BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.2 Tumor Nekrosis Faktor Alpha…
2.2.3 Polimorfisme gen -308 G/A TNFα dan perannyaterhadap
Secara in vivo dan in vitro TNFα dibuktikan sebagai tumorgenik. TNFα juga juga merupakan kunci molekul angiogenik secara langsung pada angiogenesis melalui proliferasi sel endotel dan secra tidak langsung dengan mengatur ekpresi proangigenetik lainnya (Wang et al, 2011).
Gen TNFα lokasinya berada pada kromosom 6 (6 p21. 3) di region klas III pada MHC. Polimorfisme gen TNFα terutama terdapat pada posisi -308 dan -238, polimorfisme ini sangat mempengaruhi repon-respon sitokin pro inflamasi, adanya mutase pada gen TNFα agen inflamasi yang ditimbulkan makin berat.
TNFα-308 G/A (rs 1800629) adalah satu dari polimorfisme yang umum yang berhubungan dengan peningkatan produksi TNFα. Namun, ada beberapa penelitian menunjukkan TNFα -308 polomorfisme tidak memiliki efek signifikan terhadap ekpresi dari TNFα. Selain itu, beberapa polimorfisme dalam gen terkait juga dapat mengatur TNFα secara langsung ataupun tidak langsung (Wang et al, 2011).
Polimorfisme merupakan variasi urutan DNA yang menyebabkan keanekaragaman genetik dalam 1% populasi. Informasi yang terdapat dalam gen disusun oleh DNA ditentukan dari urutan asam amino dalam protein. Ketika gen disusun dengan urutan yang berbeda maka gen tersebut dianggap polimorfik, disebut dengan istilah alel. Proses mutasi terjadi karena adanya subtitusi, delesi atau insersi dari urutan polinukteotida yang membentuk polimorfisme (Yowono T, 2009).
Polimorfisme ini berpengaruh pada fungsi biologis tetapi dalam beberapa kondisi dapat menyebabkan gangguan fungsi biologis, hal ini terjadi karena perubahan susunan dari DNA yang mengkode protein. Polimorfisme ini dapat pula ditemukan pada DNA yang tidak mengkode protein yaitu intron (Yowono T, 2009).
Single nucleutide polymorfisme (SNP) adalah variasi urutan DNA yang terjadi ketika individu berbeda dalam satu spesies terdapat satu nukleotida dalam genom yang berbeda. SNP dapat terjadi di area pengkode gen, area antar gen maupun area yang tidak mengkode gen. SNP didaerah pengaturan atau daerah coding dari gen sitokin menetukan perubahan fungsi dan regulasi transkripsi dari gen ini atau protein yang dikodenya (Yowono T, 2009; Wang et al, 2011).
Hipotesis bahwa inflamasi terlibat dalam etiologi kanker paru juga dapat dibuktikan dengan memeriksa hubungannya dengan polimorfisme pada gren yang berhubungan dengan inflamasi. Pendekatan ini didasarkan pada asumsi bahwa polimorfisme pada gen ini mempengaruhi respon inflamasi, bahwa polimorfisme gen sitokin memodulasi tingkat/level sitokin dalam respon inflamasi (Engels E.A, 2008).
Paru normal menjadi kanker paru memerlukan kerusakan genetik yang multiple. Asap rokok, yang merupakan faktor utama kanker paru, mengadung banyak karsinogen dan memiliki peranan penting dalam memicu pekembangan kanker paru. Inflamasi paru dapat juga berperan sebagai kofaktor asap rokok, baik sebagai inisiator maupun promotor kanker paru. Variasi genetik yang terlibat dalam jalur inflamasi dapat memodulasi kadar sitokin sebagai respon terhadap beerbagai stimulus (Engels E.A, 2008).
26
The Genetic Epidemiology of Lung Cancer Consortium (GELCC) telah memberikan bukti signifikan hubungan kromosom 6q dengan kerentanan kanker paru. Studi lebih lanjut keterlibatan faktor genetik dalam gen manusia dianalisis dalam skala besar telah menemukan mutasi somatik baru SPN dalam terjadinya kanker paru (Bailey et al, 2004).
Perubahan yang terjadi adalah transition basa nuekleotida Pyrin Guanin menjadi basa nukleotida Pyrin Adenin dilokasi -308 (TNFα -308 G/A) pada promotor region '5 dan merupakan kejadian polimorfisme yang akan menyebabkan peningkatan transkripsi (Wang et al, 2011).
Peran polimorfisme gen -308 G/A TNFα terhadap kerentanan terjadinya kanker paru pernah di teliti pada populasi tunisia, Kabaachi et al (2013) menemukan TNF-α 308 genotip GA/AA memiliki odd rasio lebih tinggi dari pada genotipe GG. Untuk single nucleotide polymophisms (SPN) TNFα bahwa pasien dengan alel A mempunyai kerentanan terhadap kanker paru dibandingkan pasien dengan alel G. Namun penelitian ini tidak mendapatkan hubungan polimorfisme -308 G/A TNFα terhadap tingkat keparahan dari kanker paru (Xie et al (2014).
Polimorfisme gen -308 G/A TNFα terlibat dalam tingkat ekspresi gen dan telah dikaitkan dengan berbagai kondisi peradangan dan keganasan. Shih et al (2005) menyatakan pasien yang membawa genotipe homogenus AA atau genotipe heterogenus GA memiliki kecenderungan stadium kanker paru yang lebih buruk dibandingkan genotipe yang lain (p < 0,017). Gen TNFα dapat dilihat pada gambar 2.2:
Gambar 2.2. Gen TNFα(Yowono T, 2009).
2.2.4.Pemeriksaan gen TNF- α dengan tehnik PCR dan RFLP
Polimerasi DNA (replikasi DNA) merupakan suatu proses pengkopian rangkaian molekul bahan genetik (DNA atau RNA) sehingga dihasilnya molekul yang identik. Replikasi DNA hanya dapat dimulai jika tersedia molekul primer, yaitu molekul yang digunakan untuk mengawali proses polimerasi untaian DNA.
Selain itu, polimerasi DNA juga mutlak memerlukan cetakan (template) yang dapat berupa untaian DNA. Fungsi primer menyediakan ujung 3'-OH yang akan digunakan untuk menempelkan Molekul DNA pertama dalam proses polimerasi (Yowono,T. 2009).
Replikasi bahan genetik ditentukan oleh beberapa komponen utama yaitu:
1. DNA cetakan, yaitu molekul DNA atau RNA yang di replikasi.
2. Molekul deoksi ribonukleotida yaitu dATP. dTTP, dCTP dan dGTP
3. Enzim DNA polymerase, yaitu enzim utama yang mengkatalisir proses polymerase nukleotida menjadi untaian DNA.
4. Enzim Primase, yaitu enzim yang mengkatalisis sistesis primer untuk memulai replikasi DNA
5. Enzim pembuka ikatan untaian DNA induk,nyaitu enzim helicase dan enzim gyrase
6. Molekul protein yang menstabilkan untaian DNA yang sudah terbuka 7. Enzim DNA ligase, yaitu enzim yang berfungsi untuk menyambung
Fragmen-fragmen DNA.
PCR merupakan teknik amplifikasi fragment DNA spesifik secara in vitro atau peristiwa replikasi DNA dalam jumlah besar di dalam tabung reaksi. Jumlah siklus PCR adalah 20-30, setiap siklus terjadi amplifikasi kopi 2 kali sehingga bila siklus sama dengan n, maka banyaknya amplifikasi adalah 2n (Fatchiyah et al,2009).
Restriction Fragment length polymorphism (RFLPs) adalah suatu tehnik analisis dengan menggunakan enzim restiksi yang memotong DNA sehingga menghasilkan panjang fragmen yang spesifik. Segmen DNA yang akan dianalisis didigesti dengan enzim restriksi(Yowono,T. 2009).
28
Untuk melihat polimorfisme urutan basa suatu gen dapat digunakan metode RFLPs dimana enzim restriksi akan memotong DNA padaurutan basa spesifik. Dengan metode elektroforesis gel maka hasil PCR dapat didetksi dengan cara pemisahan asam nukleat dan protein menggunakan elektroda. Molekul akan bergerak melauli alur pori yang dipersiapkan. Gerakan dan kecepatan molekul tergantung pada kekuatan listrik, ukuran dan bentuk molekul tersebut(Yowono,T.
2009).
Pengurutan pada region 5' (-595 ke 390) dari gen TNFα. Untuk melihat transisi polimorfisme G menjadi A pada posisi -308. Enzim restriksi Ncol digunakan untuk mengabungkan kedudukan polimorfik. Perubahan basa tunggal pada ujung 3 'dari primer yang diperlukan untuk pengenalan pengurutan Ncol (Kaabachi et al, 2013).
Primer yang digunakan untuk Polimorfisme gen -308 G/A TNFα yaitu.
forward 5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3' dan reverse 5'TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3'. Setelah di amplifikasi, produk PCR akan terpotong oleh enzim digesti Ncol (alel G pada 87bp dan 20bp, alel A pada 107bp) pada suhu 370C selama semalam dan dielektroforesis pada gel agarose 3%
(Kaabachi et al, 2013).