PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

penelusuran pustaka untuk uji bioaktivitas fraksi n-heksana, etilasetat, dan

metanol daun dengan metode belum pernah

dilakukan.

* #+ ) # !( ( #

#+ , ( (&

Penelitian ini diharapkan memberikan informasi yang berguna bagi ilmu

pengetahuan khususnya bidang farmasi mengenai bioaktivitas fraksi

n-heksana, etilasetat, dan metanol terhadap larva artemia serta

golongan senyawa yang terdapat dalam fraksi yang paling aktif.

- #+ ) " (&

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat

terkait potensi fraksi daun dalam pengembangannya sebagai

senyawa sitotoksik.

./. # # !( ( #

1. Mengetahui bioaktivitas fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun

terhadap larva artemia pada BST

2. Mengetahui nilai LC50 fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun pada BST

3. Mengetahui golongan senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi daun

#$ # -, #(

Tanaman L. termasuk dalam familia Annonaceae.

Tanaman ini dikenal juga dengan nama asingnya yaitu, (Unites States

Department of Agriculture, 2001).

0 1 0 1

%- # % # 0 1 .# 0 1 .#$

0 ,2 ', # 3 -! #4 .! & 1

&" ()&( .%-.' #

dikenal sebagai tanaman yang umumnya tumbuh di

daerah pesisir dengan tinggi pohon mencapai 12 meter. Daunnya selang seling,

lonjong dengan panjang sampai 15 cm (Gambar 1A), dan bunga berwarna krem

dengan bercak merah didekat bagian dasar (Gambar 1B). Panjang buah sampai 10

cm, berwarna kuning dan daging buah berwana merah muda dengan banyak biji

berwarna hitam (Cambie, 1994).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

* #4.#$ # "(%(

Kandungan toksik adalah alkaloid liriodenine. Batang, kayu,

dan kulit batang mengandung alkaloid ' $ , , ,

, *$ , , , , .

+ ,$-$ $./$ $.0$ juga telah diisolasi. Alkaloid pada daun adalah *$ dan . Ekstrak daun yang terhidrolisis menghasilkan flavonoid 1 dan . Daun, akar dan kulit batang menunjukkan hasil positif adanya alkaloid, dan ekstrak biji mempunyai sifat

insektisidal (Cambie, 1994). Daun juga mengandung asetogenin $

yaitu dan B (Liu , 1999^a), serta asetogenin lainnya yaitu ' dan ()$ ' (Liu ., 1999^b).

(& % ("

Artemia dikenal dengan nama asing termasuk familia

artemiidae, genus , dan spesies Leach (Mudjiman, 1989).

(#$".#$ # '(4.)

Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6^oC atau lebih dari 35^oC, tetapi hal ini sangat bergantung pada ras dan kebiasaan tempat hidup mereka. Maka dari itu, pertumbuhan artemia yang baik berkisar pada suhu antara

25-30^oC. Daya tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia dalam air tenyata juga sangat tinggi. Apabila kandungan ion natrium dibandingkan

dengan ion kalium di dalam air laut alami adalah 28, maka Artemia masih dapat

bertahan pada perbandingan antara 8-173 (Mudjiman, 1989).

Artemia dapat berkembang dengan baik pada kadar garam yang tinggi.

Pada kadar garam yang tinggi, artemia terhindar dari musuh-musuh yang tidak

dapat hidup pada kadar garam yang tinggi. Artemia dapat hidup di perairan

dengan kadar garam antara 1-300 per mil (Mudjiman,1989).

Artemia juga dapat hidup dan menyesuaikan diri pada tempat yang kadar

oksigennya rendah maupun yang mengalami kejenuhan oksigen. Pengaruh pH

terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa belum jelas namun berpengaruh

terhadap penetasan . Apabila pH untuk penetasan kurang dari 8, maka

efisiensi penetasan akan menurun. banyak yang tidak menetas atau waktu

penetasan lebih panjang (Mudjiman, 1989).

* ' ) ) " %- #$ # %(

Istilah untuk telur artemia adalah , yaitu telur yang telah

berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian diselubungi oleh

cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio

terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan

mempermudah pengapungan. Oleh karena itu, ia sangat tahan menghadapi

keadaan lingkungan yang buruk (Mudjiman, 1989).

Apabila siste artemia direndam dalam air laut bersuhu 25ºC, maka akan

menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah larva yang

juga dikenal dengan istilah . Dalam perkembangan selanjutnya, larva

akan mengalami 15 kali perubahan bentuk atau metamorphosis. Setiap kali larva

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan. Larva tingkat I

dinamakan instar I, tingkat II dinamakan instar II, tingkat III dinamakan instar III,

demikian seterusnya sampai instar XV. Setelah itu berubahlah menjadi artemia

dewasa (Mudjiman, 1989).

%- 5 %( 0 .4/(% # 6761

Larva yang baru saja menetas masih dalam tingkatan instar I. Warnanya

kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh

karena itu mereka masih belum perlu makan. (Mudjiman, 1989).

%- * ' ) ) .- ' # - # ." %( 0 .4/(% # 6761

Sekitar 24 jam setelah menetas, larva akan berubah menjadi instar II.

Pada tingkatan instar II, larva udah mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan

itu, cadangan makanannya juga sudah mulai habis. Pada tingkatan selanjutnya

mulai terbentuk sepasang mata majemuk, selain itu berangsur-angsur tumbuh

tunas-tunus kakinya. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap sebanyak

11 pasang, maka berakhirlah masa larva, dan berubah menjadi artemia dewasa

(Mudjiman, 1989).

%- 8 %( 4 2 & 0 .4/(% # 6761

8 #$$.# # %( ) 4 0 1

Uji BST dengan hewan uji artemia dapat digunakan untuk skrining awal

terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor karena uji

ini mempunyai kolerasi yang positif dengan potensinya sebagai antitumor maupun

fisiologis aktif tertentu (Anderson, Goets, dan McLaughlin, 1991).

Artemia digunakan sebagai hewan uji karena memiliki kesamaan

tanggapan dengan mamalia, misalnya tipe DNA- RNA

artemia serupa dengan yang terdapat pada mamalia (Solis ., 1993). Artemia

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

juga memiliki $ & Na⁺dan K⁺ ATP Na⁺dan K⁺ ATP merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis ATP menjadi

ADP serta menggunakan energi untuk mengeluarkan 3Na⁺ dari sel dan mengambil 2K⁺ ke dalam, tiap sel bagi tiap mol ATP dihidrolisis. Na⁺ K⁺ ATP ditemukan dalam semua bagian tubuh. Aktivitas enzim ini dihambat oleh

. Adanya menyebabkan keseimbangan ion Na+ dan K+ tetap

terjaga (Ganong,1995). Jika suatu senyawa bekerja mengganggu kerja salah satu

enzim ini pada artemia dan menyebabkan kematian artemia, maka senyawa

tersebut bersifat toksik dan dapat menyebabkan kematian sel mamalia (Solis ,

1993).

3 0 1

(BST) merupakan salah satu metode uji

toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang

bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai $

dari bahan alam karena mudah, cepat, murah, dan cukup

reprodusibel. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan

aktivitasnya dimonitor dengan BST menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu

uji spesifik antikanker (Harmita, and Radji, 2006).

Penggunaan BST sebagai pertama kali dilaporkan oleh Tarpley

untuk menentukan keberadaan residu insektisida, menentukan senyawa anestetik,

serta menentukan tingkat toksisitas air laut. Selanjutnya, Meyer dan kawan-kawan

ekstrak tanaman yang ditunjukkan sebagai toksisitas terhadap larva artemia.

Toksisitas ditentukan dengan melihat harga LC₅₀ yang dihitung berdasarkan analisis probit. (Harmita, and Radji, 2006). Apabila harga LC50<1000 µg/ml maka senyawa dapat dikatakan toksik. Apabila pengujian dengan larva artemia

menghasilkan harga LC₅₀<1000 µg/ml maka dapat dilanjutkan dengan pengujian antikanker menggunakan biakan sel kanker. Cara ini akan menghemat waktu dan

biaya penelitian (Meyer , 1982).

Metode untuk mendeteksi adanya aktivitas biologi suatu ekstrak tanaman

dalam skrining dapat dibagi menjadi dua kelompok besar:

dan # . dibagi menjadi dua kelompok lagi yaitu dan

(Bohlin, and Bruhn, 1999).

BST merupakan metode kelompok

yang merupakan & & pada larva artemia. Sejak dikenalkan pada tahun 1982, metode ini telah digunakan untuk isolasi & & agen antitumor dan pestisida yang dihasilkan oleh tanaman (Bohlin, and Bruhn, 1999). Metode ini

melihat kematian larva artemia dalam waktu pengamatan 24 jam yang merupakan

suatu pengujian toksisitas akut. Uji toksisitas akut adalah uji tunggal yang

dilakukan kepada hewan uji menggunakan senyawa-senyawa/zat-zat kimia yang

berkaitan dengan kepentingan biologi dalam jangka waktu tertentu.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Pengamatannya dilakukan selama 24 jam dan bertujuan untuk menentukan tingkat

letalitasnya (Donatus, 2001).

Pengamatan aktivitas biologi yang dilakukan pada uji toksisitas akut

dapat berupa pengamatan gejala-gejala klinis, kematian hewan uji, atau

pengamatan hispatologi organ. Data yang dapat diperoleh pada uji toksisitas akut

dapat berupa data kuantitatif yang dinyatakan dengan harga 2 + 34 (LD₅₀) dan 2 34 (LC₅₀). LD₅₀ merupakan dosis senyawa uji yang dapat menimbulkan kematian 50% jumlah hewan uji sedangkan

LC50 merupakan kadar (konsentrasi) senyawa uji yang mampu menimbulkan kematian 50% hewan uji. Harga LD₅₀dan LC₅₀ suatu senyawa harus dilaporkan sesuai dengan lamanya hewan uji yang diamati. Apabila lama pengamatan tidak

ditunjukkan dianggap bahwa pengamatan dilakukan selama 24 jam (Donatus,

2001).

#9 ( #

Penyarian adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan

kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda. Prinsip

penyarian adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non

polar dalam senyawa non polar (Harborne, 1987).

Cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif yang

berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa lainnya

dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa aktif

Republik Indonesia, 1985). Ada dua pertimbangan dalam memilih pelarut yang

akan digunakan dalam penyarian, yaitu memiliki daya melarutkan yang tinggi dan

pelarut tersebut tidak berbahaya atau tidak beracun (Somaatmadja, 1981). Daya

melarutkan suatu pelarut bergantung terhadap kepolaran pelarut dan senyawa

yang terlarut. Suatu senyawa akan terlarut dalam suatu pelarut yang sesuai dengan

prinsip “like dissolve like” yang artinya suatu senyawa akan terlarut pada pelarut

yang memiliki kepolaran yang hampir sama. Indikator kelarutan pelarut dapat

ditentukan dari nilai konstanta dielektrik dan nilai polaritas pelarut (Stahl, 1985).

- ! (! ( ",#& # 4( ! " (" - - $ ( : ) ! . 0 '! 67;1 ,#& # ( ! " (" ! . ,! ( & 1,890 2,023 2,238 2,284 4,806 4,340 6,020 20,700 24,300 33,620 80,370 Petroleum eter Sikloheksana Karbon tetraklorida Toluene Benzene Diklorometan Kloroform Etileter Etilasetat Aseton n-propanol etanol metanol air Non-polar Polar

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam penyari. Penyari akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat

aktif. Zat aktif akan larut karena adanya beda konsentrasi antara larutan di dalam

dan di luar sel. Larutan yang lebih pekat akan terdesak keluar. Peristiwa ini

berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di

luar sel (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986 ). Hasil maserasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

maksimal biasanya dilakukan dengan maserasi menggunakan sederetan pelarut

atau metode Charauxs- Paris yaitu metode penyarian dengan menggunakan

pelarut yang berbeda kepolaran, dimana ekstrak pekat pelarut polar diekstraksi

kembali dengan pelarut semipolar dan pelarut non polar (Harborne, 1987).

,% ,$ +( )(& ()(&

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode

kromatografi untuk fitokimia yang berdasarkan pada proses adsorpsi. Suatu

senyawa dilewatkan pada lapisan yang disebut fase diam dengan bantuan suatu

pelarut sebagai fase gerak. Fase diam yang biasa digunakan adalah silica atau

alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau alumunium, dan fase gerak

berupa pelarut organik (Gritter, 1991).

Jarak pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya dinyatakan

dalam angka Rf atau hRf, dimana angka tersebut dapat digunakan untuk

identifikasi senyawa yang dianalisis. Harga Rf merupakan karakteristik KLT.

Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf

dan ukuran yang hampir sama. Harga Rf untuk suatu senyawa dapat dibandingkan

dengan harga standar (Stahl, 1985).

Deteksi bercak pada lempeng kromatografi yang telah dikembangkan

dapat menggunakan sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan pereaksi semprot.

indikator fluoresensi, terbatas pada senyawa yang mempunyai cincin aromatik dan

ikatan rangkap terkonjugasi (Stahl, 1985).

#4 & # , (

merupakan salah satu tanaman yang telah diketahui

memiliki aktivitas antikanker karena memiliki beberapa senyawa yang dapat

menghambat maupun menyebabkan kematian pada sel kanker. Senyawa-senyawa

yang terkandung di dalamnya antara lain alkaloid , ,$-$ $./$ $.0$ , flavonoid 1 dan , asetogenin $

Penyarian bertingkat bertujuan untuk menyari senyawa-senyawa yang

terdapat dalam daun . Senyawa yang terkandung memiliki polaritas yang

berbeda-beda sehingga digunakan 3 macam pelarut dengan tingkat kepolaran yang

berbeda yaitu metanol, etilasetat, dan heksana. Metanol merupakan pelarut

organik yang bersifat polar sehingga akan melarutkan senyawa-senyawa yang

memiliki sifat kepolaran sama dengan metanol, seperti flavonoid quercetin.

Begitupula dengan n-heksana akan melarutkan senyawa yang larut dalam pelarut

organik non-polar seperti alkaloid bebas dan asetogenin, namun pada asetogenin

sendiri masih memiliki gugus hidroksi yang bersifat polar meskipun terdiri dari

rantai karbon yang panjang sehingga tidak semua asetogenin dapat larut dalam

pelarut non-polar seperti n-heksana. Oleh karena itu etilasetat yang memiliki

tingkat kepolaran diantara metanol dan n-heksana digunakan untuk melarutkan

asetogenin yang belum tersari pada pelarut n-heksana.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Pengujian bioaktivitas fraksi digunakan metode

(BST) yang merupakan pengujian bioaktivitas suatu bahan terhadap hewan

uji larva artemia. Bioaktivitas suatu senyawa ditunjukkan dengan nilai LC50, apabila harga LC50 <1000 µg/ml maka senyawa dapat dikatakan bioaktif.

(), &(&

Fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun memiliki

bioaktivitas terhadap larva artemia pada metode BST. Fraksi metanol, etilasetat,

dan n-heksana memiliki nilai LC50 yang berbeda. Fraksi n-heksana mengandung golongan senyawa kimia berupa alkaloid dan asetogenin, fraksi etilasetat berupa

#(& 4 # #< #$ # # !( ( #

Penelitian tentang uji bioaktivitas fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol

daun dengan metode BST merupakan jenis eksperimental murni dengan

rancangan % " +

( - ! 4 # +(#(&( ) &(,# !

( - ! # !( ( #

Variabel-variabel dalam penelitian ini adalah:

a. Variabel bebas

Konsentrasi fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun

b. Variabel tergantung

Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian fraksi metanol,

etilasetat, dan n-heksana daun .

c. Variabel pengacau terkendali

1) Lingkungan tempat percobaan: suhu penetasan artemia 25^o-30^o C, cahaya dengan sinar lampu 5 watt, air laut buatan dengan kadar garam

3,8 permil.

2) Subyek uji: Umur larva artemia 48 jam.

3) Tanaman: spesies atau varietas tanaman

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

d. Variabel pengacau tak terkendali

1) Umur tanaman

2) Kondisi patologis larva artemia

+(#(&( ) &(,# !

a. Fraksi n-heksana daun adalah fraksi kental yang diperoleh

dengan maserasi serbuk kering daun menggunakan pelarut

n-heksana.

b. Fraksi etilasetat daun adalah fraksi kental yang diperoleh dengan

maserasi serbuk kering daun menggunakan pelarut etilasetat,

sebelumnya telah dimaserasi dengan n-heksana terlebih dahulu.

c. Fraksi metanol daun adalah fraksi kental yang diperoleh dengan

maserasi serbuk kering daun menggunakan pelarut metanol,

sebelumnya telah dimaserasi dengan heksana dahulu kemudian maserasi

dilanjutkan dengan etilasetat.

d. LC₅₀ adalah konsentrasi fraksi metanol, etilasetat, dan heksana daun yang menyebabkan kematian 50% pada populasi hewan uji dalam

waktu 24 jam dan merupakan data kuantitatif yang diperoleh dari

3 ' # # !( ( #

' # # % #

Daun yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Kebun

Tanaman Obat Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo,

Depok, Sleman, Yogyakarta.

' # ) #9 ( #

Pelarut yang digunakan dalam penyarian adalah metanol teknis, etil asetat

teknis, dan n-heksana teknis.

* ' # ./(

Bahan yang digunakan dalam uji BST adalah artemia ("

5 , 5 ), air laut buatan berkadar garam 3,8 permil, ragi

& (fermipan), fraksi metanol, etilasetat, dan heksana daun .

8 ' # ( ! . -. # 0 1

Bahan ALB terdiri dari natrium klorida 38 g dalam 1 liter aquadest.

; ' # " ,% ,$ +( ! )(& ()(& 0 1

Kecuali aquadest, bahan untuk KLT yang digunakan sebagai fase gerak

dengan derajat kualitas pro analisis berupa : kloroform, aseton, dietilamin,

, , asam formiat, dietileter, petroleum eter. Reagen yang

digunakan, yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi aluminium klorida, kalium

permanganat 0,32%. Plat KLT dengan Silica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt) sebagai fase diam.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

! # !( ( #

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas

(Pyrex), kain hitam, (National), ayakan no 40, (2100), &

& (Janke & Kunkel), neraca analitik (Mettler Tolendo AB 204), aquarium penetasan artemia., lampu 5 watt (Dop), aerator, pipet tetes, flakon,

& ' ' (Djikstra), micropipette (SOCOREX), lempeng kaca, alat-alat gelas (Pyrex), bejana kromatografi, kertas saring, oven (Memmert), lampu UV 254 nm,

alat semprot, pipa kapiler 5 µl.

3 # !( ( #

%(# &( # % #

Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmokognosi Fitokimia

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan cara membandingkan habitus

tanaman dengan pustaka acuan (Backer, and Bakhuizen van den Brink, 1963).

#$.%).! # - ' #

Daun diperoleh pada bulan September tahun 2011 di Kebun

Tanaman Obat Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo,

Depok, Sleman, Yogyakarta. Daun yang diambil adalah daun ke-4 sampai ke-5

dari ujung tangkai.

* #$ (#$ # 4 # ) %-. # & -."

Daun dicuci dengan air bersih mengalir, kemudian

diangin-anginkan, setelah daun bersih kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari

dipindahkan ke oven dengan suhu 40-45^oC untuk dikeringkan, daun dinyatakan kering apabila daun hancur ketika diremas. Selanjutnya dipotong kecil-kecil dan

diserbuk dengan . Serbuk kering daun kemudian diayak dengan ayakan no

mesh 40.

8 & &(

Penyarian yang dilakukan adalah penyarian bertingkat dengan metode

maserasi. Serbuk kering daun ditimbang sebanyak 60 g dan dibagi

menjadi dua masing-masing 30 g kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer

dengan ditambah pelarut n-heksana sebanyak 250 mL. Erlenmeyer ditutup dengan

aluminium foil, lalu diletakkan pada dengan laju konstan 150 rpm selama

24 jam kemudian larutan disaring dengan corong Buchner. Ampas yang diperoleh

pada penyaringan kembali dimaserasi dengan 250 mL n-heksana hingga diperoleh

filtrat yang berwarna pucat. Selanjutnya, disaring kembali dengan corong

Buchner dan ampas dikeringkan pada suhu ruangan hingga terbebas dari pelarut

heksana.

Ampas yang telah bebas dari pelarut heksana kembali di maserasi dengan

250 mL pelarut etilasetat selama 24 jam pada dengan laju konstan 150 rpm

kemudian disaring dengan corong Buchner. Ampas yang diperoleh kembali

dimaserasi dengan 250 mL etilasetat hingga diperoleh filtrat yang berwarna

pucat. Selanjutnya, disaring dengan corong Buchner dan ampas yang diperoleh

dikeringkan kembali sampai terbebas etilasetat.

Ampas kembali diberi perlakuan seperti prosedur sebelumnya, namun

pelarut yang digunakan diganti dengan 250 mL metanol kemudian di letakkan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

pada selama 24 jam dengan laju konstan 150 rpm. Saring kembali dengan

corong Buchner dan ampas yang diperoleh kembali ditambah dengan 250 mL

metanol. Maserasi kembali dengan sampai memperoleh filtrat yang

berwarna pucat.

Ketiga fraksi yang dihasilkan masing-masing dipekatkan dengan &

& hingga diperoleh fraksi pekat metanol, etilasetat, dan heksana. Fraksi pekat kemudian dimasukkan dalam oven dengan suhu 50^oC untuk memperoleh fraksi kental dengan bobot tetap. Fraksi yang telah diperoleh dihitung

rendemennya. Selanjutnya, fraksi dibuat peringkat konsentrasi untuk pengujian

bioaktivitas terhadap larva artemia.

; /( -(, " (5( & 4 #$ # % ,4

a. Pembuatan ALB

Natrium klorida ditimbang sebanyak 38 g, kemudian dilarutkan

terlebih dahulu di gelas Beaker dengan menambahkan sebagian aquadest.

Larutan natrium klorida kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 1 L,

ditambahkan aquadest sampai tanda.

b. Penetasan Leach

artemia ditetaskan dengan media air laut buatan. Bak

penetasan (aquarium) yang digunakan terdiri dari ruangan yang disekat

menjadi dua bagian, bagian terang dan bagian gelap, dengan lubang pada

sekat 1 cm. Bagian gelap merupakan tempat ditaburkannya artemia

dan ukuran ruangnya lebih kecil dibanding bagian terang. Bagian terang

jam, kemudian menjadi larva. Larva yang aktif akan bergerak menuju

tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Larva yang aktif digunakan

untuk uji BST setelah berumur 48 jam.

c. Pembuatan larutan sampel dan kontrol

Pembuatan larutan stok dengan konsentrasi 0,1% (1000 µg/ml)

dilakukan dengan melarutkan 10 mg tiap fraksi n-heksana, etilasetat, dan

metanol dalam 10 mL pelarut masing-masing fraksi. Larutan sampel

fraksi n-heksana dan etilasetat dibuat dengan mengambil volume tertentu

dari stok masing-masing dan ditambahkan pelarut masing-masing hingga

tanda 5 ml pada labu ukur seperti yang terlihat pada tabel II.

- ! ( ",#& # &( ! . # & %) ! + "&( # ' "& # 4 # (! &

Konsentrasi Larutan stok (C1) (µg/ml)

Volume larutan stok yang diambil

(V1) (ml) Volume akhir (V2) (ml) Konsentrasi larutan sampel (C2) (ml) 1000 0,05 5 10 0,085 17 0,145 29 0,245 49 0,42 84

Larutan sampel fraksi metanol dibuat dengan mengambil volume

tertentu dan ditambahkan metanol hingga tanda 5 ml pada labu ukur

seperti yang terlihat pada tabel III.

- ! ( ",#& # &( ! . # & %) ! + "&( % #,!

Konsentrasi Larutan stok (C1) (µg/ml)

Volume larutan stok yang diambil

(V1) (ml) Volume akhir (V2) (ml) Konsentrasi larutan sampel (C2) (ml) 1000 0,5 5 10 0,85 17 1,45 29 2,45 49 4,2 84

Masing-masing larutan dengan konsentrasi tersebut dimasukkan

kedalam flakon, yang telah diberi tanda 5 ml terlebih dahulu sebelumnya.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Kemudian dikeringkan di dalam oven dengan suhu 50^oC, sedangkan kontrol dibuat dengan memasukkan masing-masing pelarut yakni metanol,

etilasetat, dan heksana ke dalam flakon sebanyak 5 mL kemudian

dikeringkan di dalam oven dengan suhu 50^oC. Replikasi sebanyak 6 kali. d. Uji bioaktivitas pada larva artemia

Uji bioaktivitas dilakukan pada larva artemia berumur 48 jam,

masing-masing 10 ekor larva artemia diambil secara random kemudian

dimasukkan ke dalam flakon yang telah dikeringkan sebelumnya. Flakon

di isi dengan 3 mL air laut buatan terlebih dahulu kemudian divortex. Ragi

ditambahkan 1 tetes (3mg ragi dalam 5mL ALB) pada tiap flakon sebagai

makanan. Tambahkan ALB kembali sampai volume 5 mL untuk tiap

flakon.

Pengamatan dilakukan 24 jam terhadap kematian larva artemia

setelah diberi perlakuan. Analisis data dilakukan untuk mencari LC50

dengan analisis probit dengan tingkat kepercayaan 95%.

= 4 # (+(" &( $,!,#$ # & #9 2 + "&(

Fraksi dengan toksisitas tertinggi (LC₅₀ paling rendah) dilakukan identifikasi golongan senyawa dengan cara memisahkan kandungan senyawa

bioaktif menggunakan analisa Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Identifikasi

dengan KLT digunakan plat silika gel 60 F₂₅₄sebagai fase diam. Fraksi daun ditotolkan pada jarak ± 1 cm dari tepi bawah plat dengan pipa

kapiler kemudian dikeringkan dan dielusi dengan masing-masing fase gerak

jarak pengembangan, elusi dihentikan. Bercak pada permukaan plat diperiksa

Dalam dokumen Uji bioaktivitas fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun Annona glabra L. dengan metode brine shrimp lethality test - USD Repository (Halaman 22-96)