Prosedur Analisis

3. METODOLOGI

3.4. Prosedur Analisis

3.4.1 Penghitungan jumlah sel

Perhitungan jumlah sel dilakukan dengan metode hitungan langsung sebagai berikut (Hadioetomo 1993) :

a. Permukaan hitung hemasitometer dan kaca penutup dibersihkan dari sisa-sisa minyak.

b. Tutup kaca hemasitometer diletakkan pada permukaan hemasitometer. Suspensi biakan C. gracilis hasil pengambilan contoh dikocok, kemudian diambil dengan mikropipet sebanyak 20 µl. Suspensi tersebut diteteskan pada tempat menaruh sampel yang terdapat pada hemasitometer hingga suspensi C. gracilis menyebar pada ruang hitung.

c. Hemasitometer ditaruh di atas pentas mikroskop. Jumlah sel yang terdapat dalam 80 kotak kecil yang terletak dalam kotak bagian tengah yang berukuran 0,2 mm2 (5 x 16 x 0,0025mm2) dihitung dengan mikroskop pada pembesaran 40X. Perhitungan jumlah sel dilakukan sebanyak 2 kali ulangan.

d. Formulasi yang dipakai dalam menghitung kepadatan sel adalah sebagai berikut:

(

1 2

)

4 10 . 5 2 × ∑ + ∑ = N N N

Keterangan: N = kepadatan sel (sel/ml)

22

ΣN2 = jumlah sel dalam 80 kotak kecil (ulangan ke-2)

5.104 = konstanta haemacytometer neubauer untuk pengamatan

pada 80 kotak kecil

e. Hasil perhitungan diplotkan pada grafik hingga diperoleh kurva pertumbuhan dengan umur kultur (hari) sebagai sumbu x dan log kepadatan sel (sel/ml)

sebagai sumbu y.

3.4.2. Penghitungan konstanta laju pertumbuhan

Konstanta laju pertumbuhan suatu mikroalga adalah suatu ukuran

pertambahan biomassa dalam rentang waktu tertentu dan ditentukan dari fase eksponensial. Besarnya konstanta laju pertumbuhan menggambarkan tingkat

kesuksesan relatif suatu mikroalga dalam beradaptasi terhadap lingkungan alaminya atau media kultur buatan. Lamanya fase eksponensial dalam suatu kultur tergantung pada ukuran inokulum, konstanta laju pertumbuhan, dan kemampuan media serta kondisi kultur dalam mendukung pertumbuhan alga. Rumus laju pertumbuhan mikroalga adalah sebagai berikut (Prescott et al. 2002) :

k = ln (xt/xo)

ln2 x t Keterangan :

k = konstanta laju tumbuh mikroalga (pembelahan sel/hari) xt = kepadatan sel pada hari t (sel/ml)

xo = kepadatan awal hari (sel/ml)

t = waktu (hari)

3.4.3. Uji aktivitas senyawa antibakteri (metode difusi agar)

Sebelum melakukan pengujian aktivitas senyawa antibakteri, terlebih dahulu dilakukan beberapa persiapan, yaitu pembuatan media tumbuh bakteri. Media tumbuh yang digunakan untuk mengkultur bakteri yaitu NB (Nutrient Broth), Mueller-Hinton Agar (MHA) dan media TSA (Tryptone Soya Agar). Media TSA digunakan untuk menyimpan stok bakteri dalam bentuk agar miring. NB digunakan untuk mengkultur bakteri sebelum dilakukan pengujian, sedangkan medium Mueller-Hinton Agar digunakan untuk menumbuhkan bakteri yang dicobakan pada pengujian senyawa antibakteri.

23

Penyegaran bakteri dilakukan sehari sebelum pengujian senyawa

antibakteri, yaitu dengan cara memasukan 1 lup biakan bakteri dari stok agar miring ke dalam 9 ml medium NB steril. Setelah itu inokulum diinkubasi

dalam inkubator selama 18 jam pada suhu 37 oC untuk bakteri S. aureus dan suhu ruang untuk bakteri V. harveyi.

Sebelum dilakukan pengujian antibakteri, terlebih dahulu diukur OD (Optical Density) menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm. Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas senyawa antibakteri dari ekstrak kasar intraseluler C. gracilis yang sudah didapatkan. Tahapan pengujian aktivitas antibakteri ( Bell, 1984) adalah sebagai berikut:

1) Biakan bakteri pada media NB dipipet sebanyak 20 µl dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 15 ml Mueller-Hinton Agar (MHA) cair steril. Medium MHA yang telah mengandung bakteri selanjutnya dihomogenkan menggunakan vortex dan dituang ke dalam cawan petri kemudian dibiarkan sampai padat pada suhu kamar.

2) Masing-masing ekstrak senyawa antibakteri C. gracilis dan kloramfenikol (kontrol positif) sebesar 0,015 g dilarutkan ke dalam metanol sebanyak 0,5 ml. Kemudian sebanyak 10 µl ekstrak diteteskan pada paper disc steril (konsentrasi 300 µg/disc) dan didiamkan beberapa saat hingga menjadi agak kering.

3) Paper disc yang sudah kering diletakkan secara teratur di atas medium agar yang telah membeku. Pada permukaan cawan diberi label untuk masing- masing jenis perlakuan.

4) Cawan petri yang berisi kultur bakteri dan ekstrak senyawa antibakteri dimasukkan dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 18 jam pada suhu 30 oC untuk bakteri V. harveyi dan suhu 37 oC untuk bakteri S. aureus.

Suatu zat aktif dikatakan memiliki potensi yang tinggi sebagai antibakteri, jika pada konsentrasi rendah mempunyai daya hambat yang besar. Ketentuan kekuatan antibakteri sebagai berikut: daerah hambatan 20 mm atau lebih berarti sangat kuat, daerah hambatan 10-20 mm (kuat), daerah hambatan 5-10 mm (sedang), daerah hambatan 5 mm atau kurang (lemah) (Davis dan Stout diacu dalam Rachdiati 2003).

24

Secara umum, konsentrasi standar yang digunakan oleh NCI (National Cancer Institute) USA, ekstrak kasar dikatakan aktif jika dapat menghambat pertumbuhan bakteri pada konsentrasi 20 µg/ml sedangkan ekstrak murni sebesar 4 µg/ml (Jamaludin 2005). Perhitungan ekstrak pada uji aktivitas senyawa antibakteri dapat dilihat pada Lampiran 4.

3.4.4. Uji aktivitas senyawa antibakteri (teknik tabung pengenceran)

Uji aktivitas senyawa antibakteri ini merupakan modifiksi dari cara penentuan MIC (Minimum Inhibtory Concentration) dengan teknik tabung pengenceran (Lennete et al. 1974). Sama seperti metode difusi agar, sebelum dilakukan pengujian antibakteri pertama-tama diukur OD (Optical Density) menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm. Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas senyawa antibakteri dari ekstrak kasar intraseluler C. gracilis. Tahapan pengujian aktivitas antibakteri adalah sebagai berikut:

1) Biakan bakteri pada media NB dipipet sebanyak 20 µl dan dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi yang berisi 15 ml Mueller-Hinton Broth steril. Medium MHB yang telah mengandung bakteri selanjutnya dihomogenkan menggunakan vortex

2) Masing-masing ekstrak dan kloramfenikol sebesar 0,015 g dilarutkan ke dalam pelarutnya sebanyak 1 ml. Kemudian sebanyak 20 µl ekstrak maupun kloramfenikol (konsentrasi 20 µg/ml) dimasukkan ke dalam 4 tabung reaksi di atas, dan 1 tabung reaksi tidak ditambah senyawa antimikroba yang berfungsi sebagai kontrol negatif. Selanjutnya kultur bakteri yang berada dalam tabung reaksi tersebut diukur OD-nya dengan panjang gelombang 600 mm. Hasil pengukuran ini selanjutnya disebut OD awal.

3) Kultur bakteri yang telah diukur OD-nya, dimasukkan ke dalam inkubator selama 12 jam pada suhu 30oC untuk bakteri V. harveyi dan suhu 37oC untuk bakteri S. aureus.

4) Setelah 12 jam, kultur-kultur bakteri tersebut diukur kembali OD-nya dan selanjutnya hasil pengukuran OD ini disebut OD akhir

Perbandingan nilai selisih OD (awal dan akhir) dari kultur kontrol positif dan kultur dengan senyawa ekstrak akan dibandingkan dengan nilai selisih OD

25

kontrol negatif untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari kontrol positif dan senyawa ekstrak. Perhitungan ekstrak pada uji aktivitas senayawa antibakteri dapat dilihat pada Lampiran 4.

3.4.5. Penghitungan aktivitas reduksi OD senyawa antibakteri

Besarnya aktivitas suatu senyawa antibakteri dapat dilihat dari kemampuan senyawa tersebut untuk mereduksi nilai OD (Optical Density) kultur bakteri yang diinkubasi tanpa penambahan senyawa antibakteri (kontrol negatif).

Rumus untuk menghitung besarnya kemampuan mereduksi OD dari suatu senyawa antibakteri adalah sebagai berikut.

% reduksi = (rata-rata OD kontrol ) – (rata-rata OD Perlakuan) X 100 % rata-rata OD kontrol

Keterangan : rata-rata OD kontrol = rata - rata OD kultur tanpa penambahan senyawa antibakteri

rata-rata OD perlakuan = rata-rata OD kultur dengan penambahan senyawa antibakteri