SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Anna Karina Algustie
NIM : 058114012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Anna Karina Algustie
NIM : 058114012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PERSETUJUAN PEMBIMBING
Yang diajukan oleh :
Anna Karina Algustie
NIM : 058114012
Skripsi ini telah disetujui oleh:
Pembimbing
(Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.)
Tanggal: 5 Desember 2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
Pengesahan Skripsi Berjudul
Oleh :
Anna Karina Algustie NIM : 058114012
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 10 Januari 2009
Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Dekan
(Rita Suhadi, M.Si.,Apt.)
Pembimbing
(Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.)
Panitia Penguji:
1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt. 1………
2. Rm. Drs. P. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J. 2………
3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. 3………
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
Dalam hidup ini meminta sesuatu adalah suatu hal biasa
namun memberi dan mensyukuri segala sesuatu adalah
suatu hal lain yang luar biasa
Legenda Pribadi datang menghampiri semua
orang, namun hanya beberapa saja yang berani
menjawab panggilannya…
Aku ingin bermimpi, kemudian...berlayar!!!
Karya ini kupersembahkan untuk
Tuhan Yesus yang selalu menemani setiap
lamgkah hidupku
Mami, Papi, De’Donny, De’Puput, De’Sasa
Hikoza-ku, I love you
Almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH
UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Anna Karina Algustie
Nomor Mahasiswa : 058114012
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: !"#$ % & '$#&
'#!()*& # ! *+,# ' $%#-#. $()*/ $# * )
*+/( *' .#-# *& #!'#! #) $ * '#$ beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas
Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain,
mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan
mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis
tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya
selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal: 11 Januari 2009
Yang menyatakan,
(Anna Karina Algustie)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala kasih dan
berkat;Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pengaruh
Ekstrak Etanolik Daun Mimba ( A. Juss) terhadap Proliferasi
Sel Limfosit pada Tikus Jantan Galur Wistar”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi
salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi
Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya bimbingan,
bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin
mengucapkan terima kasih kepada:
1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing, yang
selalu memberikan semangat, dukungan, bimbingan, dan saran selama
penyusunan skripsi.
2. Rm. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J., selaku dosen penguji yang telah
berkenan menguji dan banyak memberikan masukan dan pengetahuan
yang berkaitan dengan skripsi ini, terutama dalam analisis statistik.
3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan
menguji dan memberikan masukan dan saran.
4. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam
identifikasi dan determinasi tumbuhan.
5. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dekan fakultas farmasi Universitas Sanata
Dharma.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
6. Mas Heru, Mas Parjiman, Mas Wagiran, Mas Kayat, Mas Yuwono, Mas
Andri, Mas Sigit, Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan bimbingan dan
bantuan.
7. Mbak Yuli, Pak Yudhi, Mbak Istini, dan segenap karyawan LPPT UGM
yang telah banyak membantu dan menemani dalam penelitian skripsi ini.
8. Mami, Papi, dan adik;adikku yang selalu menyemangatiku dan
mendoakanku. Untuk kasih sayang yang luar biasa.
9. Agustinus Titis Iswara atas cinta yang luar biasa dan motivasi untuk tidak
pernah menyerah.
10. Illon, Rias, Yesika, Anni atas kerjasama, diskusi, canda tawa dan keluh
kesah selama penyusunan skripsi ini.
11. Sekar, Nolen, Lina “boy”, Tami, Anni, Imelda, Mitha, teman;teman UKK
“A”, teman;teman FKK ‘05 dan teman;teman kost atas dukungan,
kebersamaan, dan kesediannya untuk berbagi suka dan duka selama ini.
12. Nur’aniyah, Ratna, Cawas, Cicil atas masukan yang sangat berguna dalam
penyelesaian skripsi ini.
13. Teman;teman angkatan 2005 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
atas kebersamaannya.
14. Semua pihak yang telah banyak memberikan dukungan dalam
penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
Penulis menyadari tulisan ini masih banyak kekurangan dan kesalahan.
Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran atas tulisan ini. Penulis
berharap tulisan ini berguna untuk perkembangan ilmu kefarmasian.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
Saya menyatakan bahwa sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak
memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam
kutipan dan daftar pustaka, sebagai layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 6 November 2008
Penulis,
Anna Karina Algustie
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x mg : miligram
ml : mililiter
rpm : rotasi per menit
FBS : Fetal Bovine Serum
MTT : 3;(4,5;dimetil;tiazol;2;il);2,5;dipheniltetrazolium bromide)
reagen : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N
RPMI : Rosswell Park Memorial Institute
SDS : Sodium Dodesil Sulfat
96 : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat
menanam sel pada uji sitotoksisitas
ADCC : Antibody Dependent Cytotoxic Cell
CTL : Cell T Lymphocyte
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap suatu penyakit. Tanaman mimba adalah salah satu tanaman yang diduga dapat meningkatkan sistem imun tubuh. Berbagai penelitian yang telah dilakukan menyatakan bahwa eksrak air daun dan kulit batang mimba berkhasiat meningkatkan sistem imun. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit dan berapa besar persentase peningkatan proliferasi sel limfosit.
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Tikus jantan galur Wistar diberi perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dan diinduksi dengan antigen vaksin Hepatitis B. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit dilakukan dengan menghitung kultur sel limfosit yang diambil dari limpa tikus jantan dengan metode MTT (3; (4,5;dimethylthiazol;2;yl);2,5;diphenyltetrazolium bromide). Data yang diperoleh kemudian diolah secara statistik dengan uji Kruskal Wallis.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun mimba mempunyai aktifitas imunostimulan dengan meningkatkan proliferasi sel limfosit. Peningkatan proliferasi sel limfosit terjadi pada kelompok perlakuan dosis 35 mg/kgBB, 70 mg/kgBB dan 140 mg/kgBB dengan peningkatan proliferasi sel limfosit sebesar 56,83%; 62,30 % dan 59,18% terhadap kontrol negatif.
Kata kunci : proliferasi sel limfosit, tikus jantan, ekstrak etanolik, daun mimba
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
0
Immune system protects the body from many diseases. Neem is plant which is expected to increase immune system. Various researches had been done previously show that water extract of neem’s bark increased immune system. The purposes of this research are to know the effect of ethanolic extract of neem’s leaf on lymphocyte proliferation and to determine the percentage of the increasing of lymphocyte proliferation.
This research is a pure experimental research with the complete random design one way pattern. Wistar male rats were given ethanolic extract of neem’s leaf and induced by hepatitis B vaccine. Lymphocyte proliferation was measured by using MTT method (3;(4, 5;dimethylthiazol;2;yl);2,5;diphenyltetrazolium bromide). The result was analysed statistically by using Kruskal;Wallis test.
The result indicates that ethanolic extract of neem’s leaf shows immunostimulant activity to lymphocyte proliferation. Immunostimulant effect is achieved at the dose of 35;70;140 mg/kgBB with the percentage of proliferation increase are 56,83%; 62,30% and 59,18%, respectively.
Key words: lymphocyte proliferation, male rat, ethanolic extract, neem’s leaf
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
Halaman
HALAMAN JUDUL ... .. ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii
HALAMAN PENGESAHAN ... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ... v
PRAKATA... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... ix
ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING ... x
INTISARI ... xi
... xii
DAFTAR ISI... xiii
DAFTAR TABEL... xvi
DAFTAR GAMBAR ... xvii
DAFTAR LAMPIRAN... xviii
BAB I PENGANTAR... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Rumusan masalah ... 2
2. Keaslian penelitian... 3
3. Manfaat penelitian ... 3
B. Tujuan ... 4
1. Tujuan umum…… ... 4
2. Tujuan khusus………. 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 5
A. A. Juss ... 5
B. Sistem Imun... 7
C. Imunomodulator………... 9
D. Limfosit………... 9
E. Antigen... 10
1. Vaksin Hepatitis... 11
2. Hepavax;Gene®... 11
F. Ekstraksi... 12
G. MTT ... 13
H. Kerangka Pemikiran... 14
I. Hipotesis ... 14
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 15
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 15
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional... 15
1. Variabel bebas... 15
2. Variabel tergantung... 15
3. Variabel pengacau terkendali... 15
4. Variabel pengacau tak terkendali... 16
5. Definisi operasional ... 16
C. Alat dan Bahan ... 16
1. Alat ... 16
2. Bahan ... 17
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
D. Tata Cara Penelitian ... 18
1. Determinasi tanaman... 18
2. Pengumpulan daun mimba... 18
3. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba ... 18
4. Perlakuan ekstrak etanolik daun mimba terhadap hewan uji... 18
5. Induksi antigen... 19
6. Kulturisasi sel limfosit ... 19
7. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit... 20
E. Analisis Hasil... 20
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22
A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia... 22
B. Hasil Ekstraksi ... 23
C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji ... 24
D. Hasil Isolasi Sel Limfosit... 27
E. Hasil Uji Peningkatan Proliferasi Sel Limfosit... ... 28
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 33
A. Kesimpulan ... 33
B. Saran ... 33
DAFTAR PUSTAKA ... 35
LAMPIRAN... 38
BIOGRAFI PENULIS ... 55
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
Halaman Tabel I. Data Rata;rata Absorbansi Sel Limfosit dan Standar
Deviasi Setelah Inkubasi selama 72 jam... 29
Tabel II. Persen Besar Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit
Kelompok Perlakuan Dibandingkan Kelompok Kontrol... 31
Tabel III. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata;rata Mingguan
Selama Masa Perlakuan ... 41
Tabel IV. Hasil Uji Proliferasi Kultur Sel Limfosit dengan
Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba... 42
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
Halaman
Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh... 8
Gambar 2. Skema Kerja Penelitian... 21
Gambar 3. Profil Rata;rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama Masa Perlakuan ... 25
Gambar 4. Foto Histologi Hepar... 27
Gambar 5. Kultur Sel Limfosit Hidup ... 28
Gambar 6. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan ... 29
Gambar 7. Grafik Rata;rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan Perlakuan... 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
Halaman
Lampiran 1. Perhitungan Dosis ... 39
Lampiran 2. Rata;rata Berat Badan Tikus per Minggu ... 41
Lampiran 3. Data Absorbansi Sel Limfosit ... 42
Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif………....……. 42
Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Shapiro Wilk dan Uji Homogenitas Data... 45
Lampiran 6. Uji Hipotesis Hasil Penelitian dengan Uji Kruskal Wallis ... 46
Lampiran 7. Uji Kruskal Wallis Kelompok Perlakuan Daun Mimba ... 46
Lampiran 8. Perhitungan Persentase Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit…. 47 Lampiran 9. Tanaman Mimba ( A.Juss)……… 48
Lampiran 10. Daun Mimba ( A.Juss) ………... 49
Lampiran 11. Serbuk Daun Mimba……….….……… 50
Lampiran 12. Ekstrak Etanolik Daun Mimba... 50
Lampiran 13. 96; ... 51
Lampiran 14. ELISA SLT 340 ATC ... 51
Lampiran 15. Surat Pengesahan Determinasi... 52
Lampiran 16. Hasil Histologi Hepar ... 53
Lampiran 17. Surat Keterangan Penelitian ... 54
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
#'#$ )#&#!"
Dewasa ini banyak penyakit baru yang berkembang dan tingkat kematian
karena berbagai penyakit tersebut terus meningkat. Hal ini dapat dicegah apabila
tubuh mempunyai imunitas yang baik. Imunitas merupakan resistensi
(pertahanan) tubuh terhadap zat asing (misalnya penyebab infeksi). Imunitas ini
bersifat alami (bawaan) atau diperoleh (adaptif). Imunitas alami adalah imunitas
yang tidak diperoleh melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non
spesifik, sedangkan imunitas adaptif adalah imunitas yang diperoleh setelah
pemaparan terhadap suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat
diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid. Oleh karena pentingnya imunitas
tubuh, menurut pusat penelitian imun ( ) maka perlu
adanya pemeliharaan sistem imun untuk mengurangi resiko melemahnya sistem
imun tubuh, antara lain dengan: mengurangi stress, banyak berolahraga, asupan
gizi yang cukup (buah, sayur, produk rendah lemak, suplemen makanan), dan
istirahat yang cukup (Anonim, 2008a). Sistem imun tubuh yang baik akan
meningkatkan respon imun terhadap antigen atau agen penyebab infeksi sehingga
mencegah terjadinya gejala penyakit atau dapat juga mempercepat penyembuhan
penyakit, dan dengan imunitas tubuh yang baik, secara umum diharapkan adanya
peningkatan kesehatan masyarakat.
Salah satu cara peningkatan sistem imun tubuh dengan suplemen
makanan. Senyawa;senyawa yang diketahui dapat meningkatkan sistem imun
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
disebut sebagai imunostimulan. Kebutuhan imunostimulan di masyarakat
mulai meningkat dan untuk memenuhi kebutuhan tersebut telah dikembangkan
beberapa produk herbal. Adanya peningkatan kebutuhan ini mendorong pencarian
tanaman obat yang mempunyai efek imunostimulan. Salah satu tanaman yang
telah dikenal mempunyai banyak manfaat kesehatan adalah tanaman mimba
( A. Juss). Hampir semua bagian dari tanaman ini mempunyai
manfaat bagi keseimbangan kehidupan, antara lain: pengusir serangga,
antidiabetes, antimikroba, antifertilitas, antikanker dan diduga dapat pula
meningkatkan sistem imun tubuh (Biswas, 2002). Sebelumnya telah diketahui
bahwa kulit batang tanaman mimba mempunyai efek sebagai imunostimulan
(Biswas, 2002). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba
dapat meningkatkan antibodi (Ray, 1996).
Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak
etanolik daun mimba dalam peningkatan proliferasi sel limfosit yang berperan
sebagai sel imunitas tubuh. Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan uji
dan in vitro dengan pengkulturan sel limfosit kemudian diukur perbedaan
proliferasi sel limfosit dengan metode MTT.
Dari penelitian ini diharapkan adanya pengembangan sediaan herbal
yang mampu meningkatkan sistem imun sehingga imunitas tubuh meningkat dan
tubuh dalam kondisi siap dalam menghadapi penyakit.
1 + #! +# #)#%
a. Apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel
limfosit tikus jantan galur wistar?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
b. Berapa besar peningkatan proliferasi sel limfosit hewan uji dengan
pemberian ekstrak etanolik daun mimba?
# )*#! ! )*'*#!
Sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian
tentang pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dalam meningkatkan proliferasi
sel limfosit tikus jantan galur wistar. Penelitian yang pernah dilakukan terkait
dengan efek imunostimulan tanaman mimba antara lain: Efek Imunomodulator
dari Minyak Mimba ( A.Juss) (Upadhyay, 1992); Modulasi
respon imun humoral dan seluler oleh (Mimba) pada mencit
(Ray, 1996); Efek Imunomodulator NIM;76, suatu Fraksi Menguap dari Minyak
Mimba (Sairam, 1997); Daun mimba Meningkatkan Aktivasi Imun yang
Menghambat Perkembangan dan B16
(Baral, 2004); Preparat mimba meningkatkan respon imun tipe Th1 dan imunitas
anti tumor melawan antigen tumor payudara (Mandal, 2007).
2 #!/##' ! )*'*#!
Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap proliferasi sel
limfosit ini diharapkan bermanfaat antara lain:
a. manfaat teoritis penelitian ini adalah menambah khasanah ilmu
pengetahuan dan eksplorasi tanaman yang dapat meningkatkan sistem
imun tubuh dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.
b. manfaat praktis penelitian ini adalah pemanfaatan daun mimba sebagai
peningkat sistem imun atau dapat dikembangkan menjadi sediaan herbal
suplemen imunostimulan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
3 #!
1 3 #! + +
Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba (
A. Juss.) mempunyai efek imunostimulan.
3 #! %
a. Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat
meningkatkan proliferasi sel limfosit
b. Untuk mengetahui berapa besar peningkatan proliferasi sel dengan
pemberian ekstrak etanolik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
5
*+,# 1 ' $#!"#! ,('#!*
Pohon mimba dideskripsikan dengan nama pada awal 1830 oleh
De Jussieus (Biswas, 2002). Posisi taksonomik mimba sebagai berikut:
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Class : Dicotyledonae
Ordo : Rutales
Family : Meliaceae (keluarga mahogany)
Genus :
Species : A. Juss (Hutapea, 1993)
Nama daerah : imba, mimba, membha, mempheuh (Anonim, 1989).
Deskripsi tanaman pohon dengan tinggi 10;15 m; Batang tegak, berkayu,
bulat, permukaan kasar, simpodial, coklat; Daun majemuk, berhadapan, lonjong,
melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan
menyirip; Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai silindris;
Buah buni, bulat telur, hijau ; biji bulat, diameter ±1 cm, putih; Akar tunggang,
coklat (Hutapea, 1993).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
%# *#' *+,#
Selama ini, mimba digunakan sebagai pupuk tanah, repelan, insektisida,
lubrikan, sabun, produk hygiene mulut, dan pengobatan tradisional. Bagian yang
paling banyak diteliti dari mimba adalah digunakan dalam agrikultur sebagai
biopestisida. Fraksi kasar dari berbagai bagian tanaman mimba yang terisolasi
telah diketahui mempunyai efek sebagai antiinflamasi, antirematik, antiartitis,
antipiretik, antimalaria, antimikroba, depresi sistem saraf pusat (SSP), antiulcer,
antidiabetes, antitumor, antifertilitas, imunostimulan dan efek kardiovaskuler.
Kandungan mimba dapat dibagi menjadi dua kelas mayor : isoprenoid dan
lainnya. Isoprenoid meliputi diterpenoid dan triterpenoid termasuk protomeliacin,
limonoid, azadirone dan derivatnya, gedunin dan derivatnya, tipe kandungan
vilasinin dan C secomeliacins seperti nimbin, salanin dan azadirachtin.
Kandungan nonisoprenoid meliputi protein (asam amino) dan karbohidrat
(polisakarida), konponen sulfur, polifenolik seperti flavonoid dan glikosidanya,
dihidrocalcone, kumarin dan tannin, komponen alifatik, dan lainnya. Pada kulit
batang mimba mengandung catechin dan NB II Peptidoglycan yang diduga
mempunyai aktivitas imunomodulator (Biswas, 2002). Kandungan senyawa pada
daun mimba antara lain: karbohidrat, β; sitosterol, calsium, fiber, magnesium,
nimbaflavon, nimbolide, phosphorus, protein, quercetin, rutin (Duke, 1996).
Penelitian tanaman mimba sebagai imunomodulator sudah banyak
dilakukan, antara lain: Efek imunomodulator minyak mimba pada mencit
menunjukkan adanya peningkatan proliferasi limfosit (Upadhyay, 1992); Ekstrak
air daun mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
menyebabkan peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody
antiovalbumin pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator dari NIM;76,
suatu fraksi volatile dari biji mimba pada tikus. Pada pemberian NIM;76 dengan
dosis 120 mg/kgBB terdapat peningkatan aktivitas makrofag dan respon
proliferasi limfosit tikus (Sairam, 1997); Ekstrak air dari daun mimba
meningkatkan sistem imun tubuh baik dengan peningkatan humoral (antibodi) dan
sistem imun tergantung sel (Biswas, 2002) ; Preparat daun mimba dapat
meningkatkan aktivasi imun yang menghambat perkembangan
dan B16 dengan induksi proliferasi limfosit pada mencit
galur swiss dan C57BL/6 (Baral, 2004). Preparat daun mimba meningkatkan
respon imun Th 1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara
dengan hasil peningkatan antibodi tergantung sel sitotoksik (ADCC) dan sel T
sitotoksik (CTL) (Mandal, 2007).
* ' + + !
Imunitas adalah suatu keadaan dimana tubuh resisten terhadap penyakit
terutama penyakit infeksi. Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan
dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun sedangkan reaksi yang
dikoordinasi sel;sel dan molekul;molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya
disebut respon imun (Baratawidjaja, 2004). Imunitas bersifat alami (bawaan) dan
didapat (adaptif). Imunitas yang alami adalah imunitas yang tidak diperoleh
melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan
imunitas didapat adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap
suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat diperantarai oleh antibodi atau
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
sel limfoid. Masuknya zat asing dalam tubuh akan menimbulkan berbagai macam
reaksi yang bertujuan untuk mempertahankan keutuhan dirinya (Gan, 1991).
Antigen yang masuk dalam tubuh akan mengaktifkan makrofag atau
monosit. Makrofag akan mempengaruhi sel imunokompeten yaitu sel limfoid dari
sistem retikuloendotelial. Antigen yang telah diaktifkan oleh plasma sel akan
merangsang sel limfoid dalam proses imunologik selanjutnya. Sel limfosit terdiri
dari dua jenis sel, yaitu sel B dan sel T. Pada kontak pertama, di bawah pengaruh
antigen, sel B akan berdiferensiasi dan berproliferasi menjadi sel plasma yang
menghasilkan antibodi, sedangkan sel T ( ! " akan tersensitisasi
menjadi menghasilkan limfokin, reaksi imun seluler. Disamping
itu, diferensiasi dan proliferasi sel B dan sel T menghasilkan sel memori. Pada
kontak ulang, sel memori tersebut akan lebih cepat berproliferasi menjadi sel
plasma dan (gambar 1) Memori imunologik dapat berada dalam
bentuk memori pasif jangka pendek dan memori aktif jangka panjang (Gan,
1991).
#+,#$ 1 !" !#)#! !'*" ! -#! .(! + ! , % !(!*+4 5,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
0 + !(+(- )#'($
Imunomodulator dapat didefinisikan sebagai substansi biologi atau
sintetis yang mampu menstimulasi, menekan, atau memodulasi komponen;
komponen pada sistem imun. Fungsi utama sistem imun adalah melindungi
individu dalam menghadapi agen infeksi dan potensial patogen. Hal ini
menempatkan sistem imun pada posisi vital yaitu antara kondisi sehat dan sakit
(Juyal, 2003).
Imunomodulator dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu
imunorestorasi, imunosupresan, dan imunostimulan. Imunorestorasi adalah
pengembalian fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai
komponen sistem imun, seperti imunoglobulin (Baratawidjaja, 2004).
Imunostimulan adalah senyawa dari luar yang dapat membantu meningkatkan
resistensi tubuh terhadap antigen yang masuk (Juyal, 2003). Imunosupresi adalah
suatu penekanan sistem imun (Baratawidjaja, 2004).
Senyawa;senyawa yang bersifat sebagai imunomodulator antara lain:
rutin, saponin, polisakarida, artemisin, ginsenosid, inosin, limonen, asam linoleat,
asam oleanolik, asam ursolic. Sedangkan senyawa yang bersifat imunostimulan
antara lain: phosphorus (Duke, 1996).
*+/( *'
Limfosit adalah leukosit mononukleus dan tidak bergranula yang
mempunyai inti berwarna gelap yang mengandung kromatin tebal dan sitoplasma
yang berwarna biru pucat, suatu sel berinti satu berdiameter 7;12 Pm yang
mengandung inti dengan kromatin padat dan lingkaran kecil sitoplasma
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
(Anonim,1998). Limfosit mencakup sel T dan sel B, yang mempunyai peran
utama dalam imunitas (Brooks, 1995). Peningkatan dan penurunan konsentrasi sel
ini mempengaruhi kesehatan (imunitas) tubuh untuk mengenali antigen asing dan
penurunan respon imun (Dhote, 2005). Untuk terjadinya respons imun efektif
harus terjadi peristiwa seluler yang rumit yang berurutan. Antigen harus terikat
dan bila perlu diproses oleh sel penyaji antigen yang kemudian berhubungan dan
mengaktifkan sel B dan sel T. Sel T helper harus membantu sel B dan prekursor
sel T sitotoksik tertentu dan diperlukan mekanisme yang mampu melipatgandakan
jumlah sel efektor berpotensi dengan cara proliferasi dan berdiferensiasi, untuk
menghasilkan mediator imunitas humoral dan seluler. Integrasi dari interaksi
seluler yang rumit yang terjadi ! ! , yang merupakan dasar respons imun,
terjadi pada jaringan limfoid perifer atau sekunder, yang arsitekturnya teratur;
yaitu kelenjar getah bening, limpa (Roitt, 1994)..
!'*" !
Antigen yang juga disebut imunogen adalah bahan yang dapat
merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang
sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi
antibodi (Baratawidjaja, 2004). Secara fungsional antigen dibagi menjadi
imunogen dan hapten. Hapten adalah molekul kecil yang dapat merangsang
respon imun apabila diika oleh molekul besar. Kompleks antara hapten dan
molekul besar (disebut karier atau molekul pembawa) dapat berperan sebagai
imunogen (Baratawidjaja, 2004). Tidak semua antigen menimbulkan respon
imunogenik, namun semua imunogen adalah antigen (Janeway, 1994). Bagian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
daerah hipervariabel antibodi yang berkontak dengan antigen diberi istilah paratop
dan bagian antigen yang berkontak dengan paratop disebut epitop (Roitt, 1994).
Antigen eksogen adalah antigen yang masuk dari luar tubuh, misalnya
dengan inhalasi, ingesti atau injeksi. Oleh endositosis atau fagositosis, antigen ini
kemudian dipresentasikan pada # # (APCs) dan diproses
menjadi fragmen;fragmen. APCs kemudian mempresentasikan fragmen;fragmen
tersebut pada sel T helper (CD4+) dengan menggunakan molekul
histocompatibility kelas II pada permukaannya. Beberapa sel T spesifik terhadap
peptida: komplek MHC. Mereka kemudian diaktifkan dan mulai menghasilkan
sitokin. Sitokin adalah substansi yang dapat mengaktifkan limfosit T sitotoksik
(CTL), antibodi dari sel B, makrofag, dan partikel lain (Anonim, 2008c).
1 #& *! .#'*'*
Vaksin hepatitis B adalah vaksin yang dikembangkan untuk mencegah
infeksi virus hepatitis B. Vaksin rekombinan HbsAg (rHBsAg) diproduksi dengan
rekayasa genetik galur ! yang mengandung plasmid atau
gen untuk antigen HbsAg (Baratawidjaja, 2004). Setelah injeksi vaksin sebanyak
3 kali, suatu antibodi terhadap HbsAg akan mengalir di darah. Antibodi ini
dikenal sebagai $%& #. Antibodi dan memori sistem imun kemudian
menyediakan imunitas terhadap infeksi virus hepatitis B (Anonim, 2008d).
.#6#78 ! ®
Hepavax;Gene® adalah suatu vaksin rekombinan hepatitis B. Komponen
imunogenik yang terkandung, yaitu rekombinan antigen permukaan hepatitis B
(HbsAg), diproduksi dengan modifikasi yeast menggunakan '
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
% ( 1 ml vaksin mengandung 20 mcg
HbsAg yang diabsorbsikan pada 0,5 mg alumunium hidroksida. Hepavax;Gene®
adalah salah satu vaksin yang kualitasnya diakui WHO untuk imunisasi aktif
melawan virus Hepatitis B (Anonim, 2008e). Vaksin ini diproduksi oleh Berna
Biotech Korea Corporation.
& '$#& *
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang terlarut
supaya terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia
yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang
tidak dapat larut dalam cairan penyari (Anonim, 2000).
Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter atau campuran
etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dapat dilakukan dengan maserasi,
perkolasi atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian campuran etanol dan
air dilakukan dengan cara maserasi dan perkolasi (Anonim, 1979).
Maserasi adalah salah satu cara penyarian yang sederhana yang
dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam cairan penyari. Cairan penyari
akan menembus dinding rongga sel sehingga masuk dalam sel yang mengandung
zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara
larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat
didesak keluar. Peristiwa tersebut terjadi berulang sehingga terjadi keseimbangan
antara di dalam dan di luar sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia
yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air;etanol, atau pelarut lain
(Anonim, 1986).
Etanol dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit
ditumbuhi kapang dan kuman dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral,
absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,
dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).
Etanol dapat melarutkan alkaloida basa, minyak menguap, glikosida,
kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak,
malam, tanin dan saponin hanya sedikit larut, dengan demikian zat pengganggu
yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).
Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada
uji proliferasi adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT,
garam tetrazolium MTT (3;(4,5;dimetil;tiazol;2;il);2,5;difeniltetrazolium
bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di
mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel
karena tidak dapat menembus membran sel. Dengan penambahan DMSO,
isopropanol, atau pelarut yang tepat, maka produk formazan larut dan dibebaskan
sehingga dapat diukur secara kolorimetri. Kemampuan enzim dehidrogenase
mitokondria untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas
mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel hidup. Pembacaan absorbansi
dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan
(Castell, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur
sampel dalam jumlah banyak (Doyle, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
$#!"&# +*&*$#!
Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap segala macam
antigen yang masuk dalam tubuh. Peranannya sangat penting untuk mencegah
seseorang terserang penyakit. Karena fungsinya yang sangat penting inilah,
dibutuhkan sistem imun yang kuat. Peningkatan sistem imun dapat dilakukan
dengan cara pemberian suplemen makanan.
Daun mimba merupakan salah satu tanaman obat yang diduga dapat
digunakan sebagai imunostimulan. Daun mimba mempunyai kandungan rutin,
quercetin, polisakarida, phosphorus yang mempunyai aktivitas sebagai
imunomodulator. Berbagai penelitian efek imunomodulator daun mimba telah
dipublikasikan, antara lain penelitian Ekstrak air kulit batang mimba telah terbukti
mempunyai efek sebagai imunomodulator (Biswas, 2002); Ekstrak air daun
mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral menyebabkan
peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody antiovalbumin pada
mencit (Ray, 1996). Pemberian 120 mg/kgBB NIM;76, suatu fraksi menguap dari
minyak mimba menunjukkan peningkatan aktivitas imunostimulan dengan
mengaktifkan mekanisme imun yang diperantarai sel pada tikus (Sairam, 1997).
Penelitian ini adalah penelitian awal penemuan senyawa dari tanaman
yang berefek sebagai imunostimulan dengan cara peningkatan proliferasi sel
limfosit.
*.(' *
Ekstrak etanolik daun mimba ( A. Juss) mempunyai
efek sebagai imunostimulan dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
!* -#! #!9#!"#! ! )*'*#!
Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba ( A.
Juss) terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit pada tikus jantan galur wistar
ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola
satu arah.
#$*#, ) ! )*'*#! -#! /*!* * . $# *(!#)
1. Variabel bebas
Dosis ekstrak etanolik daun mimba yaitu: 35 mg/kg BB tikus, 70 mg/kg BB
tikus, 140 mg/kg BB tikus.
2. Variabel tergantung
Besar kenaikan proliferasi sel limfosit
3. Variabel pengacau terkendali
a. Suhu pembuatan ekstrak etanolik, dikendalikan pada suhu ruangan 25oC–
30oC.
b. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar berumur 3
bulan, berat badan 150;250 g
c. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI
1640.
d. Inkubasi sel limfosit dikendalikan dengan disimpan di inkubator dengan
aliran 5% CO2dan suhu 37oC.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
e. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan
memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.
4. Variabel pengacau tak terkendali
Kondisi fisiologis dan patologis hewan uji
5. Definisi operasional
a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang
diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM
berumur 3 bulan.
b. Ekstrak etanolik daun mimba adalah hasil penyarian daun mimba dengan
metode maserasi menggunakan cairan penyari etanol 70%.
c. Imunostimulan ialah senyawa atau yang menyebabkan peningkatan
sistem imun tubuh antara lain dengan peningkatan proliferasi sel imun.
d. Peningkatan proliferasi sel limfosit adalah peningkatan pertumbuhan sel
yang ditandai dengan peningkatan jumlah sel kelompok perlakuan
dibandingkan dengan kontrol.
0 )#' -#! #%#! ! )*'*#! 1 )#'
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat;alat gelas,
timbangan analitik (Sartorius), alumunium foil, alat bedah, alat injeksi (Terumo),
# , tabung # (Nunc), autoklaf, # # ,
inkubator (Memmett), mikropipet, autoklaf, lemari pendingin, , )*$
(Nunc), (Labquib), mikroskop (Olympus), ELISA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
(SLT 340 ATC), (Nebaueur)+ tissue (Nice), sarung
tangan, masker.
#%#!
Bahan;bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :
a. Daun mimba segar yang diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman,
Yogyakarta
b. Hewan uji tikus jantan galur wistar berumur 3 bulan dengan berat badan
150;250 g
c. Etanol teknis 70%
d. Antigen: vaksin hepatitis B (Hepavac;gene®)
e. Bahan untuk kulturisasi sel limfosit
1) Media pencuci
Media RPMI : RPMI 1640 (Sigma), NaHCO3 (Sigma), HEPES
(Sigma), Aquabides steril
2) Buffer lisis eritrosit :
tris buffer ammonium klorida : tris base 0,17 M, NH4Cl 0,16 M
3) Media penumbuh: Medium komplit
a) Medium RPMI (Sigma)
b) Fetal bovine serum (FBS) 10 % (Gibco)
c) penisilin;streptomisin 1% v/v (Gibco)
d) fungison 0,5%
f. Bahan untuk uji proliferasi sel limfosit
MTT : 3;(4,5;dimetil;tiazol;2;il);2,5;dipheniltetrazolium bromide)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Buffer pelarut MTT : Phosphat buffered saline steril
Reagen Stopper: Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dalam HCl 0,01 N
#'# 0#$# ! )*'*#! 1 ' $+*!# * '#!#+#!
Determinasi daum mimba dilakukan di laboratorium Farmakognosi
Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan
dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen
van den Brink, Jr., 1965).
!" +. )#! -# ! +*+,#
Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di
Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei 2008.
2 +, #'#! & '$#& '#!()*& -# ! +*+,#
Sepuluh bagian serbuk daun mimba dimaserasi dengan etanol teknis
sebanyak 70 bagian (Anonim, 1986). Maserasi dilakukan selama 24;48 jam
dengan pengadukan terus;menerus menggunakan shaker. Filtrat yang didapat
kemudian disaring dan kemudian dipekatkan dengan ! !
sampai sebagian besar etanol menguap dan terpisah dari filtrat. Filtrat yang
didapat dikeringkan dengan oven. Ekstrak kering kemudian ditimbang dan
selanjutnya digunakan sebagai senyawa uji.
: $)#& #! & '$#& '#!()*& -# ! +*+,# ' $%#-#. % ;#! 3*
Tiga kelompok hewan uji, masing;masing kelompok hewan uji diberi
perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dengan dosis 35 mg/Kg BB, 70 mg/kg
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
BB, 140 mg/kg BB secara peroral setiap hari selama 48 hari. Kelompok keempat
diberi perlakuan aquades sebagai kontrol negatif.
< !- & * #!'*" !
Selama proses pemberian ekstrak mimba, hewan uji divaksinasi dengan
antigen untuk memicu respon imun. Proses vaksinasi dilakukan setelah proses
perlakuan dengan ekstrak etanolik selama 7 hari, masing;masing kelompok uji
diinduksi dengan antigen sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke 7, 21, dan 35.
= )' $* # * ) )*+/( *'
Setelah proses induksi antigen selesai, hewan uji dikorbankan dan
diambil sel limfositnya dari organ limpa. Tikus diletakkan dalam posisi telentang,
kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan selubung peritoneumnya dengan
alkohol 70%. Limpa diangkat dan diletakkan dalam cawan petri diameter 50 mm
yang berisi 5 ml medium RPMI. Limpa dibersihkan dengan pinset steril dari
organ dan jaringan yang mengikat. Limpa dicuci dibawah ,
-(LAF) dengan jalan memindahkan Limpa dari satu cawan petri ke cawan petri
berikutnya yang telah disiapkan (4;5 cawan petri berisi 10 ml medium tanpa
serum pada masing;masing petri).
Pada organ limpa dilakukan penyemprotan medium ke dalam organ
dengan alat suntik 5 ml atau 10 ml dari berbagai posisi sampai organ tampak
transparan dan didapatkan suspensi sel. Suspensi sel dimasukkan dalam tabung
sentrifus 10 ml. sel disentrifus pada 1200 rpm 4oC selama 10 menit. Pellet yang
didapat disuspensikan dalam 2 ml tris buffer ammonium klorida. Sel dicampur
menggunakan pipet. Suspensi tersebut kemudian disentrifus pada 1200 rpm 4o C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pellet dicuci dengan RPMI 2 kali
dengan dara dipipet berulang;ulang dan disentrifus 1200 rpm 4oC selama 5 menit.
Supernatan dibuang dan sel limfosit disuspensikan dengan medium komplit. Sel
dihitung dengan hemositometer.
> !" & $#! . !*!"&#'#! .$()*/ $# * ) )*+/( *'
Dalam )* dimasukkan 100 Tl suspensi sel dalam media
RPMI yang sudah disterilkan dengan filter 0.22Tl + 100Tl senyawa antigen,
inkubasi 3 x 24 jam, 10Tl media kemudian diambil dari tiap;tiap sumuran lalu
tambahkan 10 Tl larutan 5 mg/ml MTT dalam PBS steril, inkubasi 4 jam.
Tambahkan 100Tl larutan stop (10 % SDS + HCl 0,01N dalam akuades). Inkubasi
dilanjutkan 18;20 jam dan selanjutnya dibaca absorbansinya dengan
menggunakan ELISA padaλ550 nm.
!#)* * # *)
Untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan
pengolahan data secara statistik. Data diuji normalitasnya, apabila distribusi data
normal, uji statistik yang dilakukan adalah uji parametrik dengan ANOVA satu
arah. Apabila distribusi data tidak normal, dilakukan uji non parametrik dengan
Kruskal;Wallis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
& +# ! )*'*#!
#+,#$ & +# $3# ! )*'*#!
Proses Ekstraksi daun mimba
Kontrol Aquades
Isolasi Limfosit dari Organ Limpa Hewan Uji
Uji Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Persiapan Penelitian
Pengumpulan Daun Mimba
Induksi Antigen Kelompok
Perlakuan 35mg/kgBB
Kelompok Perlakuan 70mg/kgBB
Kelompok Perlakuan 140mg/kgBB
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
!" +. )#! # ! *+,# -#! +, #'#! *+.)* *#
Daun yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari tanaman
A. Juss (Mimba) yang diambil dari Desa Gayamharjo,
Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei tahun 2008. Bahan yang dikumpulkan
berasal dari satu pohon dan dalam sekali pemanenan. Hal ini bertujuan untuk
menghindari adanya perbedaan kualitas kandungan kimia dalam daun yang
diambil. Umur daun yang dipilih tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda sehingga
diperoleh kandungan senyawa aktif yang optimal. Selanjutnya dilakukan
pemisahan daun dari tangkai daun, bagian tumbuhan yang lain, atau dari bahan
asing yang ikut terbawa saat pemanenan daun mimba. Daun dicuci dengan air
mengalir untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel.
Daun yang sudah dibersihkan dikeringkan di bawah sinar matahari
dengan ditutup kain hitam untuk mencegah kerusakan senyawa kemudian setelah
daun cukup kering, daun dikeringkan dengan oven pada suhu 40 – 60o C selama
24 jam sampai daun mudah dihancurkan. Daun kemudian diblender, diayak
dengan ayakan yang mempunyai 154 lubang per 1 cm2 dan disimpan sebagai
serbuk simplisia kering.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
# *) & '$#& *
Serbuk simplisia kering diekstraksi dengan pelarut etanol teknis 70%
dengan metode maserasi untuk mendapatkan ekstrak etanolik daun mimba yang
akan digunakan sebagai ekstrak uji. Penyari akan menembus dinding sel dan
melarutkan zat aktif yang sesuai dengan kepolaran penyari. Karena adanya
perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif dalam sel yang lebih tinggi, maka
zat aktif dalam sel tersebut akan terdesak keluar sampai terjadi kesetimbangan
konsentrasi. Etanol dipilih sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit
ditumbuhi kapang dan khamir dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral,
absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,
dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).
Selain itu etanol juga melarutkan flavonoid, rutin, phosphorus yang merupakan
senyawa;senyawa yang mempunyai efek sebagai imunomodulator. Metode
penyarian yang dipilih adalah metode maserasi dengan pengadukan terus;menerus
karena metode ini sederhana, mudah untuk dilakukan, tidak memerlukan panas
tinggi dan dapat menyari secara efektif.
Penyarian dilakukan dengan perbandingan 10 bagian serbuk disari dalam
70 bagian cairan penyari (Anonim, 1986). Pengadukan secara terus;menerus
dilakukan dengan shaker dan lama penyarian antara 24; 48 jam. Ekstrak yang
didapat disaring dan diambil filtratnya kemudian dipekatkan dengan !
! sampai menjadi ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan
oven pada suhu 40o – 60o C sampai didapat ekstrak kering. Pada pembuatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
ekstrak etanolik digunakan 1100 g serbuk dan kemudian didapat 72,36 g ekstrak
etanolik kering. Ekstrak etanolik kering yang dihasilkan berwarna hitam.
0 # *) $)#& #! ' $%#-#. ;#! 3*
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang
berusia ±12 minggu karena tikus pada usia ini telah dewasa sehingga sistem organ
telah terbentuk dengan baik. Pemilihan hewan uji ini berdasarkan kemiripan
dengan manusia dalam hal absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi
(ADME) karena diharapkan penelitian ini dapat diaplikasikan pada manusia.
Tikus dipilih sebagai hewan uji karena mempunyai ADME yang mirip manusia,
mudah didapat, mudah ditangani selama masa perlakuan. Tikus yang digunakan
adalah galur Wistar. Jenis kelamin tikus dipilih jantan karena lebih sedikit
dipengaruhi hormon reproduksi sehingga variasi lebih sedikit dibanding tikus
betina.
Dalam penelitian menggunakan hewan uji, penting untuk memperhatikan
perlakuan dan pemeliharaan hewan uji yang meliputi kebersihan kandang,
kecukupan makanan dan minuman, lingkungan yang tenang dan nyaman (cahaya
dan sirkulasi udara yang cukup) karena akan mempengaruhi kesahihan penelitian.
Proliferasi sel limfosit diinduksi oleh antigen yang dipejankan, yaitu vaksin
Hepatitis B sehingga faktor penginduksi yang lain perlu diminimalisir agar hasil
tidak menjadi bias. Selama 48 hari hewan uji dipejani dengan ekstrak etanolik
daun mimba. Dosis yang digunakan adalah 35 mg/kg BB, 70 mg/kgBB dan 140
mg/kg BB tikus. Pemilihan dosis ini mengacu pada penelitian yang pernah
dilakukan yaitu ekstrak air daun mimba pada dosis 100 mg/kgBB mencit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
mempunyai efek peningkatan titer antibodi (Ray, 1996). Selain itu ada kelompok
kontrol negatif yang mendapat perlakuan aquades. Rute pemberian yang dipilih
adalah rute oral karena sama dengan rute yang digunakan pada manusia.
Dalam penelitian ini pemantauan kesehatan dilihat dari penambahan
berat badan tikus yang diukur setiap hari (Gambar 3). Tikus dengan kondisi
patologis buruk cenderung mengalami penurunan berat badan secara drastis
sehingga dapat menjadi tanda peringatan untuk melakukan perlakuan khusus.
Selain untuk pemantauan kesehatan, pengukuran berat badan ini digunakan untuk
penyesuaian volume pemberian ekstrak mimba pada setiap tikus sehingga
pemberian ekstrak mimba sesuai dengan berat badan masing;masing tikus.
#+,#$ 2 $(/*) #'#8$#'# $#' #-#! *& '*#. *!"" )#+# # # $)#& #!
Pemberian ekstrak etanolik daun mimba pada dosis tertinggi
menyebabkan perubahan warna dan konsistensi feses tikus. Setelah 3 minggu
perlakuan warna feses tikus kehitaman dan konsistensinya menjadi lebih keras.
Gejala ini mengindikasikan adanya kerusakan hepar karena pemejanan mimba
dalam jangka waktu yang lama. Dari penelitian toksisitas akut ekstrak etanolik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
daun mimba diperoleh informasi bahwa potensi ketoksikan akut ekstrak etanolik
daun mimba termasuk dalam kategori praktis tidak toksik (5;15 g/kgBB manusia)
namun terjadi perubahan histopatologi pada hepar dengan pemejanan ekstrak
etanolik daun mimba dosis 182 mg/kgBB mencit (Apriyanto, 2002). Berdasarkan
informasi tersebut, penting untuk menyelidiki perubahan histopatologi hepar tikus
terkait dengan perubahan warna dan konsistensi feses pada masa perlakuan. Hasil
gambaran histologi hepar tikus kelompok dosis tertinggi (140 mg/kgBB tikus)
antara lain terjadi penebalan dan muncul vakuola pada kapsula Glissoni (selaput
pembungkus hepar), inflamasi, pelebaran sinusoid, hemorraghi pada daerah di
sekitar kapsula Glissoni, hepatosit normal (Gambar 4). Perubahan histo hepar
yang terjadi hampir sama dengan penelitian Apriyanto pada mencit yang dipejani
ekstrak 182 mg/kgBB mencit, yaitu terjadi hemorraghi, inflamasi, serta pelebaran
sinusoid. Pada penelitian Apriyanto terjadi degenerasi melemak yang tidak terjadi
pada penelitian ini. Hal ini mungkin karena perubahan yang terjadi belum sampai
mempengaruhi metabolisme lemak dalam hepar. Perubahan;perubahan yang
terjadi pada hepar ini bersifat reversibel, yaitu dapat kembali seperti semula
karena sel hepatosit hepar normal. Namun demikian, perlu berhati;hati untuk
pemakaian ekstrak etanolik daun mimba dalam jangka waktu lama. Mimba juga
dikenal mempunyai efek antifertilitas (Biswas, 2002) sehingga dianjurkan untuk
tidak digunakan oleh wanita hamil.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
# ,
#+,#$ : * '()("* .#$ #!.# $)#& #! & '$#& '#!()*& # ! *+,# $, #$#! : 7 # * '()("* .#$ - !"#! $)#& #! & '$#& '#!()*& # ! *+,# ( * 1: +"?&" . $, #$#! : 7 , * % .#'( *' ** *! (*- *** &#. )# ")* (!* *6 6#& ()# 6 ) $#-#!"
# *) ()# * ) *+/( *'
Sel limfosit yang akan dikultur diambil dari organ limpa. Tujuan kultur
sel ini adalah untuk mengetahui proliferasi sel limfosit yang ada di dalam limpa.
Sel limfosit yang akan dikultur diambil dari organ limpa karena organ ini
merupakan organ limfoid sekunder yang menghasilkan sel B dan sel T limfosit,
tempat utama produksi antibodi dan sensitisasi sel T antigen spesifik, serta
merupakan tempat terjadinya respon imun terhadap antigen yang masuk dalam
sirkulasi darah.
Pengambilan sel limfosit dilakukan dengan metode ekstruksi limpa untuk
dapat meminimalisir kerusakan sel limfosit selama proses isolasi. Metode
ekstruksi dilakukan dengan cara menyuntikkan medium RPMI tanpa serum dalam
organ berulang;ulang dari berbagai sisi sampai terjadi suspensi sel yang mengalir
keluar dari organ.
Selanjutnya suspensi sel ditambahkan buffer tris ammonium chlorida
untuk melisiskan sel darah merah dan pellet dipisahkan dengan sentrifugasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Pemberian Fetal Bovine Serum (FBS) bertujuan untuk memacu pertumbuhan sel
limfosit (# ), sebagai nutrisi dan membuat sel bertahan hidup lebih
lama. Suspensi sel selanjutnya dihitung dengan hemocytometer untuk mengetahui
kepadatan sel dari suspensi yang diperoleh dari isolasi. Perhitungan ini perlu
dilakukan karena untuk melihat respon imun tidak dapat dilihat dari jumlah sel
dalam suspensi karena jumlah sel ini sangat tergantung dari proses pengeluaran
sel dari organ limpa. Setelah diketahui kepadatan suspensi, sejumlah volume
suspensi tertentu diambil kemudian dikultur. Kepadatan yang diperlukan dalam
medium 2,0 x 105sel limfosit(Gambar 5).
#+,#$ < )' $ ) *+/( *' *- . $, #$#! : 7
# *) 3* !*!"&#'#! $()*/ $# * ) *+/( *'
Metode uji peningkatan proliferasi limfosit yang digunakan dalam
penelitian ini adalah metode MTT. Metode MTT dipilih karena pengukuran relatif
cepat dengan pembacaan absorbansi yang dilakukan secara spektrofotometri
dengan menggunakan , . Selain itu metode ini aman karena
tidak menggunakan bahan radioaktif. MTT (3;(4,5;dimethylthiazol;2;yl);2,5;
diphenyltetrazolium bromide) merupakan suatu garam yang larut air. Metode
MTT merupakan salah satu metode kolorimetri. Prinsip dari metode MTT yaitu
terjadinya reduksi garam tetrazolium MTT oleh enzim mitokondrial
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
NADH
NAD+
MTT
Br
Formazan
dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria sel sehingga terbentuk kristal
formazan yang berwarna ungu (Gambar 6).
#+,#$ = #& * +, !' &#! $* '#) ($+#@#!
Kristal formazan ini bersifat tidak larut air. Penambahan detergen
(sodium dodesil sulfat 10%) yang terdapat dalam # , akan
melarutkan kristal formazan. Intensitas warna ungu yang terbentuk dapat dibaca
dengan ELISA pada panjang gelombang 550 nm Jumlah sel hidup
berbanding lurus dengan intensitas warna dari formazan yang terbentuk.
Data yang diperoleh dari pengukuran ini berupa absorbansi atau
(OD) suspensi sel (Tabel I) yang kemudian diolah secara statistik untuk
mengetahui apakah ada perbedaan karena perlakuan dengan ekstrak etanolik daun
mimba (Gambar 7).
#, ) #'# #'#8$#'# , ($,#! * ) *+/( *' -#! '#!-#$ 6*# * ' )#% !& ,# *
)#+# > 3#+
#'#8$#'# , ($,#! * # *) !" & $#! )' $ ) *+/( *'
Kelompok Rata;rata Absorbansi±SD 1 Kontrol aquades 0,512±0,079 2 Dosis 1 (35 mg/kg) 0,803±0,133 3 Dosis 2 (70 mg/kg) 0,831±0,062 4 Dosis 3 (140 mg/kg) 0,815±0,049
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
#+,#$ > $#/*& #'#8$#'# , ($,#! * )(+.(& (!'$() -#! $)#& #!
Untuk melihat apakah ada perbedaan yang bermakna antar kelompok
perlakuan dilakukan uji statistik dengan taraf kepercayaan sebesar 95%. Uji
Statistik yang digunakan adalah uji Kruskal Wallis menggunakan program SPSS
12,0. Uji Kruskal Wallis dipilih karena distribusi data tidak normal dan data tidak
homogen. Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan ada perbedaan yang signifikan
antar kelompok perlakuan (P<0,05). Uji Kruskal Wallis juga dilakukan untuk
melihat perbedaan antar kelompok yang diberi perlakuan mimba. Hasil uji
menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna antar kelompok perlakuan dosis 35
mg/kgBB, 70 mg/kgBB, 140 mg/kgBB yang berarti bahwa peningkatan efek tidak
dipengaruhi oleh dosis ekstrak etanolik yang diberikan. Jika demikian untuk
pengembangan selanjutnya dapat dipilih dosis yang paling kecil yaitu dosis 35
mg/kgBB tikus karena beresiko menimbulkan efek samping yang lebih kecil
dibanding dengan dosis yang tinggi.
Peningkatan proliferasi sel limfosit dipengaruhi oleh respon imun secara
umum. Pada paparan antigen yang pertama, makrofag akan mengaktifkan sel T
helper 1 (Th1) yang akan memproduksi sitokin khususnya interferon γ (IFN;γ)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
dan interleukin 2 (IL;2) yang dapat memacu proliferasi sel limfosit. Pada ekstrak
etanolik daun mimba terdapat flavonoid yang dapat meningkatkan produksi sel
Th1 dan produksi IFN;γ namun dapat menurunkan sitokin Th2 (IL;4) sehingga
dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit (Nair , 2002). Pengukuran yang
dilakukan terhadap titer antibodi menunjukkan adanya penurunan IgG tikus
karena pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dosis 70 mg/kgBB (Penelitian
belum dipublikasi). Dari perbandingan hasil ini dapat diketahui bahwa ekstrak
etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit namun juga
dapat menurunkan produksi antibodi pada tikus. Hal ini mungkin karena
flavonoid pada ekstrak etanolik daun mimba menurunkan produksi IL;4 yang
merupakan salah satu sitokin yang membantu diferensiasi sel B menjadi sel
plasma yang mampu memproduksi antibodi (Nair ., 2002).
Selain melihat adanya perbedaan antara kelompok kontrol dan kelompok
perlakuan, dilihat juga persentase kenaikan proliferasi sel limfosit kelompok
perlakuan terhadap kelompok kontrol (Tabel II).
#, ) $ ! #$ !#*&#! $()*/ $# * ) *+/( *' )(+.(& $)#& #!
*,#!-*!"&#! )(+.(& (!'$()
(!'$() A #- $)#& #! 2<+"?&" $)#& #! > +"?&" $)#& #! 1: +"?&" (!'$()
A #- ; 56,83% 62,30% 59,18%
Dilihat dari besarnya persentase kenaikan proliferasi sel limfosit, maka
dosis yang memberikan peningkatan terbesar adalah perlakuan ekstrak etanolik
daun mimba dengan dosis 70 mg/kgBB. Namun demikian tidak ada perbedaan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
yang signifikan antara pemberian ekstrak etanolik dosis 35mg/kgBB dan dosis
70mg/kgBB sehingga untuk pemilihan dosis lebih baik tetap menggunakan dosis
yang rendah.
Dari persentase kenaikan ini dapat dilihat bahwa peningkatan dosis tidak
selalu diikuti dengan peningkatan efek. Pada perlakuan ekstrak mimba dosis 140
mg/kgBB proliferasi lebih rendah dibanding pada dosis 70 mg/kgBB. Hal ini
mungkin disebabkan karena ada efek maksimum peningkatan proliferasi sel
limfosit dengan pemejanan ekstrak etanolik daun mimba pada dosis tertentu.
Kemungkinan yang lain adalah efek toksisitas ekstrak etanol daun mimba
menghambat proliferasi sel limfosit. Hal ini dapat diketahui lebih baik apabila
dilakukan penelitian dengan seri dosis yang lebih banyak untuk mengetahui
berapa dosis maksimum ekstrak etanolik daun mimba yang meningkatkan
proliferasi sel limfosit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
*+. )#!
1. Ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit pada
dosis 35 mg/kgBB, 70 mg/kgBB, 140 mg/kgBB.
2. Peningkatan proliferasi sel limfosit kelompok perlakuan 35 mg/kgBB,
70 mg/kgBB, 140 mg/kgBB ekstrak etanolik daun mimba berturut;turut
adalah sebesar 56,83%, 62,30%, dan 59,18%
3. Hasil histologi hepar menunjukkan adanya perubahan pada organ hepar
setelah pemejanan 140 mg/kgBB ekstrak etanolik daun mimba, yaitu terjadi
hemorraghi, inflamasi, pelebaran sinusoid dan penebalan kapsula glissoni.
Perubahan ini masih reversibel selama sel hepatosit masih normal.
#$#!
1. Perlu dilakukan penelitian ulang dengan seri dosis yang rendah dan lebih
banyak untuk mengetahui profil efek imunostimulan yang dipengaruhi ekstrak
etanolik daun mimba dan dosis yang optimum dari ekstrak etanolik daun
mimba.
2. Perlu dilakukan penelitian lanjut untuk mengetahui senyawa apa yang
bertanggung jawab terhadap efek imunostimulan daun mimba. Penelitian
dapat dilakukan dengan cara memfraksinasi dan mengisolasi senyawa;
33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
senyawa dalam ekstrak etanolik daun mimba kemudian dilakukan uji
peningkatan proliferasi sel limfosit.
3. Perlu dilakukan penelitian lain untuk mengetahui mekanisme imunostimulan
dari ekstrak etanolik daun mimba. Penelitian dapat dilakukan dengan melihat
pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap respon imun nonspesifik,
termasuk respon seluler dan humoral.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Anonim, 1979, - . , Edisi III, 49;52, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim, 1986, / . , 10;16, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 1989, . + Edisi V, 67;71, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim, 1998, 0 . 0 . 1 , Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Anonim, 2000, 2 . . & 3& , Cetakan 1, 1; 6, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim, 2008a, .# 4 2 # ' ,
Center for Immune Research, http://www.immunereseach.com , diakses tanggal 29 Maret 2008
Anonim, 2008b, , http://www.biol.sc.edu/courses/bio102/f97; 39.html, diakses tanggal 3 November 2008
Anonim, 2008c, # , http://en.wikipedia.org/wiki/Antigen, diakses tanggal 1 Oktober 2008
Anonim, 2008d, % ! , http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatitis_B _vaccine, diakses tanggal 1 Oktober 2008
Anonim, 2008e, $% ! ($/ , http://www.crucell.com/Products; Hepavax;Gene, diakses tanggal 16 Oktober 2008
Apriyanto, A., 2002, Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Mimba, . , 42;43, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1963,- 5 ! , Volume I, 3;12, N. V. Noordhoff, Graningen
Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965,- 5 ! , Volume II, 116, 117, 121, N. V. Noordhoff, Graningen
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Baral, R., Chattopadhyay, U., 2004, Neem ( ) Leaf Mediated Immune Activation Causes Prophylactic Growth Inhibition of Murine Erlich Carcinoma and B16 Melanoma,
Mar;4(3):355;66, http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYS TEM.pdf, diakses tanggal 10 Mei 2008
Baratawidjaja, K.G., 2004, # 1 ed ke;6, 413;414, Balai Penerbit FKUI, Jakarta
Biswas, K., Ishita C., Ranajit K. B. and Uday B., 2002, Biological Activities and Medicinal Properties of Neem ( ", Current Science, vol. 82, no. 11, 10 june 2002, www.ias.ac.in/currsci/jun102002/1336.pdf, diakses tanggal 25 April 2008
Castell, J. V., and Gomez;Lechon, M. J., 1997, 6 , 3;6, Academic Press, California
Cook, E.F., Martin, E.W., 1961, # ' , 120;127, The Mack Publishing Company, PA.
Dhote, B. W., Singh G. K., dan Chauhan R.S., 2005, Effect of Immuplus (A Herbal Immunomodulator) on Paraspecific Immune Respones in Chicks, 61, % ! 7, Warsaw, Poland, www.isah;soc.org/documents/ 2005/sections/12_vol_2.pdf, diakses tanggal 21 April 2008
Doyle, A., Griffiths J. B., 2000, , 12;15, 47, John Wiley and Sons, Ltd., England
Duke, J., 1996, Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical Databases, A. Juss ! , http://sun.ars; grin.gov:8080/npgspub/xsql/duke/plantdisp.xsql?taxon=146, diakses tanggal 13 Mei 2008
Gan, V.H.S., dan Handoko, T., 1991, - . # ed 3, 639 – 641, Gaya Baru, Jakarta
Hutapea, J. R., 1993, ! 3& , 67;68, Badan LitBang kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Jain, S., Hariom Y., 2007, , http://www.protocol; online.org/prot/, diakses tanggal 3 April 2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Juyal, P.D., Singla L.D., 2008, Herbal Immunomodulatory and Therapeutics Approaches to Control Parasitic Infection in Lifestock, http://hillagric.ernet.in/education/covas/vpharma/winter%20school/lecture s/24%20Herbal%20immunomodulatory%20approaches%20parasitic.pdf, diakses tanggal 25 April 2008
Mandal, I., Chattopadhyay, U., and Baral R., 2007, Neem Preparation Enhances Th1 Type Immune Response and Anti;tumor Immunity Against Breast Tumor Associated Antigen, vol 7, p.8, http://www.cancerimmunity.org/v7p8/070308.htm, diakses tanggal 10 Mei 2008
Nair N, Mahajan S, Chawda R, Kandaswami C, Shanahan TC, Schwartz SA, 2002, Grape seed extract activates Th1 cells in vitro, 1 # , & ; 9: 470;476, http://www.pubmedcentral.com, diakses tanggal 13 Desembar 2008
Ray, A., Banerjee B.D., Sen P., 1996, Modulation of humoral and cell;mediated immune responses by Azadirachta indica (Neem) in mice, Indian J Exp Biol. 1996 Jul ;34 (7):698;701 8979510, http://lib.bioinfo.pl/pmid:8979510 biobank, diakses tanggal 10 Mei 2008
Roitt, I.M., 1994, # 8th ed., diterjemahkan oleh Harahap, Alida, 76, 137, Penerbit Widya Medika, Jakarta
Sagrawat, H., Khan Y., 2007, Immunomodulatory Plants: A Phytopharmacological Review, # ! Vol 1, Issue 2, Jul;Dec, 2007, http://www.phcog.net/reviews/issue2/9.pdf, diakses tanggal 10 Mei 2008
Sairam M, Sharma S.K., Ilavazhagan G., Kumar D., Selvamurthy W., 1997, Immunomodulatory Effect of NIM;76, A Volatile Fraction from Neem Oil, 5 , Jan; 55(2) :133;9, http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYSTEM.pdf, diakses tanggal 10 Mei 2008
Upadhyay SN, Dhawan S, Garg S, and Talwar GP, 1992,
Immunomodulatory
effects of neem (Azadirachta indica) oil,
5Oct;14(7) : 1187;93, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8979510?Dopt =Abstract, diakses tanggal 10 Mei 2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
#+.*$#! 1 $%*' !"#! ( *
Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan Ray (1996), ekstrak air
daun mimba pada dosis 100 mg/kgBB mencit mempunyai efek peningkatan titer
antibodi. Dosis yang digunakan dalam penelitian ini adalah ½ x, 1x, dan 2x dosis
acuan.
Konversi dosis dari mencit 20 g ke tikus 200 g = 7,0
Dosis I : ½ x 100 mg/kgBB mencit = 50 mg/kgBB
Dosis pada mencit 20 g = x 50 mg/kgBB = 1 mg/20 g
Dosis pada tikus 200 g = 1 mg/20 g x 7,0 = 7 mg/200 g
Dosis per kgBB tikus = 7mg/200g x = 35 mg/kgBB
Dosis II : 100 mg/kgBB mencit = 100 mg/kgBB
Dosis pada mencit 20 g = x 100 mg/kgBB = 2 mg/20 g
Dosis pada tikus 200 g = 2 mg/20 g x 7,0 = 14 mg/200 g
Dosis per kgBB tikus = 14 mg/200g x = 70 mg/kgBB
Dosis III : 2 x 100 mg/kgBB mencit = 200 mg/kgBB
Dosis pada mencit 20 g = x 200 mg/kgBB = 4 mg/20 g
Dosis pada tikus 200 g = 4 mg/20 g x 7,0 = 28 mg/200 g
Dosis per kgBB tikus = 28 mg/200g x = 140 mg/kgBB
Kelompok kontrol aquades :
Volume pemberian per oral untuk tikus 200 g = 0,5 ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Perhitungan dosis antigen
Antigen yang digunakan adalah Hepavax;Gene® dengan dosis 20 Tg
digunakan oleh masyarakat Indonesia dengan asumsi berat badan 50 kg.
Konsentrasi antigen adalah 20 Tg/ml
Konversi dosis dari manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018
Dosis untuk manusia 70 kg = x 20 Tg = 28 Tg
Dosis antigen untuk tikus 200g = 0,018 x 28 Tg = 0,504 Tg/200 g
Volume pemberian intraperitoneal = 2,5 ml
Konsentrasi yang dibuat = = 0,202 Tg/ml ~ 0,2 Tg/ml
Pengenceran dilakukan 100 x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
#+.*$#! #'#8$#'# $#' #-#! *& . $ *!""
#, ) $(/*) $#' #-#! *& # *) #'#8$#'# *!"" #! )#+# # # $)#& #!
$(/*) $#' #-#! *& )#+# # # $)#& #!
*!"" *!"" *!"" *!"" *!"" *!"" *!""
191,8 215,5 230,4 262,8 276,0 289,3 281,3 171,4 200,2 211,7 243,6 255,1 265,7 259,1 195,8 224,8 236,0 271,6 281,7 299,3 284,1 168,9 202,5 215,5 256,5 278,2 292,0 286,8 186,6 197,1 210,1 229,9 245,2 255,8 262,1 164,0 184,8 198,1 230,8 240,1 249,0 237,4
(!'$() A #-
183,5 208,1 215,0 242,1 254,9 263,5 262,0
#'# $#'# 15 42 :4> 1=4> :54 =14= >24< =>4<
150,2 170,3 183,3 207,7 219,3 228,7 219,7 174,8 188,6 202,5 216,6 227,1 246,9 247,4 191,9 216,4 238,3 262,2 264,7 274,6 270,3 158,9 181,2 199,0 213,0 220,8 223,2 213,0 153,0 165,0 181,5 207,7 220,3 232,7 229,7 180,1 199,4 210,4 221,0 231,1 243,2 240,8
$)#& #! ( * 1
2< +"?&"
161,3 180,2 199,8 226,1 236,5 243,4 241,3
#'# $#'# 1=>4 15<4 41 4 214: :145 2>4<
211,5 242,8 266,7 306,3 328,4 343,8 341,1 189,2 211,1 227,9 249,2 256,4 257,8 252,2 164,9 178,0 191,6 224,4 243,0 250,3 241,0 164,8 186,5 207,2 220,0 228,8 239,2 233,3 155,0 169,4 190,5 211,4 222,3 231,2 237,4 167,9 184,0 206,3 232,6 248,5 256,8 254,7
$)#& #! ( *
> +"?&"
179,1 212,3 239,5 276,5 302,7 318,2 311,1
#'# $#'# 1>=41 1 >4> 154< :<45 =14: >14 =>42
153,8 193,3 209,7 233,0 248,7 257,5 256,4 184,5 211,9 214,5 234,4 246,3 253,3 246,8 155,7 187,6 211,4 243,4 251,3 259,4 256,3 140,9 158,9 164,2 186,6 211,7 223,1 233,4 164,8 183,9 197,2 224,8 246,9 244,7 239,7 187,7 175,5 195,0 225,7 247,9 249,5 240,6
$)#& #! ( * 2
1: +"?&"
157,0 213,1 231,7 258,8 264,3 289,2 281,6
#'# $#'# 1=24< 15 4 24: 4< :<42 <245 < 4>
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
#+.*$#! 2 #'# , ($,#! * ) *+/( *'
#, ) # *) 3* $()*/ $# * )' $ ) *+/( *' - !"#! $)#& #! & '$#& '#!()*&
# ! *+,#
, ($,#! * ;#!
3*
)(+.(& (!'$() A #-
)(+.(& ( * 1 2<+"?&"
)(+.(& ( * > +"?&"
)(+.(& ( * 2 1: +"?&"
1 0,410 0,917 0,876 0,729
2 0,570 0,745 0,700 0,826
3 0,431 0,661 0,834 0,805
4 0,455 0,616 0,813 0,834
5 0,603 0,825 0,872 0,781
6 0,536 0,894 0,863 0,856
7 0,582 0,962 0,856 0,877
#+.*$#! : # *) !#)* * '#'* '*& &$*.'*/
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
