PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

b. Berapa besar peningkatan proliferasi sel limfosit hewan uji dengan

pemberian ekstrak etanolik daun mimba?

# )*#! ! )*'*#!

Sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian

tentang pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dalam meningkatkan proliferasi

sel limfosit tikus jantan galur wistar. Penelitian yang pernah dilakukan terkait

dengan efek imunostimulan tanaman mimba antara lain: Efek Imunomodulator

dari Minyak Mimba ( A.Juss) (Upadhyay, 1992); Modulasi

respon imun humoral dan seluler oleh (Mimba) pada mencit

(Ray, 1996); Efek Imunomodulator NIM;76, suatu Fraksi Menguap dari Minyak

Mimba (Sairam, 1997); Daun mimba Meningkatkan Aktivasi Imun yang

Menghambat Perkembangan dan B16

(Baral, 2004); Preparat mimba meningkatkan respon imun tipe Th1 dan imunitas

anti tumor melawan antigen tumor payudara (Mandal, 2007).

2 #!/##' ! )*'*#!

Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap proliferasi sel

limfosit ini diharapkan bermanfaat antara lain:

a. manfaat teoritis penelitian ini adalah menambah khasanah ilmu

pengetahuan dan eksplorasi tanaman yang dapat meningkatkan sistem

imun tubuh dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.

b. manfaat praktis penelitian ini adalah pemanfaatan daun mimba sebagai

peningkat sistem imun atau dapat dikembangkan menjadi sediaan herbal

suplemen imunostimulan.

3 #!

1 3 #! + +

Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba (

A. Juss.) mempunyai efek imunostimulan.

3 #! %

a. Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat

meningkatkan proliferasi sel limfosit

b. Untuk mengetahui berapa besar peningkatan proliferasi sel dengan

pemberian ekstrak etanolik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

*+,# 1 ' $#!"#! ,('#!*

Pohon mimba dideskripsikan dengan nama pada awal 1830 oleh

De Jussieus (Biswas, 2002). Posisi taksonomik mimba sebagai berikut:

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Class : Dicotyledonae

Ordo : Rutales

Family : Meliaceae (keluarga mahogany)

Genus :

Species : A. Juss (Hutapea, 1993)

Nama daerah : imba, mimba, membha, mempheuh (Anonim, 1989).

Deskripsi tanaman pohon dengan tinggi 10;15 m; Batang tegak, berkayu,

bulat, permukaan kasar, simpodial, coklat; Daun majemuk, berhadapan, lonjong,

melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan

menyirip; Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai silindris;

Buah buni, bulat telur, hijau ; biji bulat, diameter ±1 cm, putih; Akar tunggang,

coklat (Hutapea, 1993).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

%# *#' *+,#

Selama ini, mimba digunakan sebagai pupuk tanah, repelan, insektisida,

lubrikan, sabun, produk hygiene mulut, dan pengobatan tradisional. Bagian yang

paling banyak diteliti dari mimba adalah digunakan dalam agrikultur sebagai

biopestisida. Fraksi kasar dari berbagai bagian tanaman mimba yang terisolasi

telah diketahui mempunyai efek sebagai antiinflamasi, antirematik, antiartitis,

antipiretik, antimalaria, antimikroba, depresi sistem saraf pusat (SSP), antiulcer,

antidiabetes, antitumor, antifertilitas, imunostimulan dan efek kardiovaskuler.

Kandungan mimba dapat dibagi menjadi dua kelas mayor : isoprenoid dan

lainnya. Isoprenoid meliputi diterpenoid dan triterpenoid termasuk protomeliacin,

limonoid, azadirone dan derivatnya, gedunin dan derivatnya, tipe kandungan

vilasinin dan C secomeliacins seperti nimbin, salanin dan azadirachtin.

Kandungan nonisoprenoid meliputi protein (asam amino) dan karbohidrat

(polisakarida), konponen sulfur, polifenolik seperti flavonoid dan glikosidanya,

dihidrocalcone, kumarin dan tannin, komponen alifatik, dan lainnya. Pada kulit

batang mimba mengandung catechin dan NB II Peptidoglycan yang diduga

mempunyai aktivitas imunomodulator (Biswas, 2002). Kandungan senyawa pada

daun mimba antara lain: karbohidrat, β; sitosterol, calsium, fiber, magnesium,

nimbaflavon, nimbolide, phosphorus, protein, quercetin, rutin (Duke, 1996).

Penelitian tanaman mimba sebagai imunomodulator sudah banyak

dilakukan, antara lain: Efek imunomodulator minyak mimba pada mencit

menunjukkan adanya peningkatan proliferasi limfosit (Upadhyay, 1992); Ekstrak

air daun mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

menyebabkan peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody

antiovalbumin pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator dari NIM;76,

suatu fraksi volatile dari biji mimba pada tikus. Pada pemberian NIM;76 dengan

dosis 120 mg/kgBB terdapat peningkatan aktivitas makrofag dan respon

proliferasi limfosit tikus (Sairam, 1997); Ekstrak air dari daun mimba

meningkatkan sistem imun tubuh baik dengan peningkatan humoral (antibodi) dan

sistem imun tergantung sel (Biswas, 2002) ; Preparat daun mimba dapat

meningkatkan aktivasi imun yang menghambat perkembangan

dan B16 dengan induksi proliferasi limfosit pada mencit

galur swiss dan C57BL/6 (Baral, 2004). Preparat daun mimba meningkatkan

respon imun Th 1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara

dengan hasil peningkatan antibodi tergantung sel sitotoksik (ADCC) dan sel T

sitotoksik (CTL) (Mandal, 2007).

* ' + + !

Imunitas adalah suatu keadaan dimana tubuh resisten terhadap penyakit

terutama penyakit infeksi. Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan

dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun sedangkan reaksi yang

dikoordinasi sel;sel dan molekul;molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya

disebut respon imun (Baratawidjaja, 2004). Imunitas bersifat alami (bawaan) dan

didapat (adaptif). Imunitas yang alami adalah imunitas yang tidak diperoleh

melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan

imunitas didapat adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap

suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat diperantarai oleh antibodi atau

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

sel limfoid. Masuknya zat asing dalam tubuh akan menimbulkan berbagai macam

reaksi yang bertujuan untuk mempertahankan keutuhan dirinya (Gan, 1991).

Antigen yang masuk dalam tubuh akan mengaktifkan makrofag atau

monosit. Makrofag akan mempengaruhi sel imunokompeten yaitu sel limfoid dari

sistem retikuloendotelial. Antigen yang telah diaktifkan oleh plasma sel akan

merangsang sel limfoid dalam proses imunologik selanjutnya. Sel limfosit terdiri

dari dua jenis sel, yaitu sel B dan sel T. Pada kontak pertama, di bawah pengaruh

antigen, sel B akan berdiferensiasi dan berproliferasi menjadi sel plasma yang

menghasilkan antibodi, sedangkan sel T ( ! " akan tersensitisasi

menjadi menghasilkan limfokin, reaksi imun seluler. Disamping

itu, diferensiasi dan proliferasi sel B dan sel T menghasilkan sel memori. Pada

kontak ulang, sel memori tersebut akan lebih cepat berproliferasi menjadi sel

plasma dan (gambar 1) Memori imunologik dapat berada dalam

bentuk memori pasif jangka pendek dan memori aktif jangka panjang (Gan,

1991).

#+,#$ 1 !" !#)#! !'*" ! -#! .(! + ! , % !(!*+4 5,

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

0 + !(+(- )#'($

Imunomodulator dapat didefinisikan sebagai substansi biologi atau

sintetis yang mampu menstimulasi, menekan, atau memodulasi komponen;

komponen pada sistem imun. Fungsi utama sistem imun adalah melindungi

individu dalam menghadapi agen infeksi dan potensial patogen. Hal ini

menempatkan sistem imun pada posisi vital yaitu antara kondisi sehat dan sakit

(Juyal, 2003).

Imunomodulator dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu

imunorestorasi, imunosupresan, dan imunostimulan. Imunorestorasi adalah

pengembalian fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai

komponen sistem imun, seperti imunoglobulin (Baratawidjaja, 2004).

Imunostimulan adalah senyawa dari luar yang dapat membantu meningkatkan

resistensi tubuh terhadap antigen yang masuk (Juyal, 2003). Imunosupresi adalah

suatu penekanan sistem imun (Baratawidjaja, 2004).

Senyawa;senyawa yang bersifat sebagai imunomodulator antara lain:

rutin, saponin, polisakarida, artemisin, ginsenosid, inosin, limonen, asam linoleat,

asam oleanolik, asam ursolic. Sedangkan senyawa yang bersifat imunostimulan

antara lain: phosphorus (Duke, 1996).

*+/( *'

Limfosit adalah leukosit mononukleus dan tidak bergranula yang

mempunyai inti berwarna gelap yang mengandung kromatin tebal dan sitoplasma

yang berwarna biru pucat, suatu sel berinti satu berdiameter 7;12 Pm yang

mengandung inti dengan kromatin padat dan lingkaran kecil sitoplasma

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(Anonim,1998). Limfosit mencakup sel T dan sel B, yang mempunyai peran

utama dalam imunitas (Brooks, 1995). Peningkatan dan penurunan konsentrasi sel

ini mempengaruhi kesehatan (imunitas) tubuh untuk mengenali antigen asing dan

penurunan respon imun (Dhote, 2005). Untuk terjadinya respons imun efektif

harus terjadi peristiwa seluler yang rumit yang berurutan. Antigen harus terikat

dan bila perlu diproses oleh sel penyaji antigen yang kemudian berhubungan dan

mengaktifkan sel B dan sel T. Sel T helper harus membantu sel B dan prekursor

sel T sitotoksik tertentu dan diperlukan mekanisme yang mampu melipatgandakan

jumlah sel efektor berpotensi dengan cara proliferasi dan berdiferensiasi, untuk

menghasilkan mediator imunitas humoral dan seluler. Integrasi dari interaksi

seluler yang rumit yang terjadi ! ! , yang merupakan dasar respons imun,

terjadi pada jaringan limfoid perifer atau sekunder, yang arsitekturnya teratur;

yaitu kelenjar getah bening, limpa (Roitt, 1994)..

!'*" !

Antigen yang juga disebut imunogen adalah bahan yang dapat

merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang

sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi

antibodi (Baratawidjaja, 2004). Secara fungsional antigen dibagi menjadi

imunogen dan hapten. Hapten adalah molekul kecil yang dapat merangsang

respon imun apabila diika oleh molekul besar. Kompleks antara hapten dan

molekul besar (disebut karier atau molekul pembawa) dapat berperan sebagai

imunogen (Baratawidjaja, 2004). Tidak semua antigen menimbulkan respon

imunogenik, namun semua imunogen adalah antigen (Janeway, 1994). Bagian

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

daerah hipervariabel antibodi yang berkontak dengan antigen diberi istilah paratop

dan bagian antigen yang berkontak dengan paratop disebut epitop (Roitt, 1994).

Antigen eksogen adalah antigen yang masuk dari luar tubuh, misalnya

dengan inhalasi, ingesti atau injeksi. Oleh endositosis atau fagositosis, antigen ini

kemudian dipresentasikan pada # # (APCs) dan diproses

menjadi fragmen;fragmen. APCs kemudian mempresentasikan fragmen;fragmen

tersebut pada sel T helper (CD4⁺) dengan menggunakan molekul

histocompatibility kelas II pada permukaannya. Beberapa sel T spesifik terhadap

peptida: komplek MHC. Mereka kemudian diaktifkan dan mulai menghasilkan

sitokin. Sitokin adalah substansi yang dapat mengaktifkan limfosit T sitotoksik

(CTL), antibodi dari sel B, makrofag, dan partikel lain (Anonim, 2008c).

1 #& *! .#'*'*

Vaksin hepatitis B adalah vaksin yang dikembangkan untuk mencegah

infeksi virus hepatitis B. Vaksin rekombinan HbsAg (rHBsAg) diproduksi dengan

rekayasa genetik galur ! yang mengandung plasmid atau

gen untuk antigen HbsAg (Baratawidjaja, 2004). Setelah injeksi vaksin sebanyak

3 kali, suatu antibodi terhadap HbsAg akan mengalir di darah. Antibodi ini

dikenal sebagai $%& #. Antibodi dan memori sistem imun kemudian

menyediakan imunitas terhadap infeksi virus hepatitis B (Anonim, 2008d).

.#6#78 ! ^®

Hepavax;Gene^® adalah suatu vaksin rekombinan hepatitis B. Komponen

imunogenik yang terkandung, yaitu rekombinan antigen permukaan hepatitis B

(HbsAg), diproduksi dengan modifikasi yeast menggunakan '

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

% ( 1 ml vaksin mengandung 20 mcg

HbsAg yang diabsorbsikan pada 0,5 mg alumunium hidroksida. Hepavax;Gene^®

adalah salah satu vaksin yang kualitasnya diakui WHO untuk imunisasi aktif

melawan virus Hepatitis B (Anonim, 2008e). Vaksin ini diproduksi oleh Berna

Biotech Korea Corporation.

& '$#& *

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang terlarut

supaya terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia

yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang

tidak dapat larut dalam cairan penyari (Anonim, 2000).

Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter atau campuran

etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dapat dilakukan dengan maserasi,

perkolasi atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian campuran etanol dan

air dilakukan dengan cara maserasi dan perkolasi (Anonim, 1979).

Maserasi adalah salah satu cara penyarian yang sederhana yang

dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam cairan penyari. Cairan penyari

akan menembus dinding rongga sel sehingga masuk dalam sel yang mengandung

zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara

larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat

didesak keluar. Peristiwa tersebut terjadi berulang sehingga terjadi keseimbangan

antara di dalam dan di luar sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia

yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air;etanol, atau pelarut lain

(Anonim, 1986).

Etanol dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit

ditumbuhi kapang dan kuman dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral,

absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,

dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).

Etanol dapat melarutkan alkaloida basa, minyak menguap, glikosida,

kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak,

malam, tanin dan saponin hanya sedikit larut, dengan demikian zat pengganggu

yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).

Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada

uji proliferasi adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT,

garam tetrazolium MTT (3;(4,5;dimetil;tiazol;2;il);2,5;difeniltetrazolium

bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di

mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel

karena tidak dapat menembus membran sel. Dengan penambahan DMSO,

isopropanol, atau pelarut yang tepat, maka produk formazan larut dan dibebaskan

sehingga dapat diukur secara kolorimetri. Kemampuan enzim dehidrogenase

mitokondria untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas

mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel hidup. Pembacaan absorbansi

dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan

(Castell, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur

sampel dalam jumlah banyak (Doyle, 2000).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

$#!"&# +*&*$#!

Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap segala macam

antigen yang masuk dalam tubuh. Peranannya sangat penting untuk mencegah

seseorang terserang penyakit. Karena fungsinya yang sangat penting inilah,

dibutuhkan sistem imun yang kuat. Peningkatan sistem imun dapat dilakukan

dengan cara pemberian suplemen makanan.

Daun mimba merupakan salah satu tanaman obat yang diduga dapat

digunakan sebagai imunostimulan. Daun mimba mempunyai kandungan rutin,

quercetin, polisakarida, phosphorus yang mempunyai aktivitas sebagai

imunomodulator. Berbagai penelitian efek imunomodulator daun mimba telah

dipublikasikan, antara lain penelitian Ekstrak air kulit batang mimba telah terbukti

mempunyai efek sebagai imunomodulator (Biswas, 2002); Ekstrak air daun

mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral menyebabkan

peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody antiovalbumin pada

mencit (Ray, 1996). Pemberian 120 mg/kgBB NIM;76, suatu fraksi menguap dari

minyak mimba menunjukkan peningkatan aktivitas imunostimulan dengan

mengaktifkan mekanisme imun yang diperantarai sel pada tikus (Sairam, 1997).

Penelitian ini adalah penelitian awal penemuan senyawa dari tanaman

yang berefek sebagai imunostimulan dengan cara peningkatan proliferasi sel

limfosit.

*.(' *

Ekstrak etanolik daun mimba ( A. Juss) mempunyai

efek sebagai imunostimulan dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

!* -#! #!9#!"#! ! )*'*#!

Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba ( A.

Juss) terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit pada tikus jantan galur wistar

ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola

satu arah.

#$*#, ) ! )*'*#! -#! /*!* * . $# *(!#)

1. Variabel bebas

Dosis ekstrak etanolik daun mimba yaitu: 35 mg/kg BB tikus, 70 mg/kg BB

tikus, 140 mg/kg BB tikus.

2. Variabel tergantung

Besar kenaikan proliferasi sel limfosit

3. Variabel pengacau terkendali

a. Suhu pembuatan ekstrak etanolik, dikendalikan pada suhu ruangan 25^oC–

30^oC.

b. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar berumur 3

bulan, berat badan 150;250 g

c. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

1640.

d. Inkubasi sel limfosit dikendalikan dengan disimpan di inkubator dengan

aliran 5% CO₂dan suhu 37^oC.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

e. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan

memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

4. Variabel pengacau tak terkendali

Kondisi fisiologis dan patologis hewan uji

5. Definisi operasional

a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang

diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM

berumur 3 bulan.

b. Ekstrak etanolik daun mimba adalah hasil penyarian daun mimba dengan

metode maserasi menggunakan cairan penyari etanol 70%.

c. Imunostimulan ialah senyawa atau yang menyebabkan peningkatan

sistem imun tubuh antara lain dengan peningkatan proliferasi sel imun.

d. Peningkatan proliferasi sel limfosit adalah peningkatan pertumbuhan sel

yang ditandai dengan peningkatan jumlah sel kelompok perlakuan

dibandingkan dengan kontrol.

0 )#' -#! #%#! ! )*'*#! 1 )#'

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat;alat gelas,

timbangan analitik (Sartorius), alumunium foil, alat bedah, alat injeksi (Terumo),

# , tabung # (Nunc), autoklaf, # # ,

inkubator (Memmett), mikropipet, autoklaf, lemari pendingin, , )*$

(Nunc), (Labquib), mikroskop (Olympus), ELISA

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(SLT 340 ATC), (Nebaueur)+ tissue (Nice), sarung

tangan, masker.

#%#!

Bahan;bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

a. Daun mimba segar yang diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman,

Yogyakarta

b. Hewan uji tikus jantan galur wistar berumur 3 bulan dengan berat badan

150;250 g

c. Etanol teknis 70%

d. Antigen: vaksin hepatitis B (Hepavac;gene®)

e. Bahan untuk kulturisasi sel limfosit

1) Media pencuci

Media RPMI : RPMI 1640 (Sigma), NaHCO₃ (Sigma), HEPES

(Sigma), Aquabides steril

2) Buffer lisis eritrosit :

tris buffer ammonium klorida : tris base 0,17 M, NH4Cl 0,16 M

3) Media penumbuh: Medium komplit

a) Medium RPMI (Sigma)

b) Fetal bovine serum (FBS) 10 % (Gibco)

c) penisilin;streptomisin 1% v/v (Gibco)

d) fungison 0,5%

f. Bahan untuk uji proliferasi sel limfosit

MTT : 3;(4,5;dimetil;tiazol;2;il);2,5;dipheniltetrazolium bromide)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Buffer pelarut MTT : Phosphat buffered saline steril

Reagen Stopper: Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dalam HCl 0,01 N

#'# 0#$# ! )*'*#! 1 ' $+*!# * '#!#+#!

Determinasi daum mimba dilakukan di laboratorium Farmakognosi

Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan

dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen

van den Brink, Jr., 1965).

!" +. )#! -# ! +*+,#

Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di

Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei 2008.

2 +, #'#! & '$#& '#!()*& -# ! +*+,#

Sepuluh bagian serbuk daun mimba dimaserasi dengan etanol teknis

sebanyak 70 bagian (Anonim, 1986). Maserasi dilakukan selama 24;48 jam

dengan pengadukan terus;menerus menggunakan shaker. Filtrat yang didapat

kemudian disaring dan kemudian dipekatkan dengan ! !

sampai sebagian besar etanol menguap dan terpisah dari filtrat. Filtrat yang

didapat dikeringkan dengan oven. Ekstrak kering kemudian ditimbang dan

selanjutnya digunakan sebagai senyawa uji.

: $)#& #! & '$#& '#!()*& -# ! +*+,# ' $%#-#. % ;#! 3*

Tiga kelompok hewan uji, masing;masing kelompok hewan uji diberi

perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dengan dosis 35 mg/Kg BB, 70 mg/kg

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BB, 140 mg/kg BB secara peroral setiap hari selama 48 hari. Kelompok keempat

diberi perlakuan aquades sebagai kontrol negatif.

< !- & * #!'*" !

Selama proses pemberian ekstrak mimba, hewan uji divaksinasi dengan

antigen untuk memicu respon imun. Proses vaksinasi dilakukan setelah proses

perlakuan dengan ekstrak etanolik selama 7 hari, masing;masing kelompok uji

diinduksi dengan antigen sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke 7, 21, dan 35.

= )' $* # * ) )*+/( *'

Setelah proses induksi antigen selesai, hewan uji dikorbankan dan

diambil sel limfositnya dari organ limpa. Tikus diletakkan dalam posisi telentang,

kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan selubung peritoneumnya dengan

alkohol 70%. Limpa diangkat dan diletakkan dalam cawan petri diameter 50 mm

yang berisi 5 ml medium RPMI. Limpa dibersihkan dengan pinset steril dari

organ dan jaringan yang mengikat. Limpa dicuci dibawah ,

-(LAF) dengan jalan memindahkan Limpa dari satu cawan petri ke cawan petri

berikutnya yang telah disiapkan (4;5 cawan petri berisi 10 ml medium tanpa

serum pada masing;masing petri).

Pada organ limpa dilakukan penyemprotan medium ke dalam organ

dengan alat suntik 5 ml atau 10 ml dari berbagai posisi sampai organ tampak

transparan dan didapatkan suspensi sel. Suspensi sel dimasukkan dalam tabung

sentrifus 10 ml. sel disentrifus pada 1200 rpm 4^oC selama 10 menit. Pellet yang

didapat disuspensikan dalam 2 ml tris buffer ammonium klorida. Sel dicampur

menggunakan pipet. Suspensi tersebut kemudian disentrifus pada 1200 rpm 4^o C

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pellet dicuci dengan RPMI 2 kali

dengan dara dipipet berulang;ulang dan disentrifus 1200 rpm 4^oC selama 5 menit.

Supernatan dibuang dan sel limfosit disuspensikan dengan medium komplit. Sel

dihitung dengan hemositometer.

> !" & $#! . !*!"&#'#! .$()*/ $# * ) )*+/( *'

Dalam )* dimasukkan 100 Tl suspensi sel dalam media

RPMI yang sudah disterilkan dengan filter 0.22Tl + 100Tl senyawa antigen,

inkubasi 3 x 24 jam, 10Tl media kemudian diambil dari tiap;tiap sumuran lalu

tambahkan 10 Tl larutan 5 mg/ml MTT dalam PBS steril, inkubasi 4 jam.

Tambahkan 100Tl larutan stop (10 % SDS + HCl 0,01N dalam akuades). Inkubasi

dilanjutkan 18;20 jam dan selanjutnya dibaca absorbansinya dengan

menggunakan ELISA padaλ550 nm.

!#)* * # *)

Untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan

pengolahan data secara statistik. Data diuji normalitasnya, apabila distribusi data

normal, uji statistik yang dilakukan adalah uji parametrik dengan ANOVA satu

arah. Apabila distribusi data tidak normal, dilakukan uji non parametrik dengan

Kruskal;Wallis.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

& +# ! )*'*#!

#+,#$ & +# $3# ! )*'*#!

Proses Ekstraksi daun mimba

Kontrol Aquades

Isolasi Limfosit dari Organ Limpa Hewan Uji

Uji Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Persiapan Penelitian

Pengumpulan Daun Mimba

Induksi Antigen Kelompok Perlakuan 35mg/kgBB Kelompok Perlakuan 70mg/kgBB Kelompok Perlakuan 140mg/kgBB

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

!" +. )#! # ! *+,# -#! +, #'#! *+.)* *#

Daun yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari tanaman

A. Juss (Mimba) yang diambil dari Desa Gayamharjo,

Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei tahun 2008. Bahan yang dikumpulkan

berasal dari satu pohon dan dalam sekali pemanenan. Hal ini bertujuan untuk

menghindari adanya perbedaan kualitas kandungan kimia dalam daun yang

diambil. Umur daun yang dipilih tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda sehingga

diperoleh kandungan senyawa aktif yang optimal. Selanjutnya dilakukan

pemisahan daun dari tangkai daun, bagian tumbuhan yang lain, atau dari bahan

asing yang ikut terbawa saat pemanenan daun mimba. Daun dicuci dengan air

mengalir untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel.

Daun yang sudah dibersihkan dikeringkan di bawah sinar matahari

dengan ditutup kain hitam untuk mencegah kerusakan senyawa kemudian setelah

daun cukup kering, daun dikeringkan dengan oven pada suhu 40 – 60^o C selama

24 jam sampai daun mudah dihancurkan. Daun kemudian diblender, diayak

Dalam dokumen Pengaruh ekstrak etanolik daun mimba [Azadirachta indica A.Juss] terhadap proliferasi sel limfosit pada tikus jantan galur wistar - USD Repository (Halaman 21-74)