Ransangan seperti protein rusak dan misfolded, pathogen, suhu lingkungan seperti panas atau dingin, kekurangan air dan lainnya. Protein rusak atau protein yang mengalamimisfolded harus dihilangkan dengan degradasi protein dan digantikan oleh protein yang baru. Peristiwa degradasi atau rusaknya protein selalu diikuti oleh penyusunan protein yang baru (Grudkowska dan Zagdanska, 2004) .
Protease sistein muncul pada daun gandum sebagai respon menghadapi kekurangan air seperti yang dilaporkan oleh Simova-Stoilova et al. (2010). Forsthoefelet al. (1998) juga mengidentifikasi protease sistein yang muncul pada daun Mesembryanthemum crystallinum dalam menghadapi tekanan lingkungan yaitu salinitas yang tinggi.
Protease sistein juga terlibat dalam degradasi protein. Pada saat germinasi biji barley, 42 protease terlibat dan 27 diantaranya adalah protease sistein (Zhang dan Jones, 1996), sedangkan pada saat berkecambahnya jagung (De Baros dan
Larkins, 1990) dan gandum (Bottari et al., 1996), 90% protease yang terlibat dalam degradasi prolamin (protein utama sereal) adalah protease sistein.
Programmed cell death (PCD) adalah salah satu mekanisme pertahanan tanaman menghadapi serangan patogen (Grudkowska dan Zagdanska, 2004). Caspase-like proteinase merupakan protease sistein yang terlibat dalam PCD yang ditemukan pada tembakau yang terinfeksi tobacco mosaic virus (Del Pozo dan Lam, 1998). Di bawah ini (Tabel 2) adalah beberapa protease sistein yang telah dikenal masyarakat.
Kelas protease yang lain adalah protease serin. Protease serin pun telah diisolasi dan dimurnikan dari berbagai tanaman dan organ tanaman. Protease serin ada di biji, buah bahkan getah tanaman. Protease serin yang berasal dari biji diantaranya biji barley (Hordeum vulgare L cv Morex), kacang kedele (Glycine max L. Merr) dan padi (Oryza sativa L). Protease serin yang diisolasi dari getah diantaranya : Euphorbia supina, dandelion (Taraxacum officinale Webb. SI.), dan nangka (Artocarpus heterophyllusL) (Antao dan Malcata, 2005). Di bawah ini (Tabel 3) adalah beberapa protease serin yang telah diisolasi dari berbagai tumbuhan.
Protease serin sangat berperanan dalam perkembangan dan pertumbuhan tanaman. Fungsi protease serin pada tanaman diantaranya adalah respon tanaman terhadap serangan pathogen yang mengakibatkan nekrosis dan kematian sel sehingga pertumbuhan pathogen terganggu, pembelahan sel jaringan pada tanaman, proses pelayuan, mikrosporogenesis dan sebagainya (Antao dan Malcata, 2005).
Protease aspartat adalah kelas protease yang lain. Pepsin dan renin adalah enzim yang tergolong ke dalam kelas protease aspartat. Pepsin mempunyai berat molekul 35kDa dan disusun oleh rantai polipeptida tunggal yang terdiri dari 321 asam amino. Penggunaan renin dalam pembuatan keju telah dikenal luas (Naz, 2002).
Kelas protease yang lain adalah metaloprotease. Salah satu contoh metaloprotease adalah termolisin. Termolisin diproduksi oleh Bacillus stearothermophilus yang aktif dengan adanya ion Ca. Termolisin dan juga metaloprotease lain dapat dihambat oleh senyawa pengkelat seperti EDTA, sitrat
dan fosfat yang sering digunakan dalam bahan tambahan pangan. Termolisin mempunyai berat molekul 34kDa (Naz, 2002).
Tabel 2. Beberapa Protease sistein Tanaman
Enzim Tumbuhan Berat Moleku l (kDa)
Metode Pemurnian Referensi
Stem Bromelain Fruit Bromelain Bromelain Stem bromelain Bromelain Stem bromelain Stem bromelain Ananain Papain Papain Protease sistein Protease sistein Protease sistein Phaseolus vulgarisleaf cysteine proteinase 1 dan 3 Nenas Nenas Nenas Nenas Nenas Nenas Nenas Bromelain batang nenas Carica papaya Carica papaya Barley jagung Triticum aestivum Phaseolus vulgaris 22.831 39.055 34.159 33 38.823 35 23 25 & 26 38.922 23 29-37 12-36 61-62,5 30 dan 25,1 - - - - - Sedimentasi, ultrasentrifugasi Analisis asam amino SDS-PAGE Kromatografi afinitas, sepharose semi carbazone, kromatografi penukar kation - - - - Filtrasi gel, SDS- PAGE Filtrasi gel, 2 kromatografi penukar ion, kromatografi kovalen pada tioprofil-sepharose UniProt (2010) UniProt (2010) UniProt (2010) Murachiet al.(1964)*) UniProt (2010) Otaet al.(1964)*) Bobb (1972)*) Rowanet al.(1988) UniProt (2010) Naz (2002)
Poulle dan Jones (1996)**), Zhang &Jones (1996)**) Abeet al. (1977)**) Fahmyet al.(2004) Popovicet al.(1998) Sumber :*)Wharton (1974) **)Fahmy et al(2004)
Tabel 3. Berbagai Protease serin dari Tumbuhan
Enzim Tumbuhan Metode Pemurnian Berat
Molekul (kDa) Referensi Plantagolisis Protease serin Cucumisin (EC 3.4.21.25) Protease serin Kiwano protease Protease B Protease serin Plantago maior C.melo L. C. melo L.var.Prince Cucurbita ficifolia Cucumis metuliferus E. supine Triticum aestivumcv. Pro INTA Isla Verde
Amm sulfat, kromatografi afinitas pada bacitrasin- sepharose, kromatografi penukar ion pada mono-Q Amm sulfat, filtrasi gel, kromatografi penukar ion Kromatografi penukar ion pada CM-selulosa, filtrasi gel sephadex G-75
Amm. Sulfat, filtrasi gel pada sephacryl S-300, kromatografi penukar ion pada CM sepharose Amm sulfat, kromatografi penukar ion pada CM- sepharose
Kromatografi penukar ion pada DEAE-sepharose, filtrasi gel pada sepharil S-300
Amm sulfat, filtrasi gel pada sepharil S-200, kromatografi penukaranion pada kolom Q
19 26 54 60 78 80 110 Bogacheva (2001)*) Nodaet al.(1994)*) Kaneda dan Tominaga (1975)*), Yamagata et al.(1989)*) Curottoet al. (1989)*) Uchikobaet al.(2001)*) Arimaet al.(2000)*) Robertset al.(2003)*) Sumber :*) Antao dan Malcata (2005)
Pemurnian Enzim
Pemurnian enzim bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan dari senyawa lain yang tidak dikehendaki. Tahap-tahap pemurnian bergantung pada tujuan akhir yaitu tujuan komersial atau penelitian. Enzim kasar atau yang dimurnikan sebagian masih dapat digunakan untuk komersial, sedangkan enzim murni atau hampir murni dikehendaki dalam penelitian atau dipakai dalam produk analitik.Harris (1989) menyebutkan, minimal ada tiga strategi dalam pemurnian enzim yang harus diperhatikan yaitu (1) kualitas; perlu tindakan untuk mempertahankan aktifitas protein dengan cara mengurangi proteolisis dan denaturasi, (2) kuantitas; pemakaian akhir dari protein murni akan menentukan kuntitas enzim yang diperlukan, (3) ekonomis; merupakan hal penting bila akan digunakan di industri atau diterapkan dalam skala laboratorium. Secara umum pemurnian enzim dapat dibagi menjadi ekstraksi, pemekatan dan fraksinasi. Ekstraksi Enzim
Ekstraksi bertujuan untuk memisahkan enzim dari sumbernya, yaitu tanaman, hewan maupun mikroba. Adapun kelebihan enzim dari tanaman diantaranya adalah terjaganya ketersediaan yaitu bisa dipanen berulang-ulang. Menurut Bollag dan Edelstein (1991) metode yang bisa dipilih dalam ekstraksi tanaman adalah blade homogenization atau blender maupun grinding (penggerusan).
Buffer digunakan dalam proses ekstraksi enzim untuk menjaga pH lingkungan sehingga diharapkan mampu meminimalkan denaturasi dan inaktivasi enzim. Buffer ekstraksi dapat ditambah beberapa bahan kimia dengan tujuan untuk mencegah kerusakan enzim. Bahan kimia yang bisa ditambahkan diantaranya EDTA, gliserol dan lain-lain (Harris, 1989).
Pemekatan Enzim
Pemekatan enzim dilakukan untuk memisahkan konsentrat protein dari komponen biomolekul lainnya diantaranya karbohidrat, lemak dan asam nukleat. Ada dua metode pemekatan enzim yaitu analitik dan preparatif (penyiapan).
Metode analitik menggunakan pengendapan asam (misalnya asam trikloroasetat), pengendapan organik (misalnya aseton atau etanol), dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Metode preparatif bertujuan untuk tetap mempertahankan aktifitas enzim, misalnya menggunakan garam, pelarut organik, polimer organik, ultrafiltrasi dan liofilisasi (Bollag dan Edelstein, 1991).
Prinsip presipitasi dengan garam adalah mengendapkan protein sehingga protein terpisah dari komponen terlarut lainnya. Garam yang dapat digunakan untuk presipitasi diantaranya ammonium sulfat dan sodium sulfat. Ammonium sulfat lebih disukai karena solubilitasnya tinggi, harga murah, non toksik dan tidak mempengaruhi struktur protein (Suhartono, 1989).
Sisa garam dari proses presipitasi enzim dihilangkan dengan cara dialisis menggunakan kantong selofan dan ultrafiltrasi. Dengan demikian, konsentrat enzim bebas garam dapat dimurnikan lebih lanjut dengan fraksinasi enzim (Bollag dan Edelstein, 1991).
Fraksinasi enzim
Fraksinasi merupakan tahap akhir dalam pemurnian enzim, yang bertujuan untuk memisahkan enzim dari protein non enzim lainnya. Metode fraksinasi umum untuk pemurnian enzim, meliputi kromatografi kolom dan elektroforesis. Elektroforesis adalah suatu teknik untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatan dan berat molekul.
Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE = Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode yang sering digunakan dalam analisis sampel biologis karena kemampuannya dalam memisahkan campuran protein yang kompleks dengan baik dan resolusi yang tinggi (Bollag dan Edelstein, 1991). Elektroforesis pada gel poliakrilamida adalah metode yang paling sering digunakan untuk karakterisasi protein dan campuran protein, karena prosedur ini relatif cepat dan sensitif.
Elektroforesis didefnisikan sebagai perpindahan partikel-partikel bermuatan karena pengaruh muatan medan listrik. Mekanisme pada elektroforesis gel poliakrilamida sodium dodesil sulfat (SDS-PAGE) adalah protein akan bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks berikatan
dengan SDS. Kompleks protein yang bermuatan negatif ini kemudian akan terpisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel. Berat molekul protein dapat diukur menggunakan protein standar yang telah diketahui berat molekulnya dengan cara membandingkan nilai mobilitas relatifnya (Rf) (Bollag dan Edelstein 1991).
Zimografi adalah teknik elektroforesis untuk menetapkan aktifitas enzim secara in situ. Berbeda dengan SDS-PAGE, gel pemisah zimografi mengandung substrat enzim yang akan dihidrolisis oleh enzim selama masa inkubasi. Enzim dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS), namun dalam kondisi tidak tereduksi. Penambahan deterjen Triton X-100 akan melepaskan SDS sehingga protein kembali melipat (renaturasi). Gel selanjutnya diwarnai sehingga molekul protein yang memiliki aktifitas tampak sebagai pita bening. Metode zimografi bersifat mudah, sensitif dan kualitatif dalam menganalisis aktifitas enzim. Adapun substrat yang bisa digunakan untuk zimogram diantaranya kasein, gelatin dan lain-lain (Leber dan Balkwill 1997).
Aplikasi Protease
Keunggulan utama penggunaan enzim pada proses industri adalah (a) kespesifikan enzim terhadap substrat sehingga mampu menghasilkan produk dalam jumlah maksimal dengan produk samping yang minimal, (b) enzim mampu mereduksi konsumsi energi yang akan menurunkan Greenhouse Gas Emission (GGE), (c) enzim juga mampu mereduksi konsumsi air dan produk limbah selama proses industri berlangsung. Keunggulan enzim tersebut akan meminimalkan resiko dan dampak proses indutri bagi kehidupan manusia dan lingkungan.
Enzim protease dimanfaatkan diantaranya untuk pembuatan keju, pengempuk daging, penjernih bir, pembuatan hidrolisa protein kedele, penyembuh luka serta terapi untuk tumor, pembengkakan dan penggumpalan darah.
Pembuatan keju
Contoh klasik penggunaan protease adalah untuk pembuatan keju (Naz, 2002). Pengolahan susu menjadi keju menggunakan enzim protease. Contoh protease yang bisa digunakan untuk mengolah keju adalah renin atau kimosin.
Renin bisa diperoleh dari lambung anak sapi dan mikroba. Aktifitas penggumpalan kasein susu oleh renin berlangsung dengan hasil optimum dibandingkan dengan protease lain seperti pepsin.
Kasein merupakan kompleks fosfoprotein yang membentuk suspensi koloid yang terdiri dari α, β, γ dan kapa kasein. Renin menghidrolisa kapa kasein hingga menimbulkan destabilisasi struktur koloid dan menimbulkan proses penggumpalan α dan β kasein bila terdapat kalsium dan fosfat pada lingkungan. Gumpalan ini merupakan jalinan molekul para kapa kasein dan makropeptida, air, laktosa, mineral, globula lemak, vitamin dan sejumlah senyawa terlarut lainnya di dalam gumpalan tersebut (Suhartono, 1989) dan (Naz, 2002). Enzim renin mempunyai berat molekul sebesar 31kDa. Renin paling menonjol dalam menggumpalkan kasein dibandingkan dengan protease lain (Suhartono, 1989). Pengempuk daging
Penggunaan potease untuk pengempuk daging telah dilakukan dari zaman dulu, yaitu menggunakan daun pepaya untuk mengempukkan daging. Setelah diisolasi dan diteliti diketahui bahwa enzim yang berperanan dalam menguraikan protein daging adalah protease. Protease yang diisolasi dari pepaya dikenal dengan papain. Papain terdiri dari 102 asam amino berberat molekul 21kDa dengan sisi aktif yang melibatkan histidin 159 dan sistein 25 (Suhartono, 1989).
Papain cocok digunakan untuk pengempuk daging karena aktif pada pH daging. Enzim ini memotong protein daging pada sisi karboksil valin, lisin dan arginin. Komponen yang paling aktif dari getah pepaya adalah kimopapain yang aktif dalam lingkungan asam, optimum kimopapain adalah pH 5 dan sesuai dengan pH daging.
Enzim protease yang diisolasi dari tanaman lain pun dapat juga digunakan untuk melunakkan daging. Penelitian yang dilakukan oleh Naveenaet al. (2004) yang memanfaatkan protease dari Cucumis trigonus Roxb (kachri) danZingiber officinaleRoscoe (jahe) untuk mengempukkan daging kerbau.
Penjernih bir
Pada proses pembuatan bir, papain diperlukan untuk menghilangkan protein penyebab kekeruhan pada bir. Kekeruhan ini disebabkan oleh komplek yang