BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Produksi Enzim Eksoprotease A hydrophila Secara Kualitatif
hydrophila ke dalam lingkungannya. Enzim eksoprotease ini merupakan faktor virulensi utama pada bakteri patogen sehingga perlu diturunkan produksinya. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila dikontrol oleh suatu sistem komunikasi bakteri yang disebut sistem quorum sensing, dengan molekul sinyal
y = 2,947x + 5,7774 R2 = 0,8493 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 OD lo g J u m la h B ak te ri/m l
adalah C4-HSL. Untuk menurunkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila
dapat dilakukan dengan cara menghambat sistem quorum sensingnya.
Dalam penelitian ini, senyawa yang diduga mampu menghambat sistem
quorum sensing A. hydrophila adalah senyawa furanon dalam buah tomat. Senyawa furanon mempunyai struktur mirip dengan molekul sinyal C4-HSL sehingga berperan sebagai C4-HSL analog dan mampu mengganggu quorum sensing. Untuk mendapatkan senyawa yang terkandung dalam buah tomat, maka dalam penelitian ini dilakukan ekstraksi bertingkat buah tomat menggunakan pelarut non polar, semi polar, dan polar yaitu : n heksan, etil asetat, dan metanol.
Uji kualitatif produksi enzim A. hydrophila dilakukan dengan metode titik (spot plate) pada media Luria Bertani (LB) Agar yang ditambah 2% susu skim dan pada perlakuan ditambah dengan ekstrak buah tomat dengan berbagai variasi konsentrasi. Inokulum yang digunakan adalah inokulum A. hydrophila yang telah mencapai kepadatan 107 dari hasil pembuatan kurva standar A. hydrophila
(Gambar 7). Media Luria Bertani digunakan dalam uji kualitatif produksi enzim eksoprotease karena Luria Bertani ini mengandung tripton (asam amino triptofan) sehingga bisa memacu aktivitas enzim proteolitik. Penambahan susu skim dimaksudkan untuk menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease melalui terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri A.hydrophila. Zona bening ini menunjukkan adanya aktivitas enzim eksoprotease yang menghidrolisis ikatan peptida protein susu skim menjadi asam amino (Poernomo dan Purwanto, 2005). Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila secara kualitatif dapat
diketahui dengan tidak adanya zona bening atau terjadinya pengurangan luas zona bening di sekitar koloni A. hydrophila.
Apabila produksi enzim eksoprotease secara kualitatif terhambat oleh salah satu jenis ekstrak tanpa menghambat pertumbuhan bakteri, maka akan dilanjutkan dengan uji kuantitatif produksi enzim eksoprotease untuk mengetahui persentase penurunan produksi enzim eksoprotease.
1). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak n heksan Buah Tomat (L. esculentum Mill.)
n heksan merupakan pelarut non polar yang akan melarutkan senyawa non polar dalam buah tomat. Kandungan non polar dalam buah tomat antara lain adalah likopen yang termasuk golongan karotenoid (Sauriasari, 2006). Ekstrak n heksan buah tomat ditambahkan pada media Luria Bertani Agar dengan variasi konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%. Pada semua konsentrasi masih terdapat produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Hal ini ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni A. hydrophila yang menunjukkan adanya aktivitas enzim eksoprotease menghidrolisis ikatan peptida susu skim. Berkurangnya zona bening diikuti pula oleh pengurangan koloni bakteri yang tumbuh (Gambar 8a,b,c,d,e).
Gambar 8. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak n heksan buah tomat (L. esculentum Mill.)
Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening. (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila)
a. Kontrol (media LB Agar)
b. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat2% c. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak n heksan buah tomat 8%
a c d e b 2 1 1 2 1 2 2 1 2 1
Bakteri tetap tumbuh yangditunjukkan dengan diameter koloni A. hydrophila
yang cukup besar dan mampu memproduksi enzim eksoprotease terbukti dengan terukurnya luas zona bening di sekitar koloni A. hydrophila. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening setelah perlakuan dengan ekstrak n heksan buah tomat dapat diikuti pada Tabel 2.
Tabel 2. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak n heksan tomat(L. esculentum Mill.)
Konsentrasi Rata-rata diameter koloni (cm)
Rata-rata luas zona bening (cm2) Kontrol (0%) 0,467 0,429 2% 0,380 0,110 4% 0,425 0,149 6% 0,316 0,081 8% 0,250 0,077
Pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila mengalami penurunan, namun penurunan produksi enzim eksoprotease dan pertumbuhannya relatif kecil. Hal ini diduga karena senyawa-senyawa aktif non polar yang terkandung dalam ekstrak buah tomat tidak mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila. Ekstrak yang bersifat non polar menyebabkan ekstrak tersebut kurang larut dalam media LB agar yang mempunyai pelarut air yang bersifat polar. Dalam ekstrak n heksan buah tomat ini diduga senyawa furanon tidak terekstrak sehingga tidak mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila sehingga perlakuan ekstrak n heksan buah tomat ini tidak dilanjutkan
pada pengukuran pertumbuhan bakteri dan pengujian kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila.
2). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Etil Asetat Buah Tomat(L. esculentum Mill.)
Etil asetat merupakan pelarut semi polar yang akan melarutkan senyawa non polar dalam buah tomat. Ekstrak etil asetat buah tomat ditambahkan pada media Luria Bertani Agar dengan variasi konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%. Produksi enzim eksoprotease setelah penambahan ekstrak etil asetat buah tomat ini mengalami penghambatan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak yang diberikan. Hal ini dapat terlihat dari terbentuknya zona bening yang ada di sekitar koloni bakteri. Demikian pula dengan pertumbuhan bakterinya, semakin tinggi konsentrasi ekstrak, pertumbuhan A. hydrophila semakin terhambat. Adapun produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah penambahan ekstrak etil asetat buah tomat dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat (L. esculentum Mill.)
Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila)
a. Kontrol (pada media LB Agar)
b. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak etil asetat buah tomat 8%
a c d e b 1 2 1 2 1 1 1
Berdasarkan Gambar 9b, dilihat dari koloni bakteri yang tumbuh dan zona bening yang ada dapat dikatakan bahwa pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease pada konsentrasi 2% relatif sama dengan pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease pada kontrol A. hydrophila. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi tersebut belum mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila. Pada konsentrasi 4% (Gambar 9c) menunjukkan penghambatan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila yang ditunjukkan dengan tidak adanya zona bening di sekitar koloni A. hydrophila, walaupun hanya terjadi sedikit penurunan pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Sedangkan pada konsentrasi 6% (Gambar 9d) dan 8% (Gambar 9e) tidak memperlihatkan adanya zona bening di sekitar koloni A. hydrophila yang menunjukkan tidak terdapatnya produksi enzim eksoprotease.
Adanya penghambatan pertumbuhan dan produksi enzim eksoprotease secara rinci dapat diketahui dari hasil pengukuran diameter koloni dan luas zona bening yang dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak etil asetat buah Tomat (L. esculentum Mill.)
Konsentrasi Rata-rata diameter koloni (cm)
Rata-rata luas zona bening (cm2) Kontrol (0%) 0,467 0,429 2% 0,483 0,322 4% 0,320 - 6% 0,233 - 8% 0,225 -
Keterangan : tanda (-) menunjukkan tidak adanya zona bening di sekitar koloni bakteri
Pada Tabel 3 terlihat bahwa pada kontrol dan perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 2%, diameter koloni cukup besar yaitu 0,467 dan 0,483 dengan diameter zona bening yang cukup besar pula. Lain halnya pada konsentrasi 4%, meskipun diameter koloninya relatif besar ternyata tidak terdapat zona bening di sekitar koloni bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% mampu menghambat produksi enzim eksoprotease
A. hydrophila. Terhambatnya produksi enzim eksoprotease pada pemberian ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% ini diduga disebabkan oleh kandungan semi polar buah tomat mampu menghambat quorum sensing A. hydrophila.
Semakin besar konsentrasi ekstrak, semakin kecil diameter bakteri yang terbentuk. Hal ini terlihat pada konsentrasi ekstrak 6% dan 8% yang mempunyai diameter relatif kecil. Diameter koloni yang kecil ini menunjukkan adanya penghambatan pertumbuhan A. hydrophila. Dengan demikian terjadinya penurunan produksi enzim eksoprotease disebabkan oleh adanya penghambatan pertumbuhan A. hydrophila. Senyawa semi polar buah tomat diduga bersifat sebagai antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan A. hydrophila sehingga menghambat produksi enzim eksoprotease A. hydrophila. Pada perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat ini, yang dilanjutkan pada uji pertumbuhan bakteri A. hydrophila
3). Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Metanol Buah Tomat (L. esculentum Mill.)
Metanol merupakan pelarut polar, sehingga mampu melarutkan senyawa furanon dalam tomat. Ekstrak metanol buah tomat diduga mengandung senyawa furanon yang mempunyai aktivitas sebagai penghambat sistem quorum sensing
(quorum sensing inhibitor) sehingga mampu menghambat produksi enzim eksoprotease yang merupakan faktor virulensi A. hydrophila.
Ekstrak metanol buah tomat ditambahkan pada media Luria Bertani Agar dengan variasi konsentrasi 0%; 2%; 4%; 6% dan 8%. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat ini juga menunjukkan adanya penurunan. Semakin besar konsentrasi ekstrak yang ditambahkan, semakin kecil produksi enzim eksoproteasenya. Adapun produksi enzim eksoprotease A. hydrophila setelah penambahan ekstrak metanol buah tomat dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10. Produksi enzim eksoprotease A. hydrophila pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)
Keterangan : 1. koloni bakteri. 2. zona bening (Zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila)
a. Kontrol (media LB Agar)
b. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 2% c. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 4% d. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 6% e. LB Agar ditambah ekstrak metanol buah tomat 8%
a c d e b 1 1 1 1 1 2 2 2
Pada Gambar 10a tampak bahwa pada kontrol terjadi produksi enzim eksoprotease yang cukup besar yang terlihat dari zona bening yang ada di sekitar koloni A. hydrophila. Pada konsentrasi 2% (Gambar 10b) masih menunjukkan adanya produksi enzim eksoprotease terlihat dengan adanya zona bening di sekitar koloni A. hydrophila. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi tersebut belum mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila. Pada konsentrasi ekstrak 4% (Gambar 10c) memang masih menunjukkan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila, namun hanya kecil sekali apabila dibandingkan dengan kontrol. Pada konsentrasi ini tidak tampak adanya penghambatan pertumbuhan bakteri. Sedangkan pada konsentrasi 6% (Gambar 10d) dan 8% (Gambar 10e) tidak terlihat adanya zona bening di sekitar koloni bakteri yang menunjukkan tidak terjadi produksi enzim eksoprotease. Koloni bakteri yang tumbuh relatif kecil yang menunjukkan terjadinya penghambatan pertumbuhan A. hydrophila.
Berdasarkan hasil pengukuran diameter koloni bakteri dan luas zona bening yang tersaji pada Tabel 4, dapat dilihat bahwa pada konsentrasi 4%, produksi enzim eksoproteasenya memang relatif kecil yaitu sebesar 0,048 cm2 apabila dibandingkan dengan kontrol yang mempunyai luas zona bening 0,429 cm2. Adanya penurunan produksi enzim eksoprotease ini tidak disertai penghambatan pertumbuhan, terlihat dari dimeter zona bening yang relatif besar. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi ini mampu menghambat sistem quorum sensing A. hydrophila.
Tabel 4. Diameter koloni A. hydrophila dan luas zona bening pada perlakuan dengan ekstrak metanol buah tomat (L. esculentum Mill.)
Konsentrasi Rata-rata diameter koloni (cm)
Rata-rata luas zona bening (cm2) Kontrol (0%) 0,467 0,429 2% 0,367 0,264 4% 0,308 0,048 6% 0,236 - 8% 0,216 -
Keterangan : tanda (-) menunjukkan tidak adanya zona bening di sekitar koloni bakteri
Pada Tabel 4 juga menunjukkan bahwa pada konsentrasi 6% dan 8% tidak menunjukan adanya produksi enzim eksoprotease A. hydrophila, namun disertai penghambatan pertumbuhan A. hydrophila terlihat dari diameter koloni A. hydrophila yang kecil, sehingga terjadinya penghambatan produksi enzim diduga disebakan oleh terhambatnya pertumbuhan bakteri A. hydrophila.
Penurunan produksi enzim eksoprotease A. hydrophila ini disebabkan oleh adanya penghambatan sistem quorum sensing A. hydrophila. Berdasarkan penelitian Swift et al. (1999) penghambatan quorum sensing dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa analog C4-HSL pada kultur A. hydrophila.
Penghambatan quorum sensing dapat dilakukan oleh senyawa yang mirip dengan molekul sinyal sebagai quorum sensing inhibitors (QSI). Pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat ini, senyawa yang diduga mampu menghambat sistem
quorum sensing A. hydrophila sehingga mampu menghambat produksi enzim eksoprotease A. hydrophila adalah senyawa furanon dalam ekstrak buah tomat.
Dalam buah tomat ini, furanon terdapat dalam bentuk furaneol (2,5 dimetil, 4- hidroksi-3(2H)-furanon) (Buttery et al., 2001). Berdasarkan penelitian Rasmussen
et al. (2000), halogen furanon yang merupakan metabolit sekunder dari makroalga laut Delisea pulchra mampu menghambat molekul sinyal N-Butanoyl-L– Homoserine Lactone pada Serratia liquefaciens sehingga menghambat motilitas
Serratia liquefaciens.
Senyawa yang bertindak sebagai QSI mampu menghambat quorum sensing
dalam konsentrasi yang relatif kecil (Hentzer and Givskov, 1999). Apabila diberikan dalam konsentrasi yang lebih besar, senyawa QSI akan bersifat sebagai antibakteri yang menghambat pertumbuhan bakteri (Rasch et al., 2004). Dalam penelitian ini terbukti bahwa pada konsentrasi 4%, senyawa dalam ekstrak metanol buah tomat mampu menurunkan produksi enzim eksoprotease tanpa menghambat pertumbuhan A. hydrophila. Pada saat ekstrak metanol buah tomat diberikan pada konsentrasi lebih besar yaitu 6% dan 8% terjadi penghambatan produksi enzim eksoprotease, namun disertai penghambatan pertumbuhan A. hydrophila, sehingga berdasarkan prinsip quorum sensing inhibitors (QSI) yang mampu menghambat faktor virulensi bakteri (dalam penelitian ini adalah produksi enzim eksoprotease A. hydrophila) tanpa menghambat pertumbuhan bakteri itu sendiri maka yang dilanjutkan ke tahap pengujian produksi enzim eksoprotease A. hydrophila secara kuantitatif adalah ekstrak metanol buah tomat dengan konsentrasi 4%. Penelitian ini terfokus pada senyawa QSI bukan pada antibakteri karena pada umumnya senyawa antibakteri mempunyai dampak negatif yaitu
munculnya resistensi bakteri dan timbulnya strain bakteri yang baru sehingga penggunaan senyawa antibakteri menjadi kurang efektif.
C.Pertumbuhan A. hydrophila Pada Perlakuan Ekstrak Buah Tomat (L. esculentum Mill.)
Pertumbuhan bakteri A. hydrophila setelah pemberian ekstrak buah tomat diketahui dengan membuat kurva pertumbuhan. Pengukuran pertumbuhan digunakan untuk mengetahui bahwa penghambatan produksi enzim eksoprotease
A. hydrophila tidak disebabkan oleh terhambatnya pertumbuhan A. hydrophila,
namun disebabkan oleh terhambatnya sistem quorum sensing yang mengontrol sintesis enzim eksoprotease tersebut. Pengukuran pertumbuhan A. hydrophila
hanya dilakukan pada perlakuan yang menunjukkan penurunan produksi enzim eksoprotease secara kualitatif tanpa terhambat pertumbuhannya yaitu pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan ekstrak etil asetat tomat sebesar 4%.
Gambar 11 menunjukkan pertumbuhan A. hydrophila setelah perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4%. Selain itu, dilakukan pula pengukuran pertumbuhan A. hydrophila dengan penambahan pelarut etil asetat dan metanol dalam media LB cair untuk mengetahui pengaruh pelarut yang digunakan untuk mengekstrak buah tomat terhadap pertumbuhan A. hydrophila. Secara umum kurva pertumbuhan menunjukkan pertumbuhan bakteri yang terdiri dari fase lag, fase eksponensial, dan fase stasioner.
Gambar 11. Kurva pertumbuhan A. hydrophila
Keterangan : A : Kontrol negatif (media LB broth)
B : Kontrol positif (media LB broth + pelarut etil asetat 4%) C : Kontrol positif (media LB broth + pelarut metanol 4%) D : Media LB broth + ekstrak etil asetat buah tomat 4% E : Media LB broth + ekstrak metanol buah tomat 4%
Berdasarkan Gambar 11, fase lag tidak begitu kelihatan. Hal ini diduga disebabkan bakteri sudah mampu beradaptasi dengan media cair yang digunakan. Pada fase lag, sel bakteri mengalami perubahan dalam komposisi kimiawi dan bertambah ukurannya, namun belum ada penambahan populasi bakteri (Pelzar and Chan, 1992). Pada fase eksponensial terjadi penambahan massa sel dengan cepat (Pelzar and Chan, 1992). Fase eksponensial A. hydrophila pada penelitian ini berlangsung pada jam ke-0 sampai jam ke-10. Pada fase stasioner, terjadi penumpukan produk beracun dan terjadi kekurangan nutrien sehingga beberapa sel mati sedangkan yang lain tetap tumbuh sehingga jumlah sel hidup menjadi
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Waktu pengukuran (jam)
n ila i O D A B C D E
tetap (Pelzar and Chan, 1992). Pada penelitian ini fase stasioner berlangsung pada jam ke-12 sampai jam ke-24.
Pada perlakuan ekstrak metanol buah tomat sebesar 4% dan kontrol positif yang ditambah pelarut metanol, pertumbuhan A. hydrophila berlangsung dengan normal, tidak terjadi penghambatan pertumbuhan A. hydrophila, terlihat dengan nilai Optical density (OD) yang relatif sama dengan kontrol. Sedangkan pada kontrol yang ditambah pelarut etil asetat, menunjukkan penghambatan pertumbuhan A. hydrophila. Etil asetat mengandung asam asetat. Asam mampu menyebabkan denaturasi protein sel bakteri, sehingga terjadi koagulasi protein sel bakteri dan akhirnya bakteri mati kemudian sel bakteri menjadi menggumpal dan cenderung turun ke bawah dasar erlenmeyer saat pengukuran pertumbuhan A. hydrophila. Pada perlakuan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4% terjadi penghambatan pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Hal ini dimungkinkan akibat adanya kandungan senyawa semi polar dalam tomat yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Sehubungan dengan terhambatnya pertumbuhan A. hydrophila setelah penambahan ekstrak etil asetat buah tomat sebesar 4%, maka perlakuan ini tidak dilanjutkan pada tahap uji kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease A. hydrophila.
D. Penurunan Produksi Enzim Eksoprotease A. hydrophila Secara