OXIDIZED LDL ELISA (Kit by Mercodia, Swedia)
PREPARASI SAMPEL
Sampel harus dilarutkan pada hari yang sama saat pengukuran dilakukan. Siapkan 2 tabung untuk setiap sampel pasien. Setiap sampel harus dilarutkan dalam 2 tahapan hingga mencapai larutan akhir 1/6561, sebagai berikut :
1. Pembuatan larutan 1/81.
25 μL sampel pasien dimasukkan dalam tabung, ditambahkan 2000 μL sampel buffer kemudian ditutup dan dicampurkan sempurna (invert 3x, vortex).
2. Pembuatan larutan 1/6561.
25 μL larutan 1/81 dimasukkan dalam tabung, ditambahkan 2000 μL sampel buffer, kemudian ditutup dan dicampurkan sempurna (invert 3x, vortex).
PROSEDUR
Semua reagent dan sampel harus berada di suhu ruang sebelum penggunaan. Siapkan kurva standar setiap kali pengukuran.
1. Siapkan enzyme conjugate solution, sampel buffer, wash buffer dan sampel.
2. Siapkan Coated Plate wells yang tersedia untuk calibrators, controls, dan sampel (duplo).
3. Pipet calibratos, controls, dan diluted sampel masing-masing 25 μL kedalam wells.
4. Tambahkan 100μL assay buffer pada setiap wells.
5. Inkubasi plate pada shaker (700-900 rpm) selama 2 jam pada temperatur ruang (18-250C).
6. Cuci sebanyak 6 kali dengan pencuci otomatis atau masukkan setiap sumuran dengan 350 μL wash buffer. Hilangkan cairannya dan ulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, balik dan tepukkan palte pada tisu.
7. Tambahkan 100μL enzyme conjugate solution pada setiap wells.
8. Inkubasi plate pada shaker selama 1 jam pada temperatur ruang (18-25
0C).
9. Cuci kembali sebanyak 6 kali dengan pencuci otomatis atau masukkan setiap sumuran dengan 350 μL wash buffer. Hilangkan cairannya dan ulangi sebanyak 5 kali.
10. Tambahkan 200μL substrate TMB.
11. Inkubasi selama 15 menit pada temperatur ruang (tanpa shaker).
12. Tambahkan 50 μL stop solution, shaker selama 5 detik untuk memastikan pencampuran.
13. Baca absorbansinya pada 450 nm dan analisa. Pembacaan harus dilakukan + 30 menit.
Catatan! Untuk menghindari kontaminasi antara conjugate dan substrate, gunakan pipet yang berbeda.
SKEMA KERJA PENGUKURAN OXIDIZED LDL ELISA (Mercodia Kit)
Calibrators, Controls, Diluted Sample
- Diambil dengan pipet masing-masing sebanyak 25 μL dan dimasukkan kedalam wells yang telah tersedia
- Ditambahkan masing-masing wells dengan 100μL assay buffer
- Diinkubasi dengan dishaker (700-900 rpm) selama 2 jam pada T ruang (18-250C)
- Ditambahkan masing-masing wells dengan 350μL wash buffer, dihilangkan cairannya dan diulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, microplate dibalik dan ditepukkan pada tisu.
- Ditambahkan masing-masing wells dengan 100μL enzyme conjugate solution.
- Diinkubasi dengan dishaker selama 1 jam pada T ruang (18-250C) - Ditambahkan masing-masing wells dengan 350μL wash buffer,
dihilangkan cairannya dan diulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, microplate dibalik dan ditepukkan pada tisu.
- Ditambahkan masing-masing well dengan 200μL substrat TMB
- Diinkubasi selama 15 menit pada T ruang (tanpa dishaker)
- Ditambahkan masing-masing well dengan 50μL stop solution, shaker selama 5 detik untuk memastikan pencampuran.
- Dibaca absorbansinya pada 450 nm (pembacaan harus dilakukan dalam + 30 menit)
- Dianalisa
3
ABSTRACT
DIAH MULYAWATI UTARI. The Effect of Tempeh Intervention on Lipid Profile, Superoxide Dismutase, Ox-LDL and Malondialdehyde in Postmenopausal Women.
Under direction of RIMBAWAN, HADI RIYADI, MUHILAL,
PURWANTYASTUTI.
Menopause is physiological condition in women where the function of ovaries is declining thus causing reduction of estrogen hormone production. The reduction of estrogen production may cause the destruction of lipid metabolism hence worsening the profile of blood lipid and lipid oxidation in the body. If this problem continues, further condition that we should be aware of is coronary heart disease (CHD). Lipid in the body is very prone to oxidation, with the result lipid peroxidation and marked with increase of malondialdehyde (MDA). Lipid, especially the K-LDL is the main target of oxidation that often called as Ox-LDL. Superoxide dismutase (SOD) enzyme is an antioxidant that acts as the primary defense against the process of oxidation in the body. The urgency in understanding about the correlation between consumption of soybean and its product with heart disease in women is due to this disease is the main cause of morbidity and mortality in menopause women. Tempeh is the most popular Indonesian traditional food made of soybean through the fermentation process. The fermentation process causes the increase of amino acid, fatty acid and the total of isoflavon in tempeh is much higher in the soybean. This research is aimed to study the effect of tempeh intervention toward the changes in lipid profile (total cholesterol, K-LDL, K-HDL, TGA), the SOD activity, and MDA in menopause women. The study design is using 2x4 weeks cross-over parallel group, randomized control trial with washout and it has received approval from the Research Ethical Commission, Board of National Health Research and Development, Ministry of Health, Number LB.03.04/KE/6693/2009. The research was conducted in Bogor City, with total sample of 53 menopause women that fulfill the inclusion research criteria. The intervention used 160 gram of Tempeh that has been steamed for 10 minutes then mixed with certain spices and given to the samples daily in 4 weeks. The intervention was done in May-August 2009, while the blood serum analysis done in May-December 2009. The statistical test showed that the consumption of 160 gram of Tempeh daily for 4 weeks can improve the lipid profile by decreasing the total cholesterol for 6%, K-LDL for 5.8%, and TGA for 11.7%, but could not increase the K-HDL level. This intervention also increased the activity of SOD for 56.9%, reducing MDA for 10.4% and maintain Ox-LDL. The amino acid, unsaturated fatty acid and high isoflavon in Tempe is useful to obstruct the synthesis and absorption of cholesterol and LDL oxidation, improve antioxidant status, decrease of body fat and obstruct the uncontrollable free radical formation. It is recommended to government to improve socialization of Tempe as a food that have benefit for health. As for community, it is recommended to increase Tempeh consumption as part of their daily diets, particularly for menopause women and other groups that have high risk of CHD. To obtain the maximum effect on health, it is recommended to consume Tempeh which is cooked by steaming and avoid frying. The amount of Tempeh to be consumed daily is 150-160 gram which is equal to 3-4 middle size portion of Tempeh.
4
RINGKASAN
DIAH MULYAWATI UTARI. Efek Intervensi Tempe terhadap Profil Lipid, Superoksida Dismutase, LDL teroksidasi dan Malondialdehyde pada Wanita
Menopause. Dibimbing oleh RIMBAWAN, HADI RIYADI, MUHILAL,
PURWANTYASTUTI.
Menopause adalah kondisi fisiologis pada wanita dimana terjadi penurunan fungsi ovarium yang mengakibatkan penurunan produksi hormon estrogen. Turunnya produksi estrogen juga menyebabkan gangguan metabolisme lipid sehingga akan memperburuk profil lipid darah dan oksidasi dalam tubuh. Masalah berkelanjutan sehubungan dengan penurunan estrogen yang harus mendapatkan perhatian adalah penyakit jantung koroner (PJK).
Lipid dalam tubuh mudah teroksidasi sehingga mengakibatkan
terbentuknya peroksidasi lipid yang ditandai dengan peningkatan
malondialdehyde (MDA). Lipid khususnya dalam Kolesterol-LDL (K-LDL) merupakan target utama oksidasi sehingga disebut dengan LDL teroksidasi (Ox- LDL). Untuk mencegah terjadinya hal tersebut maka diperlukan adanya antioksidan, salah satunya adalah antioksidan endogen yaitu superoksida dismutase (SOD) yang merupakan pertahanan pertama terhadap proses oksidasi di dalam tubuh.
Adanya kebutuhan untuk memahami hubungan antara konsumsi pangan yang berasal dari kedelai dengan risiko kejadian penyakit jantung pada wanita adalah karena penyakit ini merupakan penyebab utama kesakitan dan kematian pada wanita menopause. Dalam 10-12 tahun terakhir, penelitian tentang manfaat protein kedelai dan isoflavon semakin meningkat dan mendalam, dan membuktikan bahwa konsumsi kedelai tidak saja memperbaiki beberapa aspek kesehatan pada wanita menopause tetapi juga memperbaiki kesehatan jantung.
Tempe merupakan pangan tradisional Indonesia yang dibuat dari kedelai melalui proses fermentasi dengan penambahan Rhizopus oligosporus dan dikenal
sebagai makanan yang sangat popular di Indonesia. Proses fermentasi menyebabkan peningkatan asam amino, asam lemak dan isoflavon total tempe sehingga jauh lebih tinggi dibanding kedelai.
Beberapa penelitian tentang intervensi tempe telah dilakukan di Indonesia, namun sejauh ini belum diketahui pengaruh tempe terhadap profil lipid, SOD, Ox-LDL dan MDA pada wanita menopause yang merupakan kelompok risiko PJK. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari efek intervensi tempe terhadap perubahan profil lipid (kolesterol total, K-LDL, K-HDL, TGA), aktivitas SOD, Ox-LDL dan MDA pada wanita menopause. Desain penelitian yang digunakan adalah 2x4 minggu cross-over parallel group, randomized control trial dengan washout dan telah mendapatkan persetujuan dari Komisi Etik Penelitian
Kesehatan Badan Litbang Kesehatan RI Nomor LB.03.04/KE/6693/2009.
Penelitian dilaksanakan di Kota Bogor, dengan jumlah total sampel 53 wanita menopause yang memenuhi kriteria inklusi penelitian. Intervensi yang dilakukan adalah memberikan 160 gram tempe setiap hari selama 4 minggu. Jumlah tersebut setara dengan 4 (empat) potong tempe ukuran sedang Tempe yang diberikan kepada sampel adalah tempe yang dikukus selama 10 menit kemudian dicampur dengan bumbu tertentu sehingga menjadi masakan tempe
5
yang siap santap. Terdapat berbagai variasi menu tempe yang diberikan bergantian selama penelitian. Intervensi dilakukan pada bulan Mei – Agustus 2009, sedangkan analisis serum darah dilakukan pada bulan Mei – Desember 2009.
Data yang dikumpulkan adalah data primer meliputi: karakteristik sampel (umur, lama menopause, suku), sosial ekonomi (pendidikan, pekerjaan, pengeluaran), aktifitas fisik, kebiasaan merokok, dan olah raga. Data dikumpulkan melalui wawancara pada awal penelitian. Data kesehatan dan IMT dikumpulkan setiap saat pengambilan darah, sedangkan data konsumsi dikumpulkan dengan metodefood record yang diambil sebanyak 1 (satu) kali per
minggu dan FFQ diambil sebanyak 1 (satu) kali per bulan.
Analisis pangan tempe menunjukkan bahwa kandungan asam amino tertinggi pada tempe adalah arginin dan asam lemak tertinggi adalah asam linoleat. Tempe juga kaya akan isoflavon dan kadarnya relatif dapat dipertahankan jika tempe diolah dengan pengukusan.
Hasil uji statistik menunjukkan bahwa pemberian tempe sebanyak 160 gram setiap hari selama 4 minggu dapat memperbaiki profil lipid yaitu menurunkan kadar kolesterol total sebesar 6%, K-LDL sebesar 5.8% dan TGA sebesar 11.7%, namun tidak dapat meningkatkan kadar K-HDL. Intervensi tempe juga dapat meningkatkan aktivitas SOD sebesar 56.9%, menurunkan MDA sebesar 10.4% dan mempertahankan Ox-LDL. Kandungan asam amino dan asam lemak tidak jenuh serta isoflavon yang tinggi pada tempe diperkirakan mempunyai manfaat sebagai penghambat sintesa kolesterol, penghambat absorbsi kolesterol, penghambat oksidasi LDL serta meningkatkan status antioksidan, sehingga dapat menurunkan lemak tubuh dan menghambat proses oksidasi dan pembentukan radikal bebas yang berlebihan dalam tubuh.
Disarankan pada pemerintah untuk meningkatkan sosialisasi tempe sebagai makanan yang mempunyai manfaat bagi kesehatan. Masyarakat disarankan untuk meningkatkan konsumsi tempe setiap hari secara terus menerus khususnya pada wanita menopause serta kelompok lain yang memiliki risiko tinggi PJK. Untuk mendapatkan efek maksimal bagi kesehatan maka tempe sebaiknya diolah dengan cara dikukus dan menghindari pengolahan dengan cara menggoreng. Jumlah tempe yang dikonsumsi setiap hari sekitar 150-160 gram atau setara dengan 3-4 potong tempe ukuran sedang.